A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a especificidade da protease no tecido cru rato extratos usando espectrometria de MALDI-TOF.

Resumo

Proteases têm várias funções biológicas, incluindo a digestão de alimentos e ativação/inativação de proteínas. Identificar a especificidade da protease é importante por revelar a função de protease. O método proposto neste estudo determina a especificidade de protease medindo-se o peso molecular de substratos exclusivos usando Matrix-assisted Laser dessorção/ionização de espectrometria de massa de tempo-de-voo (MALDI-TOF). Os substratos contêm iminobiotin, enquanto o site clivado consiste de aminoácidos, e o espaçador é composto por polietileno glicol. O substrato clivado irá gerar um único peso molecular, usando um ácido aminado clivado. Um dos méritos desse método é que pode ser efectuada em uma panela, usando amostras brutas, e é também adequado para avaliar várias amostras. Neste artigo, descrevemos um método experimental simples otimizado com amostras extraídas do tecido do pulmão do rato, incluindo a extracção de tecido, colocação de substratos digestivos em amostras, purificação de substratos digestivos sob condições de pH diferente e medição de peso molecular dos substratos, utilizando espectrometria de massa MALDI-TOF. Em resumo, esta técnica permite a identificação da especificidade da protease em amostras brutas derivado de extratos de tecido usando espectrometria de massa MALDI-TOF, que facilmente pode ser ampliada para múltiplo processamento de amostra.

Introdução

Proteases regulam processos fisiológicos por clivagem de proteínas, e o início da atividade de protease em horários específicos e locais é regulamentado¹. Portanto, é importante identificar a expressão e a atividade dos tecidos que são regulamentados localmente e desenvolver um novo método para detectar proteases. O método proposto neste estudo visa identificar a especificidade da protease em paralelo para detecção de proteases.

Existem alguns métodos para a detecção de especificidade de protease. O método azocasein é conhecido por sua utilização na detecção de proteases² mas é limitado em sua capacidade de obter mais informações. Zimografia é outro método de deteção de protease abrangente que pode ser usado para determinar o peso molecular de proteases³, mas não pode ser usado para examinar a especificidade de substrato. Especificidade de protease pode ser determinada por ensaios de espectrometria, usando substratos tais como p-nitroanilide⁴e ensaios fluorométrica, utilizando substratos de cumarina⁵ ou de ensaios de fluorescência ressonância energia transferência (FRET)⁶. Estes métodos permitem a detecção de single-especificidade de substratos contidos em um único poço. No presente estudo, a especificidade de protease de extratos de tecido é examinada sob várias condições, como estes extratos contêm várias proteases. Atividade de protease é regulada por vários fatores, incluindo pH, coenzimas, grupos prostético e força iônica. Recentemente, métodos baseados em proteômica têm sido usados para identificar a especificidade da protease; por exemplo, o método relatado por Biniossek et al. ⁷ usa a proteoma para determinar a especificidade de substrato mesmo em extratos brutos e permite a determinação exata da atividade de proteases que reconhecer várias sequências de aminoácidos⁸clivagem. No entanto, esse método não é adequado para a análise de várias amostras. Em contraste, o nosso método permite o processamento simultâneo de várias amostras e o uso de Matrix-Assisted Laser dessorção/ionização tempo-de-voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa para análise de amostra facilita a detecção rápida e fácil do clivada substratos.

Este artigo descreve um método para avaliar a especificidade do protease usando espectrometria de massa MALDI-TOF para medir o peso molecular de substratos exclusivos. As formas moleculares de substratos clivados, juntamente com seus pesos moleculares teóricos, são mostradas na Figura 1 e tabela 1. Estudos anteriores têm utilizados substratos contendo polyglycine espaçadores e biotina⁹; no entanto, estes substratos são falhos porque a sequência de polyglycine pode ser clivada por enzimas que reconhecem a sequência de glicina. Além disso, a alta afinidade entre avidina e biotina pode levar a uma taxa de recuperação de baixo. Para melhorar estes inconvenientes, neste estudo que nós sintetizado um substrato original, que era composto de polietileno glicol (PEG), iminobiotin e um aminoácido que pode identificar o local de clivagem (Figura 1). Para discriminar entre aminoácidos de peso moleculares similares, D-serina foi adicionado entre o espaçador de PEG e o aminoácido no site entalhado.

O N-terminal do substrato foi rotulado com iminobiotin, que permite a purificação da afinidade de amostras brutas. O uso de iminobiotin em vez de biotina é crítico; Biotina tem uma forte afinidade com avidina, que resulta em taxas de baixa recuperação de substratos de biotina-rotulado de resina avidin, enquanto a afinidade do iminobiotin para avidin pode ser alterada por pH. Iminobiotin-rotulado substratos irão ligar para avidin nas condições acima pH 9, enquanto avidin libera substratos iminobiotin-etiquetadas em condições abaixo de pH 4. Portanto, iminobiotin foi usado para purificação de afinidade¹⁰. Em resumo, nós descrevemos um protocolo detalhado para a detecção de especificidade de protease usando substratos exclusivos.

Protocolo

Protocolos experimentais animais foram aprovados pelo Comitê de ética da Universidade Nihon farmacêutico e realizados em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório da Universidade Nihon farmacêutico. O protocolo foi ajustado para extratos de tecido derivados de camundongos ICR. Camundongos ICR foram comprados de Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japão)

1. preparação do substrato Iminobiotin-etiquetado

O substrato sofre a fase sólida síntese usando grupo 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-protegido aminoácidos, conforme descrito abaixo de¹¹. Use a tabela 2 para determinar o Fmoc-composto usado, dependendo do aminoácido desejado e fase de síntese.

1. Swill 0,2 g de resina de Fmoc-NH-SAL com 10 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) em uma coluna de síntese.
2. Adicione 5 mL de piperidina de 30% em DMF. A solução por 10 min cravar o Fmoc-grupo de rock.
3. Confira Fmoc clivagem com o ácido trinitrobenzenesulfonic (neutrófilos) teste¹²: adicionar 10 µ l de 1% neutrófilos em DMF e 10 µ l de diisopropylethylamine (DIPEA) para um tubo de vidro de² 10 x 75 mm e, em seguida, transferir uma pequena quantidade de resina para o vidro do tubo. A resina de Fmoc-clivada deve desenvolver uma cor laranja.
   1. Repita os passos 1,2-1,3 se este resultado é negativo.
4. Lave a resina três vezes com 5 mL de DMF.
5. Adicionar 5 mL de DMF contendo 0,3 mmol do Fmoc-composto listado na tabela 2 (começando com o composto usado na etapa 1), 0,3 mmol de Hexafluorofosfato de O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium (HCTU), 0,3 mmol de 1- Hidroxilado-1H-benzotriazol, monohidrato (HOBt) e 0,6 mmol de diisopropylethylamine (DIPEA). Agitar a solução durante 30 min acoplar com a resina.
   1. Verifique este passo com o teste de neutrófilos. Se o resultado for positivo, isso significa que a reação não tem progredido suficientemente e este passo deve ser repetido.
6. Lave a resina três vezes com 5 mL de DMF.
7. Repeti a reação de alongamento, repetindo as etapas 1.2-1.6, mudando o Fmoc-composto usado na etapa 1.5 de acordo com a tabela 2.
8. Adicionar 1 mL de água de 2,5%, 1% triisopropylsilane (TIS) e 2,5% Etanoditiol (EDT) em ácido trifluoroacético para clivar peptídeos dos grupos resina e proteção. Agitar a solução durante 60 min.
9. Filtrar e recolher o filtrado em um tubo de 50 mL.
10. Adicionar 40 mL de álcool etílico frio e loja durante a noite a-20 ° C.
11. Centrífuga 4.000 x g a-20 ° C durante 30 min. coletar o sedimento.
12. Use um dessecador para 3h para remover o éter etílico.
13. Adicione 1 mL de acetonitrilo 50% de água e dissolver os peptídeos brutos. Lyophilize a solução para remover o ácido trifluoroacético. Repita este passo várias vezes.
14. Purifica os peptídeos usando uma coluna de cartucho C18.
    1. Ative a resina na coluna C18 cartucho usando 3 mL de acetonitrila (ACN).
    2. Equilibrar com 5 mL de 5% do Grupo ACN, 0,1% TFA em H₂O.
    3. Carrega os peptídeos sintéticos brutos na coluna C18 do cartucho.
    4. Lavar com 10 mL de 5% do Grupo ACN, 0,1% TFA em H₂O.
    5. Eluir as amostras com 3 mL de 60% ACN, 0,1% TFA em H₂O.
15. Verifique os peptídeos medindo seu peso molecular usando espectrometria de massa MALDI-TOF.
    1. Pipete 1 µ l de eluente numa placa de destino. Adicione imediatamente a solução ácida (CHCA) α-cyano-4-hidroxicinâmicos saturada em 50% acetonitrila em ácido trifluoroacético de 0,1%
    2. Cristalizar a mistura por secagem ao ar.
    3. Aquisição de espectros de massa das amostras de acordo com o protocolo do fabricante instrumento.
       1. Definir manualmente o espectrômetro de massa MALDI-TOF para um positivo refletir de modo.
       2. Calibrar o espectrômetro de massa usando CHCA, bradicinina fragmento 1-7 (peso molecular de monoisotópico = Da 756.3997) e da angiotensina II (peso molecular de monoisotópico = Da 1,045.5423).
       3. Adquirir os espectros de massa de peptídeos sintéticos e em seguida avaliar, comparando-o com o peso molecular teórico.

2. preparação dos extratos de tecido

1. Anestesiar os ratos masculinos ICR em uma câmara de inalação de isoflurano e verificar a profundidade de anestesia através de pitada de dedo do pé. Eutanásia em ratos por deslocamento cervical.
2. Usando a tesoura, faça uma incisão abdominal através da pele, estendendo até o processo xifoide.
3. Corte através do diafragma e recolher todo o tecido pulmonar. Corte o tecido em pequenos pedaços.
4. Lave o tecido três vezes com gelada 50 mM Tris salino (pH 7,4).
5. Pese os tecidos e a transferência de cerca de 100 mg de tecidos para um tubo de vidro 12 x 75 mm² .
6. Adicione 0,3 mL de tampão de extração (Tris-tampão, pH 7,4, contendo 0,1% de éter de octilfenil poli (oxietileno) de 50 mM).
7. Homogeneizar as amostras de tecido de pulmão usando um misturando homogenizador.
   1. Fixe as amostras no gelo.
   2. Homogeneizar as amostras a 20.000 rpm para 30 s em um liquidificador. Repita este passo até que as amostras são completamente homogêneas.
      Nota: Não homogeneizar durante mais de 1 minuto continuamente, a fim de evitar um aumento de temperatura.
8. Transferência de 1.000 µ l do homogeneizado para um tubo de 1,5 mL e centrifugar durante 5 min à 10.000 x g a 4 ° C.
9. Transferi 500 µ l do sobrenadante para um novo tubo de plástico de 1,5 mL.
10. Use 10 µ l da amostra para determinar a concentração de proteína, usando métodos como o bicinchoninic ácido (BCA) ou o método de Coomassie brilhante azul (CBB).
11. Para evitar o congelamento, adicione glicerol 80% para as amostras para uma concentração final de glicerol a 50%.
12. Armazene as amostras a-80 ° C até utilização posterior.

3. digestão de substratos no modelo Protease e extratos de tecido

1. Adicionar 10 µ l de 0,1 µ g / µ l de cetona de clorometil N-Tosil-L-fenilalanina (TPCK)-tripsina, 0,1 µ g / µ l de protease de Staphylococcus aureus V8 ou 10 µ g / µ l dos extratos de tecido em 890 µ l de um buffer de digestão.
   1. Para esclarecer a diferença na especificidade da protease dependendo do pH, use buffers ajustados ao pH 3, 5, 7 e 9. A composição do buffer digestão é mostrada na tabela 3.
   2. Efectue um controlo negativo usando protease inactiva em extratos de tecido, preparados pela incubação em água fervente (ou aquecimento a 100 ° C) por 10 min.
2. Adicionar 10 µ l de substratos iminobiotin-rotulado (dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO), concentração final = 100 µ l de pmol/10).
3. Incube durante 3 horas a 37 ° C para digerir substratos iminobiotin-rotulados.
4. Após a incubação, pare a digestão de substratos com água a ferver (ou por aquecimento a 100 ° C) por 10 min.
5. Centrifugue os substratos digeridos durante 5 min à 10.000 x g a 4 ° C.
6. Transferi o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.

4. purificação do substrato Iminobiotin-etiquetado

1. Adicione 50 µ l de grânulos de sepharose streptavidin 50% em 1 M-tampão Tris (pH 9) contendo 0,1% poly(oxyethylene) octilfenil éter.
   1. Use papel de teste de pH para garantir que a solução é em torno de pH 9. Se o pH da solução é baixo, ajustá-lo para aproximadamente pH 9, adicionando 1 M-tampão Tris (pH 9) contendo 0,1% poly(oxyethylene) octilfenil éter. Esta etapa é importante, já que envolve a ligação do substrato iminobiotin-rotulado de estreptavidina.
2. Incube durante uma noite a 4 ° C, com uma mistura suave contínua em uma roda de rotator para ligar os substratos iminobiotin-rotulado o streptavidin. Os grânulos devem permanecer suspensos durante a incubação.
3. Centrífuga para 1 min a 10.000 x g a 4 ° C. Remova o sobrenadante.
4. Lave os grânulos cinco vezes como segue:
   1. Adicione 1.000 µ l de um tampão de lavagem (50 mM Tris-tampão, pH 9) para as contas.
   2. Lavagem por 10 min a 4 ° C, com uma mistura suave contínua em uma roda de rotator. Os grânulos devem permanecer suspensos durante a incubação.
   3. Centrifugar por 1 min a 10.000 x g a 4 ° C e remover o sobrenadante.
5. Adicione 100 µ l de ácido trifluoroacético de 0,2% para os grânulos.
   1. Use papel de teste de pH para garantir que a solução está abaixo de pH 2. Se o pH da solução é alto, ajuste o pH para abaixo de 2 adicionando ácido trifluoroacético de 1%.
6. Incube durante 30 min à temperatura ambiente com mistura suave contínua em uma roda de rotator.
7. Centrifugar por 1 min a 10.000 x g a 4 ° C e, em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.

5. preparação e espectrometria de massa (espectrometria de massa MALDI-TOF) tempo-de-voo de dessorção/ionização Matrix-Assisted Laser da amostra

Nota: Todas as soluções nas etapas a seguir devem ser preparadas com a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)-água de sequenciamento-grau grau ou aminoácido.

1. Pipete 500 µ l de acetonitrilo para uma resina C18 para ativá-lo. Remova o acetonitrilo usado. Repita este passo 3 vezes.
2. Equilibrar a resina C18 com 100 µ l de ácido trifluoroacético de 0,1%. Remova o eluente. Repita este passo 3 vezes.
3. Para carregar as amostras, vincule as amostras para a resina com uma pipeta.
4. Lave a resina com 20 µ l de ácido trifluoroacético de 0,1%. Repita essa etapa cinco vezes.
5. Eluir as amostras com 3 µ l de acetonitrilo 60% em ácido trifluoroacético de 0,1%. Pipete o eluente numa placa de destino por espectrometria de massa MALDI-TOF. Adicione imediatamente a solução ácida (CHCA) α-cyano-4-hidroxicinâmicos saturada em 50% acetonitrila em ácido trifluoroacético de 0,1%.
6. Cristalizar a mistura por secagem ao ar.
7. Aquisição de espectros de massa das amostras de acordo com o protocolo do fabricante do instrumento.
   1. Definir manualmente o espectrômetro de massa MALDI-TOF para um positivo refletir de modo.
   2. Calibrar o espectrômetro de massa usando CHCA, bradicinina fragmento 1-7 (peso molecular de monoisotópico = Da 756.3997) e da angiotensina II (peso molecular de monoisotópico = Da 1,045.5423).
   3. Adquira os espectros de massa das amostras, prestando atenção aos espectros de massa de 700 a 900 para a forma clivada de substratos biotina-rotulados.
8. Identifica os picos detectados usando a tabela 1. Deteção do peso molecular adequado indica clivagem no C-terminal do aminoácido relevante.

Resultados

Avaliação do método para a identificação da especificidade de protease por protease modelo

A eficiência deste sistema foi avaliada usando TPCK-tripsina e protease V8, cujas especificidades do substrato foram obtidas. TPCK-tripsina e protease V8 foram estimados para clivar a sequência de aminoácidos no C-terminal dos resíduos lisina e arginina e no lado de carboxila do ácido aspártico e ácido glutâmico resíduos, respec...

Discussão

Este protocolo utiliza a espectrometria de massa MALDI-TOF para identificar a especificidade de protease em amostras brutas derivado de extratos de tecido e facilmente pode ser ampliado para múltiplo processamento de amostra. Em particular, estamos manipulados pH para causar uma mudança na especificidade de substrato.

O método (ABC) complexo avidina-biotina, que tem sido amplamente utilizado em bioquímica devido à sua especificidade de ligação, foi utilizado em nosso protocolo. Devido a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00102
N,N-dimethylformamide (DMF)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00185
piperidine	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00176
trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)	WAKO Chemical	209-1483
O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00067
1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00014
diisopropylethylamine (DIPEA)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00030
triisopropylsilane (TIS)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00170
ethanedithiol (EDT)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00057
trifluoroacetic acid (TFA)	Millipore	S6612278 403
acetonitrile	Kokusan Chemical	2153025
C18 cartridge column	Waters	WAT051910
poly(oxyethylene) octylphenyl ether	WAKO Chemical	168-11805	Triton X-100
mixing homogenizer	Kinematica	PT3100	polytron homogenizer
Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250	Nakarai Chemical	094-09
glycerol	Nakarai Chemical	170-18
N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin	Sigma-Aldrich	T1426
dimethyl sulfoxide (DMSO)	WAKO Chemical	043-07216
streptavidin sepharose	GE Healthcare	17-511-01
ZipTipC18	Millipore	ZTC18S096
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)	Sigma-Aldrich	C2020
MALDI-TOF mass spectrometry	Bruker Daltonics, Germany	autoflex
2-iminobiotin	Sigma-Aldrich	I4632
Fmoc-amino acids	Watanabe Chemical Co., Ltd.