JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم بروتوكول لتحديد خصوصية حوزتي في النسيج الخام الماوس مقتطفات استخدام TOF استخدام قياس الطيف الكتلي.

Abstract

وقد البروتياز العديد من الوظائف البيولوجية، بما في ذلك هضم البروتين التنشيط/المنظمة والغذاء. تحديد خصوصية حوزتي مهم للكشف عن حوزتي الدالة. الطريقة المقترحة في هذه الدراسة تحدد مبطلات خصوصية بقياس الوزن الجزيئي لركائز فريدة من نوعها باستخدام مصفوفة-بمساعدة الليزر الامتزاز/التأين وقت الطيران (استخدام-TOF) الطيف الكتلي. ركائز تحتوي على إيمينوبيوتين، بينما الموقع ملصوق يتكون من الأحماض الأمينية، ويتكون فاصل من البولي إيثيلين غليكول. سوف تولد الركيزة ملصوق وزن الجزيئي فريدة من نوعها باستخدام الأحماض الأمينية ملصوق. ومن مزايا هذا الأسلوب هو أنه قد تجري في وعاء واحد باستخدام عينات النفط الخام، وأيضا مناسبة لتقييم عينات متعددة. في هذا المقال، يمكننا وصف أسلوب تجريبي بسيط الأمثل مع العينات المستخرجة من أنسجة الرئة الماوس، بما في ذلك استخراج الأنسجة، وضع ركائز الجهاز الهضمي في عينات، وتنقية ركائز الجهاز الهضمي تحت ظروف مختلفة الأس الهيدروجيني ، وقياس الوزن الجزيئي لركائز استخدام TOF استخدام الطيف الكتلي. باختصار، تسمح هذه التقنية للتعرف على خصوصية حوزتي في عينات النفط الخام المستمدة من مقتطفات الأنسجة استخدام TOF استخدام الطيف الكتلي، التي يمكن بسهولة الارتقاء لتجهيز نماذج متعددة.

Introduction

البروتياز تنظيم العمليات الفيزيولوجية التي ناهضة البروتينات، وبدء نشاط البروتياز في أوقات محددة ومواقع التنظيم1. ولذلك من المهم تحديد التعبير والنشاط للأنسجة التي يتم تنظيمها محلياً، ووضع طريقة جديدة للكشف عن البروتياز. الطريقة المقترحة في هذه الدراسة تهدف إلى التعرف على خصوصية حوزتي بالتوازي مع كشف البروتياز.

توجد بعض الطرق للكشف عن خصوصية حوزتي. الأسلوب أزوكاسين معروفة لاستخدامها في الكشف عن البروتياز2 ولكن محدودة في قدرتها على الحصول على مزيد من المعلومات. زيموجرافي هو آخر طريقة الكشف عن حوزتي الشاملة التي يمكن استخدامها لتحديد الوزن الجزيئي من البروتياز3، ولكن لا يمكن استخدامه لدراسة خصوصية الركازة. يمكن تحديد خصوصية حوزتي فحوصات والمطيافيه، استخدام ركائز مثل نيتروانيليدي ف-4، وفحوصات فلوروميتريك، استخدام الكومارين ركائز5 أو فحوصات Fluorescence الرنين الطاقة نقل (بكى)6. هذه الأساليب تمكين الكشف عن خصوصية واحدة من ركائز الوارد في بئر واحدة. في هذه الدراسة، هو دراسة خصوصية حوزتي مقتطفات الأنسجة تحت ظروف مختلفة، كما تحتوي هذه المقتطفات البروتياز متعددة. وينظم العديد من العوامل، بما في ذلك درجة الحموضة والأنزيمات المساعدة ومجموعات الاصطناعية وقوة أيون نشاط البروتياز. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت الأساليب المستندة البروتيوميات تحديد خصوصية حوزتي؛ على سبيل المثال، الطريقة التي أفادت بها بينيوسيك وآخرون. 7 يستخدم البروتين لتحديد خصوصية الركيزة حتى في مقتطفات النفط الخام ويسمح تحديد دقيق لنشاط البروتياز التي تعترف بتسلسل الأحماض الأمينية متعددة8الانقسام. ومع ذلك، هذا الأسلوب غير مناسب لتحليل العينات العديدة. وفي المقابل، تمكن لدينا أسلوب المعالجة المتزامنة لعينات متعددة، واستخدام ماتريكساسيستيد الليزر الامتزاز/التأين وقت الطيران (استخدام-TOF) الكتلي لتحليل العينات ويسهل الكشف السريع والسهل ملصوق ركائز.

وتلخص هذه الورقة أسلوباً لتقييم خصوصية حوزتي باستخدام TOF استخدام الطيف الكتلي لقياس الوزن الجزيئي لركائز فريدة من نوعها. النماذج الجزيئية لركائز ملصوق، جنبا إلى جنب مع أوزانها الجزيئية النظرية، مبينة في الشكل 1 و الجدول 1. الدراسات السابقة استخدمت الركازات المحتوية على الفواصل بوليجليسيني والبيوتين9؛ ومع ذلك، هي معيبة هذه ركائز لأنه قد يكون المشقوق التسلسل بوليجليسيني بالأنزيمات التي تعترف بالتسلسل جليكاين. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي تقارب عالية بين عبدين والبيوتين إلى معدل استرداد منخفضة. ولتحسين هذه العيوب، في هذه الدراسة أننا توليفها الركازة فريد، الذي كان يتألف من البولي إيثيلين غليكول (شماعة)، إيمينوبيوتين، وهو من الأحماض الأمينية التي يمكن تحديد موقع الانقسام (الشكل 1). وأضيف إلى تميز بين الأحماض الأمينية من الأوزان الجزيئية مماثلة، د-سيرين بين مباعدة شماعة والأحماض الأمينية في الموقع ملصوق.

N--المحطة طرفية الركازة وصفت مع إيمينوبيوتين، الذي يتيح لتنقية تقارب من عينات النفط الخام. يتم استخدام إيمينوبيوتين بدلاً من البيوتين الحرجة؛ البيوتين له صلة قوية مع عبدين، الذي ينتج معدلات الاسترداد منخفضة من ركائز المسمى البيوتين من الراتنج عبدين، بينما يمكن تغيير النسب في إيمينوبيوتين لعبدين بالاس الهيدروجيني. سيتم ربط ركائز المسمى إيمينوبيوتين avidin في الشروط أعلاه الرقم الهيدروجيني 9، بينما avidin النشرات ركائز المسمى إيمينوبيوتين في ظروف أقل درجة الحموضة 4. ولذلك، استخدم إيمينوبيوتين ل تنقية تقارب10. وباختصار، يصف لنا بروتوكول مفصلة للكشف عن خصوصية حوزتي استخدام ركائز فريدة من نوعها.

Protocol

البروتوكولات التجريبية الحيوانية وافقت عليها لجنة الأخلاقيات في جامعة نيهون الصيدلانية وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية في جامعة نيهون الصيدلانية. وتم تعديل البروتوكول للأنسجة مقتطفات المستمدة من الفئران الممثل المدني الدولي. وتم شراء الفئران الممثل المدني الدولي من نيبون سلك المحدودة (شيزوكا، اليابان)

1-إعداد الركيزة المسمى إيمينوبيوتين

يخضع الركيزة الصلبة-مرحلة التوليف استخدام المجموعة 9-فلورينيلميثيلوكسيكاربونيل (معتدلاً)-حماية الأحماض الأمينية كما هو موضح أدناه11. استخدام الجدول 2 لتحديد معتدلاً-مجمع المستخدمة، اعتماداً على مرحلة التوليف والأحماض الأمينية المطلوب.

  1. إيجاد ز 0.2 من الراتنج معتدلاً-NH-سأل مع 10 مل N، N-dimethylformamide (DMF) في عمود توليف.
  2. إضافة 5 مل بيبيريديني 30% في DMF. روك الحل لمدة 10 دقيقة تهزم معتدلاً-المجموعة.
  3. اختبار الانقسام معتدلاً مع حمض ترينيتروبينزينيسولفونيك (تنبس) تحقق12: إضافة 10 ميليلتر من 1% أنبوب تنبس في DMF و 10 ميليلتر من دييسوبروبيليثيلاميني (ديبا) 10 × 75 مم2 زجاج الأنبوبة، ثم نقل كمية صغيرة من الراتنج للزجاج. وينبغي تطوير الراتنج المشقوق معتدلاً لون برتقالي.
    1. كرر الخطوات من 1، 1، 2-3 إذا كانت هذه النتيجة السلبية.
  4. أغسل الراتنج ثلاث مرات مع 5 مل DMF.
  5. إضافة 5 مل DMF يحتوي على 0.3 ميللي مول معتدلاً-مجمع ترد في الجدول 2 (بدءاً من مجمع المستخدمة في المرحلة 1)، 0.3 ميللي مول من 0.3 ميللي مول من 1-O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium سداسي فلوروفوسفات (هكتو)، هيدروكسيل-ح 1-بينزوتريازولي، مونوهيدرات (هوبت)، وملمول 0.6 من دييسوبروبيليثيلاميني (ديبا). روك الحل بالنسبة الزوجين فإنه مع الراتنج و 30 دقيقة.
    1. تحقق من هذه الخطوة باختبار تنبس. إذا كانت النتيجة إيجابية، وهذا يعني أن رد الفعل لم تتقدم بما فيه الكفاية ويجب تكرار هذه الخطوة.
  6. أغسل الراتنج ثلاث مرات مع 5 مل DMF.
  7. كرر رد فعل الإطالة بتكرار الخطوات من 1.2-1.6، تغيير معتدلاً-مجمع المستخدمة في الخطوة 1، 5 وفقا الجدول 2.
  8. أضف 1 مل من الماء 2.5%، 1% اثانيديثيول ترييسوبروبيلسيلاني (TIS)، و 2.5 في المائة (EDT) في حامض trifluoroacetic تهزم الببتيدات من الراتنج وحماية المجموعات. روك أن الحل لمدة 60 دقيقة.
  9. تصفية، وجمع فيلتراتي في أنبوب 50 مل.
  10. إضافة 40 مل إيثانول ثنائي إثيل الباردة ومخزن بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية.
  11. تجميع أجهزة الطرد المركزي س 4,000 ز في-20 درجة مئوية للحد الأدنى 30 بيليه.
  12. استخدام مجفف ح 3 لإزالة الاثير ثنائي إثيل.
  13. أضف 1 مل من الاسيتو الانيتريل 50% للمياه وحل الببتيدات النفط الخام. ليوفيليزي الحل لإزالة حامض trifluoroacetic. كرر هذه الخطوة عدة مرات.
  14. تنقية الببتيدات استخدام عمود C18 خرطوشة.
    1. تنشيط الراتنج في عمود C18 خرطوشة استخدام 3 مل من الاسيتو الانيتريل (ACN).
    2. حجته مع 5 مل من 5% تزاول، تفا 0.1% في ح2o.
    3. تحميل الببتيدات الاصطناعية النفط الخام في عمود C18 خرطوشة.
    4. يغسل مع 10 مل من 5% تزاول، تفا 0.1% في ح2o.
    5. الوت العينات مع 3 مل من 60% تزاول، 0.1% تفا ح2o.
  15. تحقق من الببتيدات بقياس الوزن الجزيئي باستخدام TOF استخدام الطيف الكتلي.
    1. "الماصة؛" 1 ميليلتر من الوينت على لوحة هدف. إضافة α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك الحمضية المشبعة (شكا) الحل فورا في الاسيتو الانيتريل 50% في حامض trifluoroacetic 0.1%
    2. بلورة هذا الخليط بالتجفيف.
    3. الحصول على الأطياف الشامل للعينات وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة الصك.
      1. تعيين يدوياً مطياف TOF استخدام أسلحة إلى إيجابية تعكس الوضع.
      2. معايرة مطياف كتلة استخدام شكا، وتفتيت براديكينين 1-7 (الوزن الجزيئي مونويسوتوبيك = دا 756.3997)، والثاني انجيوتنسين (الوزن الجزيئي مونويسوتوبيك = دا 1,045.5423).
      3. الحصول على الأطياف الشامل من الببتيدات الاصطناعية، وتقييم ثم بمقارنته مع الوزن الجزيئي النظرية.

2-إعداد مستخلصات الأنسجة

  1. تخدير الفئران الذكور الممثل المدني الدولي في تشكيل غرفة استنشاق isoflurane والتحقق من عمق التخدير عن طريق رشة أخمص القدمين. Euthanize الفئران بخلع عنق الرحم.
  2. باستخدام مقص، جعل شق البطن خط الوسط عن طريق تمديد الجلد حتى عملية الرهابه.
  3. قطع طريق الحجاب الحاجز وجمع جميع أنسجة الرئة. قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة.
  4. تغسل الأنسجة ثلاث مرات مع المالحة مخزنة تريس المثلج 50 مم (درجة الحموضة 7.4).
  5. وزن الأنسجة ونقل حوالي 100 ملغ أنسجة إلى أنبوب زجاج2 12 × 75 مم.
  6. أضف 0.3 مل من استخراج المخزن المؤقت (50 مم تريس-مخزن، درجة الحموضة 7.4، يحتوي على 0.1% بولي (أوكسيثيليني) أوكتيلفينيل البروم ثنائي الفينيل).
  7. مجانسة عينات أنسجة الرئة استخدام الخالطون خلط.
    1. تبريد العينات على الجليد.
    2. مجانسة العينات 20,000 لفة في الدقيقة لمدة 30 ثانية في خلاط. كرر هذه الخطوة حتى تكون العينات متجانسة تماما.
      ملاحظة: مجانسة ليس لأكثر من دقيقة واحدة بشكل مستمر، لتجنب زيادة في درجة الحرارة.
  8. نقل 1,000 ميليلتر من هوموجيناتي إلى أنبوب 1.5 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 10,000 ز x عند 4 درجة مئوية.
  9. نقل 500 ميليلتر من المادة طافية بأنبوب بلاستيكي 1.5 مل جديدة.
  10. استخدام 10 ميليلتر من العينة لتحديد تركيز البروتين، باستخدام أساليب مثل بيسينتشونينيك حمض (اتفاق التعاون الأساسي) أو أسلوب أخذ الرائعة الأزرق (مصرف البحرين المركزي).
  11. لمنع تجميد، أضف والغليسيرول 80% للعينات لتركيز نهائي والغليسيرول 50%.
  12. تخزين العينات في-80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

3-هضم ركائز في حوزتي النموذجي ومقتطفات الأنسجة

  1. إضافة 10 ميليلتر من 0.1 ميكروغرام/ميليلتر من N-توسيل-L-فينيلالاناين ثاني ميثيل كيتون (تبكك)-التربسين أو 0.1 ميكروغرام/ميليلتر من المكوّرات العنقودية المذهبة V8 حوزتي 10 ميكروغرام/ميليلتر من مقتطفات الأنسجة إلى 890 ميليلتر من المخزن المؤقت الهضم.
    1. لتوضيح الفرق في حوزتي خصوصية اعتماداً على درجة الحموضة، استخدام المخازن المؤقتة المعدلة للحموضة 3، 5 و 7 و 9. ويرد في الجدول 3تكوين المخزن المؤقت الهضم.
    2. تنفيذ عنصر تحكم سلبية استخدام حوزتي غير نشط في مقتطفات الأنسجة، أعدها حضانة في الماء المغلي (أو تدفئة في 100 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق.
  2. إضافة 10 ميليلتر من ركائز المسمى إيمينوبيوتين (حله في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، تركيز النهائي = 100 ميليلتر pmol/10).
  3. احتضان لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية لهضم ركائز المسمى إيمينوبيوتين.
  4. بعد الحضانة، توقف هضم ركائز مع الماء المغلي (أو تدفئة في 100 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق.
  5. الطرد المركزي ركائز الهضم لمدة 5 دقائق في 10,000 ز x عند 4 درجة مئوية.
  6. نقل المادة طافية في أنبوب 1.5 مل جديدة.

4-تنقية الركازة المسمى إيمينوبيوتين

  1. إضافة 50 ميليلتر من حبات سيفاروسي ستريبتافيدين 50% في 1 م تريس-المخزن المؤقت (pH 9) يحتوي على 0.1% poly(oxyethylene) أوكتيلفينيل الاثير.
    1. استخدم ورقة اختبار درجة الحموضة للتأكد من أن الحل حول الأس الهيدروجيني 9. إذا كان الرقم الهيدروجيني للحل منخفض، ضبطه على درجة الحموضة حوالي 9 بإضافة 1 م تريس-المخزن المؤقت (pH 9) يحتوي على 0.1% poly(oxyethylene) أوكتيلفينيل الاثير. هذه الخطوة غير هامة، كما أنها تنطوي على ربط الركازة المسمى إيمينوبيوتين إلى ستريبتافيدين.
  2. تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع خلط لطيف المستمر على عجلة المدورة لربط ركائز المسمى إيمينوبيوتين ستريبتافيدين. ينبغي أن تظل الخرز مع وقف التنفيذ في جميع أنحاء الحضانة.
  3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 10,000 ز x عند 4 درجة مئوية. إزالة المادة طافية.
  4. أغسل الخرز خمس مرات على النحو التالي:
    1. إضافة ميليلتر 1,000 المخزن المؤقت الغسيل (50 مم تريس-المخزن المؤقت، الرقم الهيدروجيني 9) الخرز.
    2. المياه والصرف الصحي لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية مع خلط لطيف المستمر على عجلة المدورة. ينبغي أن تظل الخرز مع وقف التنفيذ في جميع أنحاء الحضانة.
    3. الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 10,000 ز x عند 4 درجة مئوية وإزالة المادة طافية.
  5. إضافة 100 ميليلتر من حامض trifluoroacetic 0.2% الخرز.
    1. استخدم ورقة اختبار درجة الحموضة للتأكد من أن الحل يكمن في درجة الحموضة 2 أدناه. في حالة ارتفاع الرقم الهيدروجيني للحل، قم بضبط ال pH إلى أقل من 2 بإضافة حامض trifluoroacetic 1%.
  6. احتضان مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع خلط لطيف المستمر على عجلة المدورة.
  7. الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 10,000 ز x عند 4 درجة مئوية، ثم نقل المادة طافية إلى أنبوب 1.5 مل جديدة.

5-عينة من إعداد والليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين وقت الطيران الطيف الكتلي (TOF استخدام الطيف الكتلي)

ملاحظة: ينبغي إعداد كافة الحلول في الخطوات التالية مع كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك])-المياه تسلسل الصف الصف أو الأحماض الأمينية.

  1. "الماصة؛" 500 ميليلتر من الاسيتو الانيتريل على راتنج C18 لتنشيطه. إزالة الاسيتو الانيتريل المستخدمة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
  2. حجته على راتنج C18 مع 100 ميليلتر من حامض trifluoroacetic 0.1%. قم بإزالة في الوينت. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
  3. لتحميل العينات، ربط العينات الراتنج استخدام ماصة.
  4. أغسل الراتنج مع 20 ميليلتر من حامض trifluoroacetic 0.1%. كرر هذه الخطوة من خمس مرات.
  5. الوت العينات مع 3 ميليلتر من الاسيتو الانيتريل 60% في حامض trifluoroacetic 0.1%. "الماصة؛" الوينت على لوحة هدف لاستخدام TOF الكتلي. فور إضافة α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك الحمضية المشبعة (شكا) الحل في الاسيتو الانيتريل 50% في حامض trifluoroacetic 0.1%.
  6. بلورة هذا الخليط بالتجفيف.
  7. الحصول على الأطياف الشامل للعينات وفقا للبروتوكول صك الشركة المصنعة.
    1. تعيين يدوياً مطياف TOF استخدام أسلحة إلى إيجابية تعكس الوضع.
    2. معايرة مطياف كتلة استخدام شكا، وتفتيت براديكينين 1-7 (الوزن الجزيئي مونويسوتوبيك = دا 756.3997)، والثاني انجيوتنسين (الوزن الجزيئي مونويسوتوبيك = دا 1,045.5423).
    3. الحصول على الأطياف الشامل من العينات، وإيلاء اهتمام وثيق للاطياف الشامل من 700 إلى 900 دا للنموذج ملصوق من ركائز المسمى البيوتين.
  8. التعرف على قمم المكتشفة باستخدام الجدول 1. الكشف عن الوزن الجزيئي مناسبة تشير إلى انشقاق في ج-محطة الأحماض الأمينية ذات الصلة.

النتائج

تقييم طريقة للتعرف على خصوصية حوزتي بحوزتي النموذجي

وكان تقييم كفاءة هذا النظام باستخدام تبكك-التربسين وحوزتي V8، خصوصيات الركيزة التي تم الحصول عليها. وقدرت تبكك-التربسين وحوزتي V8 تنشق تسلسل الأحماض الأمينية في ج--المحطة طرفية مخلفات يسي?...

Discussion

هذا البروتوكول يستخدم TOF استخدام الطيف الكتلي للتعرف على خصوصية حوزتي في عينات النفط الخام المستمدة من مستخلصات الأنسجة ويمكن الارتقاء بسهولة لتجهيز نماذج متعددة. على وجه الخصوص، نحن التلاعب بدرجة الحموضة تسبب تغييرا في خصوصية الركازة.

واستخدمت الطريقة (ABC) عبدين-البيوتين ...

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل جزئيا "منحة بحثية جامعة نيهون الصيدلانية" من جامعة نيهون الصيدلانية (2016) و JP17854179 رقم المنحة كاكينهي يأمرون.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)
aminomethyl]phenoxy resin)		Watanabe Chemical Co., Ltd.A00102
N,N-dimethylformamide (DMF)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00185
piperidineWatanabe Chemical Co., Ltd.A00176
trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)WAKO Chemical209-1483
O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00067
1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00014
diisopropylethylamine (DIPEA)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00030
triisopropylsilane (TIS)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00170
ethanedithiol (EDT)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00057
trifluoroacetic acid (TFA)MilliporeS6612278 403
acetonitrileKokusan Chemical2153025
C18 cartridge columnWatersWAT051910
poly(oxyethylene) octylphenyl etherWAKO Chemical168-11805Triton X-100
mixing homogenizerKinematicaPT3100polytron homogenizer
Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250Nakarai Chemical094-09
glycerolNakarai Chemical170-18
N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsinSigma-AldrichT1426
dimethyl sulfoxide (DMSO)WAKO Chemical043-07216
streptavidin sepharoseGE Healthcare17-511-01
ZipTipC18MilliporeZTC18S096
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)Sigma-AldrichC2020
MALDI-TOF mass spectrometryBruker Daltonics, Germanyautoflex
2-iminobiotinSigma-AldrichI4632
Fmoc-amino acidsWatanabe Chemical Co., Ltd.

References

  1. Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
  2. Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
  3. Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
  4. Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
  5. Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
  6. Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
  7. Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
  8. Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
  9. Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
  10. Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
  11. Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
  12. Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
  13. Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
  14. Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135 TOF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved