ניקוב-Induced כורוידאלית איריס כמודל העכבר של Rubeosis Iridis

Summary

איריס כורוידאלית, סיבוך נפוץ של מחלת רשתית איסכמי, עלול להוביל סכנת הראייה neovascular גלאוקומה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מאתר להשראת כורוידאלית איריס ניסיוני העשויות לשמש להערכה לא פולשנית של חומרים להתכוונן אנגיוגנזה.

Abstract

נתאר מודל של איריס פנצ'רים-induced כורוידאלית כמודל כללי להערכה לא פולשנית של אנגיוגנזה. המודל הוא גם רלוונטי עבור מיקוד neovascular גלאוקומה, סיבוך סכנת הראייה של רטינופתיה סוכרתית. שיטה זו מבוססת על אינדוקציה של איריס תגובת כלי הדם על ידי סדרה של דקירות uveal עצמית איטום על עכברים BALB/c, מנצל ההבשלה לאחר לידה של עכבר עינית להערכת. הגורים העכבר לעבור דקירות uveal מיום כמחנכת 12.5, כאשר הגורים באופן טבעי לפקוח את עיניהם, עד ליום כמחנכת 24.5. בשל שקיפות הקרנית, איריס להערכת ניתן לנתח בקלות בזמן על ידי שיטות לא פולשנית ויוו . יתר על כן, הקשתית שקוף למחצה של עכברים BALB/c ניתן flatmounted לניתוח נתונים היסטוריים immunohistologic עם רקע שאינם ספציפיים מכתים. במודל זה, אנגיוגנזה הוא מונע בעיקר על ידי דלקתיות, הפעלת מערכות plasminogen. המודל הנוצרות על-ידי ניקוב הוא הראשון כדי לגרום כורוידאלית איריס, מכרסמים קטנים, ויש לו יתרון המאפשר ישירה לא פולשנית ויוו ניתוח של תהליך אנגיוגנזה. יתר על כן, המודל יכול להיות משולב עם חומרים להתכוונן האנגיוגנזה, אשר מדגיש את הפוטנציאל במחקר של אנגיוגנזה בפרספקטיבה ויוו .

Introduction

איריס, יחד עם גוף ריסי, דמית, כוללת את uvea, המהווה הרקמה vascularized ביותר של העין. איריס להערכת חיוני בשמירה על הומאוסטזיס בתא הקדמי של העין. כתוצאה שופע קשרים anastomotic בין העורקים והוורידים, כלי דם איריס לספק חומרים מזינים אספקת החמצן לא רק את הקשתית עצמה, אלא על כל קטע הקדמי של העין¹.

היווצרות של כלי דם חדשים, או אנגיוגנזה מכל אלה קיימים, היא מהותית תהליכים פיזיולוגיים, כגון פיתוח ו-²ריפוי הפצע. אנגיוגנזה דק מוסדר על ידי מספר רב של גורמים הקנוני, כגון כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF) והמעכב activator plasminogen (PAI), וכן מספר גורמים דלקתיים, והוא חוסר איזון של גורמים אלה יכול להוביל ל פיפטות אנגיוגנזה³.

בעיניים, כורוידאלית הוא הגורם למחלות מסכנות הראייה, כמו רטינופתיה סוכרתית המקדימות (PDR) ו neovascular גלאוקומה (NVG). אלה מחלות עינית, מוקד כורוידאלית בדרך כלל ממוקם רקמות ברשתית, ובכל זאת חוסר איזון של דלקתיות, גורמי אנגיוגנזה בנבכי בשני האחורי ו הקדמי עינית העין שויכה rubeosis iridis, מונח רפואי עבור איריס פתולוגיים neoangiogenesis⁴. פתולוגיות אלה מציינים את היכולת של הקשתית הבוגרים לעבור אנגיוגנזה. בעכברים, להערכת עינית לא בוגר לאחר הלידה וממשיך לאחר לידה התבגרות. זה ייחודו של הפיתוח הוא מנוצל במודל עכבר של חמצן-induced רטינופתיה, מודל זה מקרוב מחקה את המצב הקליני של רטינופתיה prematurity⁵. בנוסף, אנגיוגנזה ודלקת לשחק תפקיד מרכזי מנגנונים⁶ריפוי הפצע, פצע מרפא את עצמו שויכה אנגיוגנזה מודלים⁷.

במחקר זה, נתאר מודל של איריס פנצ'רים-induced כורוידאלית. דקירות uveal מבוצעות ליד הגבול של לימבוס, אשר זירוז איריס כורוידאלית על ידי מפעילה מערכת ריפוי הפצע. בשל שקיפות הקרנית, איריס להערכת יכול להיות מנותח בקלות ויוו באמצעות שיטות לא פולשנית. העיניים מנוקבת להציג עלייה של המיטה כלי הדם של הקשתית, אשר היה קשור עם עלייה של הפעלת plasminogen וסמנים דלקתיים⁸. המודל שהוצגו יש פוטנציאל גדול כמו כלי חדש ללמוד אנגיוגנזה וסינון האנגיוגנזה תרכובות ומאפשרת ישירה ויוו ויזואליזציה של תהליכי אנגיוגנזה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

BALB/c העכבר הגורים של מין או על פי המשפט שימשו את השימוש של בעלי חיים Ophthalmologic ומחקר חזון, הפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה של שטוקהולם לחקר בעלי חיים אתיים. עכברים היו בבניין המלטות, יחד עם האמא סיעוד, עם מחזור יום/לילה 12 שעות, גישה חופשית מזון ומים, ולא תחת פיקוח יומיומי.

הערה: עבור הליך כירורגי, עכברים נשמרו תחת הרדמה עם איזופלוריין נדיף. משחות עינית הן רוחך במהלך הליכי עינית, כפי שהם עשויים להפריע טיפולים וחומרים בשימוש. במידת הצורך, כדי למנוע עין-יבש, טיפה של פתרון סטרילי מלוחים נורמלי יכול להיות מיושם. אך דקירות uveal הריפוי העצמי, הוקדשה במהלך דקירות uveal כדי להבטיח עקרות כלי ניתוח. טיפול לאחר ניתוח כולל שתיה עם תמיסת מלח רגיל subcutaneously, שיכוך כאבים עם עינית הממשל אקטואלי של tetracaine הידרוכלוריד. הגורים הורשו לשחזר recumbency בחזה ובצלעות על כרית החימום לפני מוחזר אם מניקה, בתוך כלוב נקי. המלטות נשמרו עם האם ההנקה באותו להימנע ממתח נפשי.

1. הרדמה

1. הכינו את התא אינדוקציה של הרדמה, לנהל איזופלוריין הרדמה ולהבטיח כי מסכת עכבר קטן זה משולב גם.
   הערה: לבצע ניסויים בבעלי חיים כל מסכים עם כל האישורים אתיים החלים.
2. Prefill תא אינדוקציה עם 3-4% איזופלוריין נדיפים באוויר האטמוספרי.
   הערה: הרדמה חומרים שונים חוץ מאשר איזופלוריין עשוי לשמש, על-פי היתרים אתית. נדיף הרדמה הליכי צריכה להתבצע על ברדס ספסל או fume מאוורר.
3. המקום לאחר הלידה (P) בת 12.5 יום BALB/c העכבר גור בבית הבליעה אינדוקציה. לאשר המנגנון הרדמה הוא מוכן למסור את איזופלוריין אל התא אינדוקציה.
   הערה: העכבר הגורים הם מאוד שבירים ויכולים טיפל בצורה הטובה ביותר עורפה. לשמור יחד את הגורים בהמלטה או עם האם ההנקה להימנע ממתח נפשי.
4. לאפשר הכלבלב להיות מורדם לחלוטין.
5. . בעדינות, תרים את הכלבלב העכבר הזה.
   הערה: לשמור את התא אינדוקציה סגורים בבית כל הזמן אינדוקציה יציבה ובטוחה.
6. להעביר את העכבר המסכה מכרסמים. הקפד להחליף את זרימת הרדמה מן החדר אינדוקציה למסיכה בעת הזזת העכבר.
7. לבצע צביטה הבוהן כדי לאשר הרדמה.

2. לנקב הליך תחת סטריאוסקופ כירורגי

1. מיקום העכבר במצב recumbency לרוחב. לאשר שהמסכה היא ממוצבת היטב כך העין העכבר נמצא שדה הראייה של סטריאוסקופ.
2. סובב בעדינות את הראש העכבר כך העין פונה מעלה, לעבר סטריאוסקופ.
   הערה: מיקוד של העין צריך להיעשות תחת סטריאוסקופ. עבור מיקום, מומלץ על ההגדלה של 16 X, בעוד 40 X אמור לשמש לביצוע הליך כירורגי. אם היתרים אתית מאפשרות זאת, חיתוך קצה נכון יכול להקל את הפריט החזותי של העין.
3. באמצעות מלקחיים קשירת קטן, בזהירות בולטות העין של הכלבלב על ידי הפעלת לחץ כלפי מטה על העפעפיים הגבי ו הגחון לעין.
4. לשמור על אחיזה עדינה, אך המשרד ליד של הגורים העין, עם מלקחיים קטנים.
   הערה: מומלץ לבצע את חדירת העין, מכסה מחזיק ביד האחרת, כמו היד הדומיננטית צריך לבצע את ההליך פנצ'רים.
5. השתמש את סטריאוסקופ כדי לאתר את הקרנית לימבוס. הלבקן BALB/c לימבוס ניתן לזהות בקלות על ידי מקלעת וסקולרית מעגלית האחורי בקרנית.
6. עם מחט בקוטר (30 גרם) 0.25 mm משופע, לבצע ניקוב uveal קטן, ליד הגבול limbal האחורי הענבייה. השתמש רק את קצה המחט, לא יותר מחצי שיקוע (שקול ל- 0.5 מ מ), לנקב את uvea. אם מבוצע כהלכה, הנקבים uveal הם עצמית איטום, אבל תוך-עיני הזרקת חומר הלימוד יכול להינתן דרך הפצע לנקב אותו.
   הערה: אם חווה עם עכבר עינית האנטומיה, הניקוב uveal מבוצע בין ריסי הגוף serrata אורה. חייבים להקפיד בעת ביצוע הניקוב uveal כדי למנוע קריעה העדשה.
7. לבצע הניקוב uveal השני באתר הנגדי של העין מן החדירה הראשונה. למטב את המרחק והמיקום של הנקבים; שקול 12, שעה 6 נקבים, עם 12 השעה להיות כמו הגבי ככל האפשר.
8. חזור על הפעולות דקירות uveal כל 4 ימים עד P24.5. לפני כל ניקוב uveal רצופים, לנטר מצב החיות תשומת לב מיוחדת הימצאות קטרקט טראומטי עקב נזק לעדשה במהלך חדירה uveal, או ברור לחץ עינית מופחתת. המטרה עבור ביצוע דקירות. אני חוזר-באותן משרות כמו דקירות קודמות על השפעות אופטימאליות.

3. לא פולשנית in Vivo ניטור

1. לפני ' דקירה או זריקות בכל יום ניסיוני, עזים ומתנגד העכבר כפי שבוצע לעיל.
2. עם העכבר במצב recumbency לרוחב, בעדינות בולטות לעין.
3. מתמקדים איריס להערכת עם סטריאוסקופ כירורגי.
4. לצלם להערכת איריס עם מצלמה התאימה ל סטריאוסקופ כירורגית.
   הערה: אם כי לא הכרחי, גרימת מיוזה עשויה להועיל לנרמל את איריס שטח, בעלי חיים. קח בחשבון היתרים אתית בעת בחירת סוכן בתדר מיוזה. זהירות מוקד להערכת איריס יקל עוד ניתוח כמותי. בסדר גודל של 40 X מומלץ.

4. לאחר הניתוח טיפול

1. הכלבלב BALB/c להסיר המסכה מכרסמים, בעדינות להעביר אותו כרית החימום שכבתית עם מזרן כירורגי.
2. טיפה אחת של 1% פתרון tetracaine חלות על העיניים מנוקבת.
   הערה: פתרונות כאבים אחרים ניתן להשתמש, על-פי היתרים אתית.
3. מימה החיה עם זריקה תת עורית של µL 200 תמיסת סטרילית נורמלי.
4. לחזור הגורים האמא סיעוד בתוך כלוב עכבר נקי.
5. לפקח על תהליך ההחלמה. הכלבלב אמור להיות מסוגל deambulate ולחזור הגורים.

5. עין העקירה

1. להרדימו על ידי נקע בצוואר הרחם. לבצע את העקירה לנתיחה תחת סטריאוסקופ להמחשת טוב יותר של ההליך.
   הערה: המתת חסד שונות ניתן להשתמש בהליכים. מומלץ לדבוק בקפדנות היתרים אתית.
2. להפריד את העפעפיים כדי לשפר את החשיפה לעין.
3. לעשות חתך קטן (כ 0.5 ס מ) ליד canthus של בעפעפיים במספריים העין מעוקל של בון.
4. להשתמש בשטח חשוף periocular להוספת מיקרו מלקחיים קשירה מאחור (תחת) כדור הארץ במסלול.
5. . תפוס את הרקמות הסובבות את העין ומשוך בעדינות כלפי מעלה. להימנע המעצר על גבי גלגל העין, השתמש הרקמות הסובבות קרוב כדי ארובת העין.
6. הכנס את המספריים העין בון מעוקל מאחורי העולם העין מסלולו.
7. לחתוך דרך הרקמות הסובבות עד העין הוא שוחרר מן השקע.
   הערה: טכניקה דיסקציה זו שומרת על העין אנטומיה ויתרונות חשפה.
8. המשך הסרת רקמה שאינם שייכים מהעין. הסרת רקמת חיצוני יכול להתבצע לאחר תיקון, אם מועדף.
   הערה: BALB/c עכברים הם מלנין לקוי, לכן, כדי להגדיל את החדות, רקע כהה מומלץ כדי להקל על הליך לנתיחה.
9. בקצרה שטיפה העין כולה בצלחת פטרי מלא מלח סטרילית באגירה פוספט (PBS).
10. להעביר את העין צינור 2 מ"ל המכיל 1.5 מ של 4% פורמלין buffered פתרון.
11. לתקן את העין במשך 6 שעות בטמפרטורת החדר.
    הערה: תיקון מקנה את הנוקשות של הרקמה ואסטמה ומקילה על ניתוח של הקשתית. תיקון זמן עליו נבדק, מותאם עבור יישומים שונים.

6. איריס הליך ניתוח תחת סטריאוסקופ

1. הסר את הפתרון מקבע הצינור עם פיפטה פסטר פלסטיק של 1.5 mL (או דומה), ולשטוף את העין 3 פעמים עם PBS טריים.
2. מקום העין קבוע משטח יבש חלק (דיסקציה מעמד) לחדר הקדמיות כלפי מעלה.
3. עם מחט 30 G משופע, לבצע נקודת כניסה האחורי לימבוס.
4. מחזיק את המקטע הקדמי עם מלקחיים קשירת קטן, להוסיף עצה אחת מספריים ישר קליימן-Vannas לתוך הפתח שנוצרו בעבר.
   הערה: מומלץ כדי לשלוט המלקחיים עם היד הלא דומיננטית, את המספריים עם הדומיננטי.
5. תוך כדי סיבוב את העין עם המלקחיים קשירה, לעקוף לימבוס להסיר את המקטע האחורי של העין.
   הערה: ביצוע חלקית הקיצוצים יאפשר הקצה הפנימי של המספריים להמשיך בתוך רקמת ו מאוד מקלה על התהליך.
6. מקם את המקטע הקדמי מופנות כלפי מטה, לחשוף את העדשה.
7. הסר את העדשה בקפידה על ידי תופס אותו עם מלקחיים קטנים ומושך כלפי מעלה.
   הערה: מחט משופע יכול לשמש כדי לנקב ומשוך את העדשה.
8. מקם את המקטע הקדמי עם הקרנית פונה כלפי מטה, החתך בניצב שדה הראייה.
9. בעדינות לתפוס את הרקמה האחורי לגוף ריסי עם המלקחיים קשירת קטן.
10. במספריים ישר קליימן-Vannas, להמשיך לקצץ רק והשתרשה עמוק בלבה לגוף ריסי כדי להסיר את trabecular meshwork ולבודד את הקשתית. לאשר כי meshwork trabecular מוסר; הקשתית צריכה להעביר בתוך הקרנית.
11. בזהירות להעביר את עיינית הקדמי עם המלקחיים קשירת קטן, מחזיק את הקרנית, על צלחת 96-ובכן המכיל 200 µL ל- PBS.
12. המשך החזקת הקרנית בבאר ומנתחים את הקשתית על ידי שטיפה עם PBS עם פיפטה.
    הערה: אם כנצרות שרידים איריס בקרנית, meshwork trabecular מסוימים ייתכן ההוה שיפוע של מחט 30 G יכול לשמש כדי לעזור ועקרו מבתיהם את הקשתית.
13. להסיר את הקרנית 96-ובכן עם המלקחיים קשירת קטן, ולשמור את הקשתית מבודד בתוך הבאר לניתוח נוסף.
14. לאחסן דגימות איריס לתרשים ב 4 º C.
    הערה: למרות להיות קבוע, אחסון לטווח ארוך של הדגימות לתרשים איריס אינה מומלצת.

7. אפשרי הקריאות ניסיוני

1. כדי להמחיש את כלי הדם ב- האיריסים גזור, השתמש לתרשים אימונוהיסטוכימיה כולה-הר מכתים שיטות כגון טסיות תא אנדותל אדהזיה מולקולה (PECAM)-1 או isolectin B4. לחלופין, השתמש זלוף לכל הגוף עם צביעת כלי דם, כגון התווית על-ידי פלורסנט משקל מולקולרי גבוה dextrans.
2. השתמש ויוו תמונות לא פולשנית כדי לבצע סיליקו שטוח-הרכבה ולכמת להערכת איריס מלא עם תוכנת הדמיה המתאימה.
   הערה: להערכת ניתן לכמת, הן ויוו והן במבחנה, באמצעות densitometry או להערכת ניתוח תוכנה⁹.
3. לעבד את כל גלגל העין עבור חומצות גרעין והפקת חלבונים, ואחריו בשיטות PCR או immunoblotting, לבצע ניתוח מולקולרית של העיניים מנוקבת.
   הערה: אנליזה מולקולרית של הרקמות מבוצעת בצורה הטובה ביותר עם רקמת שאינו קבוע, אבל ניתוח של איריס שאינו קבוע הוא מאוד מאתגר, השימוש של העין כל הפכה תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית מחקרים קודמים⁸.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הגורים העכבר BALB/c לבקן-P12.5 היו נתונים נקבים uveal, חוזר על עצמו בכל יום הרביעי (ניסיוני יום 0, 4, 8, 12), עד P24.5. P27.5, עכברים היו מורדמים, אירוסים גזור בקפידה (ניסיוני יום 15). תמונות של העכבר העיניים צולמו עם מצלמה מחוברת סטריאוסקופ כירורגי לפני כל סדרת לנקב בכל יום ניסיוני להעריך הערכ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בפרוטוקול הנוכחי, מוצגת שיטה עבור אינדוקציה של איריס תגובת כלי הדם על ידי ניקוב uveal. הניקוב מפעיל מנגנוני ריפוי הפצע ומקדם תגובות כלי הדם איריס^10,11. . זה מסכים עם פתולוגיות עינית, כגון PDR ו- NVG, שבו האנגיוגנזה החמירה תגובות מן הרשתית בקטע האחורי של העין, מסתיימים...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bonn eye scissors	Bausch & Lomb	23060
Clayman-Vannas curved scissors	Bausch & Lomb	E3383 C
Clayman-Vannas straight scissors	Bausch & Lomb	E3383 S
Objective adapter for camera	Handcrafted	N/A	Or any system that allows adapting a camera to the microscope
Heating Pad 100-110 watts	Non Applicable	N/A	Available in pet/veterinarian stores
Hypodermic 30g beveled needle	KDM GmBH germany	911914
Iphone 4S	Apple	Non Applicable	Or other high resolution image acquistion device
Isoflurane	Baxter	KDG 9623
McPherson tying forceps	Bausch & Lomb	E1815 S
Micro tying forceps	Bausch & Lomb	63140
Minims tetracaine hydrochloride	Bausch & Lomb	N/A	1 % (w/v) Eye Drops
Neutral-buffered formalin	Bioreagens	0018-40
Normal saline solution	Fresenius Kabi	210352	0.9 % (w/v) NaCl in injectable water
Phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	10010023	Balanced and buffered PBS pH 7.4
Petri dish 10 cm	Starstedt	83.3902
Petri dish 3 cm	Starstedt	83.3900
Safe Seal Tube 2.0 mL	Starstedt	72.685.200	Or any eppendorf style tubes
TC plate 96-well	Starstedt	83.3924
Transfer pipette 3.5 mL	Starstedt	86.1171	Or any other Pasteur pipette style
Univentor 400 anesthesia unit	Univentor Limited	N/A	Or equivalent flow regulator with induction chamber and mask for volatile anesthesia
Wild M650 surgical microscope	Wild Heerbrugg	N/A	Or other surgical or magnifying stereoscope