Induzida por punção neovascularização de Iris como um modelo do rato da Rubeosis Iridis

Resumo

Neovascularização da íris, uma complicação comum da doença isquêmica da retina, pode levar a risco de vista neovascular glaucoma. Aqui, descrevemos um protocolo murino para induzir a neovascularização da íris experimental que pode ser utilizada para avaliação não invasiva da angiogênese-modulando as substâncias.

Resumo

Descrevemos um modelo de neovascularização íris induzida por punção como um modelo geral para avaliação não invasiva da angiogênese. O modelo também é relevante para o direcionamento de glaucoma neovascular, uma visão ameaçadora complicação da retinopatia diabética. Este método baseia-se na indução da resposta vascular de íris por uma série de furos da Úvea autovedante em camundongos BALB/c e aproveita a maturação pós-parto da vasculatura ocular do mouse. Filhotes de rato passam por punções da Úvea do dia pós-natal 12.5, quando os filhotes naturalmente abrirem seus olhos, até o dia pós-natal 24,5. Devido a transparência da córnea, vasculatura íris pode ser analisada facilmente através do tempo por métodos não invasivos na vivo . Além disso, a íris semitransparente de camundongos BALB/c pode ser flatmounted para immunohistologic detalhada análise com coloração de fundo mínimo de não-específica. Neste modelo, angiogênese é impulsionado principalmente pela inflamatória e plasminogênio Ativando sistemas. O modelo induzida por punção é o primeiro para induzir a neovascularização da íris em pequenos roedores e tem a vantagem de permitir a análise directa não invasivo na vivo do processo angiogênico. Além disso, o modelo pode ser combinado com substâncias modulando angiogênico, que destaca seu potencial no estudo da angiogênese com uma perspectiva na vivo .

Introdução

A íris, juntamente com o corpo ciliar e a coroide, compreende a Úvea, que é o tecido mais vascularizado do olho. Vasculatura Iris é essencial na manutenção da homeostase na câmara anterior do olho. Como resultado de abundantes conexões anastomótica entre artérias e veias, os vasos sanguíneos de íris fornecer nutrientes e o suprimento de oxigênio não só a íris em si, mas o todo segmento anterior do olho¹.

A formação de novos vasos sanguíneos, ou angiogênese de pre-existentes, é fundamental em processos fisiológicos, tais como desenvolvimento e²de cicatrização de feridas. Angiogênese é finamente regulada por uma multiplicidade de factores canônicas, como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e inibidor de ativador de plasminogênio (PAI), bem como vários fatores inflamatórios, e um desequilíbrio desses fatores pode levar a patológica angiogênese³.

No olho, a neovascularização é a causa de doenças fatais vista, tais como a retinopatia diabética proliferativa (PDR) e glaucoma neovascular (NVG). Nestas doenças oculares, a neovascularização focal geralmente está localizada em tecidos da retina, no entanto, o desequilíbrio em inflamatória e fatores angiogênico em ambos as anteriores e posteriores oculares câmaras do olho tem sido associada com rubeosis iridis, o termo clínico para íris neoangiogênese patológica⁴. Estas patologias indicam a capacidade da íris adulta submeter-se a angiogênese. Em camundongos, sistema vascular ocular é imaturo, após o nascimento e continua a maturação pós-parto. Esta peculiaridade do desenvolvimento é explorada no modelo do rato da retinopatia induzida pelo oxigênio, um modelo que imita pròxima o quadro clínico de retinopatia da prematuridade⁵. Além disso, angiogênese e inflamação desempenham um papel crucial em mecanismos⁶de cicatrização de feridas, e para ferir a cura em si tem sido associada a angiogênese modelos⁷.

Neste estudo, descrevemos um modelo de neovascularização íris induzida por punção. Da Úvea punções são realizadas perto do limite exterior do limbo, que induzem a neovascularização da íris por acionar a sistema de cicatrização de feridas. Devido a transparência da córnea, a vasculatura de íris pode ser analisado facilmente na vivo por métodos não-invasivos. Furado olhos apresentam um aumento do leito vascular na íris, que tem sido associada com um aumento da ativação do plasminogênio e marcadores inflamatórios⁸. O modelo apresentado tem um grande potencial como uma nova ferramenta para estudar a angiogênese e triagem angiogênico compostos e permite a visualização direta no vivo dos processos angiogênico.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Filhotes de rato BALB/c, de ambos os sexos foram utilizados em conformidade com a instrução para o uso de animais em oftalmológico e Vision Research, e os protocolos foram aprovados pela Comissão de Estocolmo para a ética Animal de investigação. Os ratos foram alojados em ninhadas, juntamente com a mãe que amamenta, com um ciclo de dia/noite de 12 h, livre acesso à comida e água e monitorados diariamente.

Nota: Para o procedimento cirúrgico, os ratos foram mantidos sob anestesia com isoflurano voláteis. Pomadas oculares são desencorajadas durante procedimentos oculares, como eles podem interferir com tratamentos e substâncias utilizadas. Se necessário, para evitar o olho seco, uma gota de solução salina normal estéril pode ser aplicada. Apesar da Úvea punções são self-healing, cuidado foi tomado durante punções da Úvea para garantir a esterilidade com instrumentos cirúrgicos. Tratamento pós-cirúrgico incluiu a hidratação com solução salina normal por via subcutânea e analgesia com a administração tópica ocular de cloridrato de tetracaína. Os filhotes foram autorizados a recuperar a prostração esternal sobre uma almofada de aquecimento antes de ser devolvido para a mãe que amamenta, em uma gaiola limpa. Ninhadas foram mantidas com a mesma mãe de enfermagem para evitar o estresse.

1. anestesia

1. Prepare a câmara de indução de anestesia, para administrar o isoflurano anestésico e certifique-se de que uma máscara pequena do mouse também é acoplada.
   Nota: Realize experimentos todos os animais de acordo com todas as licenças éticos aplicáveis.
2. Prefill câmara de indução com 3-4% de isoflurano voláteis no ar atmosférico.
   Nota: Diferentes substâncias anestésicas que isoflurano podem ser utilizadas, de acordo com autorizações de éticas. Procedimentos anestésicos voláteis devem ser realizados uma campânula ventilada de banco ou emanações.
3. Coloca um filhote de rato BALB/c de 12,5-dias de idade pós-natal (P) na câmara de indução. Confirme que o aparelho de anestesia está pronto para entregar isoflurano para a câmara de indução.
   Nota: Filhotes de rato são frágeis e melhor manipulado pela nuca. Manter os filhotes juntos como uma ninhada ou com a mãe de enfermagem para evitar o estresse.
4. Permitir que o filhote ser totalmente anestesiado.
5. Delicadamente, pega o filhote de rato pela nuca.
   Nota: Manter a câmara de indução fechada em todos os momentos para indução segura e estável.
6. Transferi o mouse para a máscara de roedor. Certifique-se de mudar o fluxo anestésico da câmara de indução para a máscara ao mover o mouse.
7. Execute uma pitada de dedo do pé para confirmar a anestesia.

2. perfure o procedimento sob estereoscópio cirúrgico

1. Posicione o mouse na posição lateral de prostração. Confirme que a máscara está bem posicionada para que o olho do rato é no campo de visão do estereoscópio.
2. Assim que o olho está virada para cima em direção ao estereoscópio, Rode suavemente a cabeça de rato.
   Nota: O foco claro do olho deve ser alcançado sob o estereoscópio. Posicionamento, é recomendável uma ampliação de 16x, enquanto 40 X deve ser usado para realizar o procedimento cirúrgico. Se ética autorizações permitem, aparar a ponta dos bigodes pode facilitar a visualização do olho.
3. Usando pequenas pinças subordinante, cuidadosamente se projetam olho do filhote aplicando uma pressão para baixo para as pálpebras, dorsais e ventrais ao olho.
4. Segure um suave mas firme da tampa do olho do filhote, com pequenas pinças.
   Nota: Recomenda-se realizar a protusão do olho e tampa segurando com a mão não dominante, como a mão dominante deve executar o procedimento de punção.
5. Use o estereoscópio para localizar ao limbo da córnea. Limbo de Albino BALB/c pode ser facilmente identificado, o plexo vascular circular posterior da córnea.
6. Com uma agulha chanfrada de diâmetro (30 G) de 0,25 mm, realize uma pequena punção da Úvea, perto do limite de estroma posterior da Úvea. Use apenas a ponta da agulha, e não mais da metade do bisel (equivalente a 0,5 mm), punção da Úvea. Se executado corretamente, os furos da Úvea são auto-selante, ainda injeção intra-ocular de substâncias de estudo pode ser administrada através do mesmo ferimento.
   Nota: Se experimentou com anatomia ocular do mouse, a punção da Úvea é executada entre o corpo ciliar e ora serrata. Deve ter cuidado ao executar a punção da Úvea para evitar a ruptura da lente.
7. Realize a punção da Úvea segunda no site do oposto do olho do primeiro local de punção. Otimizar a distância e a posição das punções; Considere o 12 e punções de 06:00, com 12:00 sendo tão dorsal quanto possível.
8. Repita o procedimento de punções da Úvea em quatro dias até P24.5. Antes de cada punção da Úvea sucessiva, monitore animais status especial atenção à presença da catarata traumática devido a dano da lente durante a punção da Úvea, ou pressão ocular diminuição óbvia. Aponte para executar punções repetição às mesmas posições como punções anteriores para efeitos de ideais.

3. não-invasiva na Vivo de monitoramento

1. Antes da punção ou injeções em cada dia experimental, anestesia o mouse como realizada acima.
2. Com o mouse na posição lateral de prostração, projetam-se suavemente o olho.
3. Concentre-se na vasculatura de íris com o estereoscópio cirúrgico.
4. Tire uma foto da vasculatura íris com uma câmera equipada para o estereoscópio cirúrgico.
   Nota: Apesar de não haver necessidade, induzindo a meiose pode ser útil para normalizar a área de íris por animal. Considere éticas licenças quando selecionando um agente indutor de meiose. Cuidado foco da vasculatura íris facilitará ainda mais a análise quantitativa. Recomenda-se uma magnitude de 40 X.

4. no pós-operatório cuidados

1. Remover o filhote BALB/c da máscara de roedores e suavemente, transferi-lo para uma almofada de aquecimento em camadas com uma esteira cirúrgica.
2. Aplique uma gota de solução de tetracaína 1% aos olhos perfurados.
   Nota: Outras soluções analgésicas podem ser usadas, de acordo com autorizações de éticas.
3. Hidrate o animal com uma injeção subcutânea de 200 µ l de solução salina normal estéril.
4. Retorne o filhote para a mãe que amamenta em uma gaiola limpa do mouse.
5. Monitore o processo de recuperação. O filhote deve ser capaz de deambulate e voltar para a maca.

5. olho Enucleação

1. Eutanásia do animal por deslocamento cervical. Execute Enucleação e dissecação sob um estereoscópio para melhor visualização do procedimento.
   Nota: Os procedimentos de eutanásia diferentes podem ser usados. Recomenda-se a aderir às autorizações de éticas.
2. Separe as pálpebras para melhorar a exposição aos olhos.
3. Fazer um pequeno corte (cerca de 0,5 cm) perto do canto do olho das pálpebras com uma tesoura de olho Bonn curva.
4. Use o espaço periocular expostas para inserir micro fórceps subordinante atrás (do globo sob) na órbita.
5. Pegue o tecido circundante do olho e puxe delicadamente para cima. Evitar a exploração sobre o globo ocular, usar os tecidos circundantes mais próximo ao soquete do olho.
6. Inserir a tesoura de olho Bonn curva atrás do globo do olho na órbita.
7. Corte os tecidos circundantes, até que o olho é liberado do soquete.
   Nota: Esta técnica de dissecação mantém a anatomia do olho e beneficia a análise subsequente.
8. Proceda à remoção do tecido externos do olho. A remoção de tecido estranho pode ser executada após a fixação, se preferirem.
   Nota: Camundongos BALB/c são melanina deficiente, portanto, para aumentar o contraste, é recomendado um fundo escuro para facilitar o processo de dissecação.
9. Brevemente enxaguar o olho inteiro em uma placa de Petri preenchida com solução salina tampão fosfato (PBS).
10. Transfira o olho para um tubo de 2 mL contendo 1,5 mL de solução de formol tamponado de 4%.
11. Fixar o olho durante 6 h à temperatura ambiente.
    Nota: Fixação confere a rigidez do tecido e facilita a dissecação da íris. Tempo de fixação deve ser testado e ajustado para diferentes aplicações.

6. Iris dissecação procedimento sob estereoscópio

1. Remover a solução fixador do tubo com uma pipeta Pasteur plástica de 1,5 mL (ou similar) e enxágue os olhos três vezes com PBS fresco.
2. Coloque o olho fixo em uma superfície lisa seca (carrinho de dissecação) com câmara anterior voltado para cima.
3. Com uma agulha 30G chanfrada, realize um ponto de entrada posterior ao limbo.
4. Segurando o segmento anterior com pequenas pinças subordinante, insira uma ponta do Clayman-Vannas para reta na abertura criada anteriormente.
   Nota: Recomenda-se controlar a pinça com a mão não dominante e a tesoura com o dominante.
5. Enquanto roda o olho com a pinça subordinante, corte em torno ao limbo para remover o segmento posterior do olho.
   Nota: Efectuar cortes parciais permitirá a ponta interna da tesoura para continuar no tecido e grandemente facilita o processo.
6. Posicione o segmento anterior voltada para baixo, expondo a lente.
7. Remova a lente cuidadosamente agarrando-o com pequenas pinças e puxando para cima.
   Nota: Uma agulha chanfrada pode ser usada para perfurar e puxe a lente.
8. Posicione o segmento anterior com a córnea virado para baixo e o corte perpendicular ao campo de visão.
9. Pegue delicadamente o tecido posterior ao corpo ciliar com a pequena pinça subordinante.
10. Com uma tesoura reta Clayman-Vannas, prosseguir para aparar só anterior do corpo ciliar para remover a malha trabecular e isolar a íris. Confirmar que a malha trabecular é removida; a íris deve mover-se dentro da córnea.
11. Transferi com cuidado a viseira anterior com a pinça subordinante pequena, mantendo a córnea, a uma placa de 96 poços contendo 200 µ l de PBS.
12. Continue a manter a córnea no poço e dissecar a íris por lavagem com PBS com uma pipeta.
    Nota: Se o aderente de restos de íris para a córnea, uma malha trabecular pode estar presente e o bisel da agulha 30G pode ser usado para ajudar a deslocar a íris.
13. Retire o 96 poços com a pequena pinça subordinante da córnea e manter a íris isolada no poço para uma análise mais aprofundada.
14. Armazenar amostras flutuantes íris a 4 ° C.
    Nota: Apesar de ser corrigido, armazenamento a longo prazo das amostras flutuantes íris não é recomendado.

7. possíveis leituras experimentais

1. Para visualizar os vasos sanguíneos em íris dissecados, use toda a montagem flutuante imuno-histoquímica coloração métodos para marcadores como a molécula de adesão celular endotelial de plaquetas (PECAM) -1 ou isolectin B4. Como alternativa, use perfusão de todo o corpo com manchas vasculares, tais como dextranos fluorescente-etiquetadas alto peso molecular.
2. Use na vivo não invasiva imagens para realizar em silico plana-montagem e quantificar a vasculatura íris completo com software de imagem apropriado.
   Nota: O sistema vascular pode ser quantificada, tanto in vivo e em vitro, utilizando densitometria ou com vasculatura análise software⁹.
3. O processo todo globo ocular para ácidos nucleicos e extração da proteína, seguido por métodos PCR ou immunoblotting, realizar a análise molecular dos olhos perfurados.
   Nota: Análise Molecular dos tecidos é melhor executada com tecido não fixa, mas dissecação da íris não fixa é extremamente desafiador, e o uso do olho todo tem processado resultados estatisticamente significativos em anteriores estudos⁸.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Filhotes de rato Albino BALB/c em p 12.5 foram submetidas a punções da Úvea, repetidas cada quarto dia (experimental dia 0, 4, 8, 12), até P24.5. Em P27.5, os ratos foram sacrificados e íris cuidadosamente dissecado (experimental dia 15). Fotos de olhos de rato foram tiradas com uma câmera acoplada a um estereoscópio cirúrgico antes de cada série de punção em cada dia experimental para avaliar a avaliação não invasiva da resposta vascular íris. Punções da Úvea induzem um...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

No presente protocolo, é apresentado um novo método para a indução da resposta vascular de íris por punção da Úvea. A punção desencadeia mecanismos de cura ferida e promove respostas vasculares na íris^10,11. Isto está de acordo com patologias oculares, tais como o PDR e NVG, onde respostas angiogênico exacerbada da retina no segmento posterior do olho culminaram com o quadro clínico da rubeosis iridis, uma aumento de vascularização da íris

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bonn eye scissors	Bausch & Lomb	23060
Clayman-Vannas curved scissors	Bausch & Lomb	E3383 C
Clayman-Vannas straight scissors	Bausch & Lomb	E3383 S
Objective adapter for camera	Handcrafted	N/A	Or any system that allows adapting a camera to the microscope
Heating Pad 100-110 watts	Non Applicable	N/A	Available in pet/veterinarian stores
Hypodermic 30g beveled needle	KDM GmBH germany	911914
Iphone 4S	Apple	Non Applicable	Or other high resolution image acquistion device
Isoflurane	Baxter	KDG 9623
McPherson tying forceps	Bausch & Lomb	E1815 S
Micro tying forceps	Bausch & Lomb	63140
Minims tetracaine hydrochloride	Bausch & Lomb	N/A	1 % (w/v) Eye Drops
Neutral-buffered formalin	Bioreagens	0018-40
Normal saline solution	Fresenius Kabi	210352	0.9 % (w/v) NaCl in injectable water
Phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	10010023	Balanced and buffered PBS pH 7.4
Petri dish 10 cm	Starstedt	83.3902
Petri dish 3 cm	Starstedt	83.3900
Safe Seal Tube 2.0 mL	Starstedt	72.685.200	Or any eppendorf style tubes
TC plate 96-well	Starstedt	83.3924
Transfer pipette 3.5 mL	Starstedt	86.1171	Or any other Pasteur pipette style
Univentor 400 anesthesia unit	Univentor Limited	N/A	Or equivalent flow regulator with induction chamber and mask for volatile anesthesia
Wild M650 surgical microscope	Wild Heerbrugg	N/A	Or other surgical or magnifying stereoscope