마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작

요약

여기, 선물이 원유 마우스 조직에서 효소 특이성을 결정 하는 프로토콜 MALDI TOF 분석을 사용 하 여 추출.

초록

프로 테아 제 단백질 활성화/비활성화 및 음식 소화를 포함 하 여 여러 생물 학적 기능을가지고. 효소 특이성을 식별 하는 것이 효소 기능을 공개에 대 한 중요 합니다. 이 연구에서 제안 된 메서드는 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화를 사용 하 여 독특한 기판의 분자량을 측정 하 여 효소 특이성을 결정 합니다 시간의 비행 (TOF MALDI) 질량 분석. 기판 포함 iminobiotin, 쪼개진된 사이트 구성 아미노산, 그리고는 스페이서 이루어져 있다 폴 리 에틸렌 글리콜. 쪼개진된 기판 독특한 분자량 쪼개진된 아미노산을 사용 하 여 생성 됩니다. 이 방법의 장점 중 하나입니다 그것은 원유 샘플을 사용 하 여 한 냄비에 실행 될 수 있습니다 그리고 그것은 또한 여러 샘플을 평가 적합. 이 문서에서는, 우리는 마우스 폐 조직, 조직 추출, 소화 기판의에 배치 샘플, 다른 pH 조건 하에서 소화 기판의 정화 등에서 추출 하는 샘플으로 최적화 하는 간단한 실험 방법 설명 및 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 기판의 분자량의 측정. 요약 하자면,이 기술은 여러 샘플 처리에 대 한 쉽게 확장 될 수 있습니다 하는 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 조직 추출에서 파생 하는 원유 샘플에서 효소 특이성의 식별에 대 한 수 있습니다.

서문

프로 테아 제, 단백질 절단형에 의해 생리 적 프로세스 조절 그리고 특정 시간과 장소에서 효소 활동의 개시는 규제¹. 그러므로 식 및 로컬 규제, 조직의 활동을 식별 하 고 프로 테아 제를 감지 하는 새로운 방법을 개발 하는 것이 중요 하다. 에 제안 된 방법은이 연구 프로 테아 제를 감지 하는 동시에 효소 특이성을 식별 하는 것을 목표로.

효소 특이성을 탐지 하기 위한 몇 가지 방법이 있습니다. Azocasein 메서드는 프로 테아 제² 의 검출에 사용을 위해 유명 하다 그러나 추가 정보를 얻을 하는 능력에 제한 된다. Zymography 프로 테아 제³의 분자량을 결정 하는 데 사용할 수 있는 또 다른 종합 효소 검출 방식 이지만 기질 특이성을 검사 하는 데 사용할 수 없습니다. 효소 특이성 spectrometric 분석, 기판 p-nitroanilide⁴, 등을 사용 하 여 및 fluorometric 분석 실험, coumarin 기판⁵ 또는 형광 공명 에너지 전송 (무서 워) 분석 실험⁶을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 이 메서드는 단일 잘에서 포함 하는 기판의 단일 특이성 탐지를 사용. 현재 연구에서 이러한 추출 물 포함 여러 프로 테아 제 효소 특이성 조직 추출의 다양 한 조건에서 검사 합니다. 효소 활동은 pH, 코엔자임, prosthetic 그룹, 이온 강도 등 여러 가지 요인에 의해 통제 된다. 최근, proteomics 기반 방법 효소 특이성;을 식별 하기 위해 사용 되었습니다. 예를 들어, Biniossek 외에서 보고 하는 방법. ⁷ 조 추출 물에도 기질 특이성을 결정 하는 프로테옴을 사용 하 고 여러 아미노산 시퀀스⁸을 인식 하는 프로 테아의 분열 활동의 정확한 결심을 허용 한다. 그러나,이 메서드는 수많은 샘플의 분석에 적합 하지. 우리의 메서드 여러 샘플의 동시 처리 및 Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화의 사용을 사용 하는 반면, 시간의 비행 (TOF MALDI)는 쪼개진의 신속 하 고 쉽게 감지 샘플 분석을 위한 질량 분석에 용이 하 게 기판입니다.

이 종이 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 독특한 기판의 분자량을 측정 하 여 효소 특이성을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 그들의 이론적 분자 무게, 함께 쪼개진된 기판의 분자 형태는 그림 1 과 표 1에 표시 됩니다. 이전 연구 polyglycine 스페이서 및 biotin⁹;를 포함 하는 기판 사용 그러나, 이러한 기판 polyglycine 시퀀스 글리신 시퀀스를 인식 하는 효소에 의해 죽 습 있을 수 있습니다 때문에 결함이 있습니다. 또한, avidin 비타민 b 복합체 사이 높은 선호도 낮은 회복 율을 이어질 수 있습니다. 하 우리는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG), iminobiotin, 및 분열 사이트 (그림 1)을 식별할 수 있는 아미노산의 구성 되었다 독특한 기질 합성이 연구에서는 이러한 단점에 향상. 유사한 분자 무게의 아미노산 사이 차별, D-떠들고 못 스페이서 사이 쪼개진된 사이트에서 아미노산 추가 되었습니다.

기판의 N 맨끝 원유 샘플에서 친 화력 정화를 가능 하 게 iminobiotin로 분류 됐다. Biotin 대신 iminobiotin의 사용은 매우 중요; biotin은 avidin, avidin에 대 한 iminobiotin의 선호도 pH에 의해 변경 될 수 있습니다 동안 avidin 수 지에서 biotin 표시 된 기판의 낮은 회수율 결과와 강한 선호도 하고있다. Iminobiotin 표시 된 기판 avidin pH 4 아래 조건에서 기판 iminobiotin 표시를 해제 하는 동안 pH 9, 위의 조건에서 avidin에 바인딩합니다. 따라서, iminobiotin는 친 화력 정화¹⁰사용 되었다. 요약, 우리는 독특한 기질을 사용 하 여 효소 특이성을 탐지 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

프로토콜

동물 실험 프로토콜 일본 제약 대학 윤리 위원회에 의해 승인 되었고 관심과 일본 제약 대학의 실험 동물의 사용에 대 한 지침에 따라 수행. 프로토콜 조직 추출 물의 ICR 생쥐에서 파생 된에 대 한 조정 되었습니다. ICR 생쥐 일본 SLC 회사 (일본 시즈오카)에서 구입 했다

1. Iminobiotin 표시 된 기판의 준비

기판 겪 습 9-fluorenylmethyloxycarbonyl 그룹 (Fmoc)를 사용 하 여 고체 상 합성-¹¹아래 설명 된 대로 아미노산을 보호. 표 2 를 사용 하 여 원하는 아미노산 및 합성의 단계에 따라 사용 Fmoc 화합물 결정.

1. N, N-dimethylformamide (DMF) 합성 열에서의 10 mL와 Fmoc-NH-샐 수 지의 0.2 g 맛있게
2. DMF에 30 %piperidine 5 mL를 추가 합니다. Fmoc 그룹을 쪼개 10 분 솔루션 바위.
3. 체크 trinitrobenzenesulfonic 산 (TNBS) Fmoc 분열 테스트¹²: 1%의 추가 10 µ L DMF에 diisopropylethylamine (DIPEA) 10 x 75 m m² 유리 튜브, 다음 전송 작은 양의 수 지는 유리의 10 µ L TNBS 튜브. Fmoc 죽 습 수 지는 오렌지 색상을 개발 해야 합니다.
   1. 이 결과 부정적인 경우 1.2-1.3 단계를 반복 합니다.
4. 워시 DMF의 5 mL로 3 회 수 지.
5. O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU), 1-0.3 m m o l의 0.3 m m o l (단계 1에서에서 사용 하는 화합물으로 시작), 표 2에 나열 된 Fmoc 화합물의 0.3 m m o l을 포함 하는 DMF의 5 mL을 추가 Hydroxy 1 H benzotriazole, 토스 (HOBt), 그리고 diisopropylethylamine (DIPEA)의 0.6 m m o l. 30 분 수 지와 함께 몇 가지 솔루션을 바위.
   1. TNBS 테스트와 함께이 단계를 확인 합니다. 결과가 긍정적인 경우에, 즉, 반응이 충분히 진행 되지 하 고이 단계를 반복 해야 합니다.
6. 워시 DMF의 5 mL로 3 회 수 지.
7. 1.2-1.6, 표 2에 따라 1.5 단계에서 사용한 Fmoc 복합 변경 단계를 반복 하 여 신장 반응을 반복 합니다.
8. 2.5% 물의 1 mL을 추가 1 %triisopropylsilane (TIS), 그리고 2.5 %ethanedithiol (EDT)에 trifluoroacetic 산 수 지와 보호 그룹에서 펩 티 드를 쪼개 다. 60 분에 대 한 솔루션을 바위.
9. 필터, 및 50 mL 튜브에는 filtrate 수집.
10. -20 ° c.에 하룻밤 찬 diethyl 에탄올과 저장소의 40 mL를 추가
11. 30 분 동안-20 ° C에서 원심 분리기 4000 x g 펠 릿을 수집 합니다.
12. 3 h desiccator를 사용 하 여 diethyl 에테르를 제거.
13. 물 50% 이기의 1 mL을 추가 하 고 원유 펩 티 드를 분해. Trifluoroacetic 산을 제거 하는 솔루션 lyophilize 이 단계를 여러 번 반복 합니다.
14. C18 카트리지 열을 사용 하 여 펩 티 드를 정화.
    1. C18 카트리지 열 이기 (ACN)의 3 mL를 사용 하 여에 수 지를 활성화 합니다.
    2. 5 %ACN, H₂o. 0.1 %TFA 5 mL와 함께 equilibrate
    3. C18 카트리지 열에 원유 합성 펩 티 드를 로드 합니다.
    4. 5 %ACN, H₂o. 0.1 %TFA 10 mL로 씻어
    5. 60%의 3 mL과 샘플을 elute ACN, 0.1% TFA H₂o.
15. TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 그들의 분자량을 측정 하는 펩 티 드를 확인 합니다.
    1. Eluent 대상 접시에의 1 µ L 플라스틱 0.1 %trifluoroacetic 산에서 50% 이기에 포화 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA) 솔루션을 즉시 추가
    2. 공기에서 혼합물을 구체화.
    3. 악기 제조 업체의 프로토콜에 따라 시료의 질량 스펙트럼을 취득 합니다.
       1. 수동으로 설정 긍정적인에 MALDI TOF 질량 분석기 모드를 반영 합니다.
       2. CHCA를 사용 하 여 질량 분석기 보정, bradykinin 조각 1-7 (monoisotopic 분자량 = 756.3997 Da), 그리고 angiotensin II (monoisotopic 분자 무게 1,045.5423 다 =).
       3. 합성 펩 티 드의 질량 스펙트럼을 취득 하 고 이론적인 분자 무게와 비교 하 여 평가 합니다.

2입니다. 조직 추출의 준비

1. Anesthetize 남성 ICR 마우스 isoflurane 흡입 챔버에 고 발가락 핀치를 통해 마 취 깊이 확인 합니다. 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 안락사.
2. 가 위를 사용 하 여, 칼 과정까지 확장 하는 피부를 통해 복 부 절 개를 중간 확인 합니다.
3. 횡 경 막 통해 잘라내어 수집 모든 폐 조직. 조직의 작은 조각으로 잘라.
4. 씻어 얼음 50 mM Tris 버퍼 식 염 수 (pH 7.4)와 세 번 조직.
5. 조직 및 12 x 75 m m² 유리 튜브에 전송 조직의 약 100 밀리 그램 무게.
6. 추출 버퍼 (50 mM Tris 버퍼, pH 7.4, 0.1% 폴 리 (oxyethylene) octylphenyl 에테르를 포함)의 0.3 mL를 추가 합니다.
7. 폐 조직 샘플 혼합 균질 화기를 사용 하 여 균질
   1. 차가운 얼음에 샘플.
   2. 30에 대 한 20000 rpm에서 샘플을 균질 믹서 기에 s. 샘플은 완전히 동 질 때까지이 단계를 반복 합니다.
      참고: 온도 증가 피하기 위해 1 분 이상 계속 하지 균질 할.
8. 1.5 mL 튜브 4 ° c.에 10000 x g에 5 분 동안 원심 분리기에는 homogenate의 1000 µ L를 전송
9. 새로운 1.5 mL 플라스틱 튜브에는 상쾌한의 500 µ L를 전송.
10. 단백질 농도, bicinchoninic 산 (BCA) 같은 메서드 또는 Coomassie 화려한 블루 (CBB) 메서드를 사용 하 여 결정 하는 샘플의 10 µ L을 사용 합니다.
11. 동결을 방지 하기 위해 50% 글리세롤의 최종 농도 대 한 샘플을 80% 글리세롤을 추가 합니다.
12. 추가 사용까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.

3. 기판 모델 효소와 조직 추출에서의 소화

1. N-토실기-L-페닐알라닌 chloromethyl 케 톤 (TPCK)의 0.1 µ g / µ L의 10 µ L 추가-트립 신, 황색 포도 상 구 균 V8 protease의 µ 0.1 µ g/L 또는 소화 버퍼의 890 µ L에 조직 추출의 µ 10 µ g/L.
   1. PH에 따라 효소 특이성에 차이 명확 하 게, 3, 5, 7, 및 9의 pH를 조정 하는 버퍼를 사용 합니다. 소화 버퍼의 구성 표 3에 표시 됩니다.
   2. 조직 추출 물, 10 분 동안 끓는 물 (또는 100 ° C에서 난방) 외피에 의해 준비에 비활성 효소를 사용 하 여 부정적인 제어를 실시 합니다.
2. Iminobiotin 표시 된 기판의 10 µ L 추가 (디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 최종 농도에 녹아 = 100 pmol/10 µ L).
3. Iminobiotin 표시 된 기판 소화 37 ° C에서 3 시간 동안 품 어.
4. 부 화, 후 10 분 동안 끓는 물 (또는 100 ° C에서 난방) 기판의 소화를 중지 합니다.
5. 10000 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 소화 기판 원심
6. 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 합니다.

4. Iminobiotin 표시 된 기판의 정화

1. 1 M Tris 버퍼 (pH 9) 포함 0.1% poly(oxyethylene) octylphenyl 에테르에 50% streptavidin sepharose 구슬의 50 µ L를 추가 합니다.
   1. PH 테스트 종이 사용 하 여 pH 9 주위에 솔루션을. 솔루션의 산도 낮은 경우에, 1 M Tris 버퍼 (pH 9) 포함 0.1% poly(oxyethylene) octylphenyl 에테르를 추가 하 여 약 pH 9 조정 합니다. 이 단계는 streptavidin는 iminobiotin 표시 된 기판의 바인딩을 포함 하기 때문에 중요 한.
2. streptavidin iminobiotin 표시 된 기판 바인딩할 회전 바퀴에 지속적인 부드러운 혼합으로 4 ° C에서 밤새 품 어. 비즈는 부 화에 걸쳐 일시 중단 된 유지 됩니다.
3. 4 ° c.에 10000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기 제거는 상쾌한.
4. 다음과 같이 구슬 5 번 세척.
   1. 구슬에 워시 버퍼 (50 mM Tris 버퍼, pH 9)의 1000 µ L를 추가 합니다.
   2. 회전 바퀴에 지속적인 부드러운 혼합으로 4 ° C에서 10 분 동안 세척. 비즈는 부 화에 걸쳐 일시 중단 된 유지 됩니다.
   3. 4 ° C에서 10000 x g에서 1 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다.
5. 구슬에 0.2 %trifluoroacetic 산의 100 µ L를 추가 합니다.
   1. PH 테스트 종이 사용 하 여 pH 2 아래 솔루션을. 솔루션의 산도 높은 경우에, 1 %trifluoroacetic 산을 추가 하 여 2 아래에 pH를 조정 합니다.
6. 회전 바퀴에 지속적인 부드러운 혼합으로 실 온에서 30 분 동안 품 어.
7. 4 ° C에서 10000 x g에서 1 분 동안 centrifuge 다음 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 합니다.

5. 샘플 준비와 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 질량 분석 (TOF MALDI 질량 분석)

참고: 다음 단계에서 모든 솔루션은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)으로 준비 되어야 한다-학년 또는 아미노산 시퀀싱 급 물.

1. 그것을 활성화 C18 수 지에 이기의 500 µ L 플라스틱 사용된 이기를 제거 합니다. 이 단계를 세 번 반복 합니다.
2. 0.1 %trifluoroacetic 산의 100 µ L와 C18 수 지 equilibrate Eluent는 제거 합니다. 이 단계를 세 번 반복 합니다.
3. 샘플을 로드 하는 피 펫을 사용 하 여 수 지에 샘플을 바인딩하십시오.
4. 0.1 %trifluoroacetic 산의 20 µ L로 수 지를 세척. 5 번이이 단계를 반복 합니다.
5. 샘플의 0.1 %trifluoroacetic 산에서 60% 이기 3 µ L elute TOF MALDI 질량 분석에 대 한 대상 접시에 eluent 플라스틱 즉시 0.1 %trifluoroacetic 산에서 50% 이기에 포화 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA) 솔루션을 추가 합니다.
6. 공기에서 혼합물을 구체화.
7. 악기 제조 업체의 프로토콜에 따라 시료의 질량 스펙트럼을 취득 합니다.
   1. 수동으로 설정 긍정적인에 MALDI TOF 질량 분석기 모드를 반영 합니다.
   2. CHCA를 사용 하 여 질량 분석기 보정, bradykinin 조각 1-7 (monoisotopic 분자량 = 756.3997 Da), 그리고 angiotensin II (monoisotopic 분자 무게 1,045.5423 다 =).
   3. 샘플, biotin 표시 된 기판의 쪼개진된 형태에 대 한 900 다 700에서 질량 스펙트럼에 세심 한 관심 지불의 질량 스펙트럼을 취득 합니다.
8. 표 1을 사용 하 여 검색 된 봉우리를 식별 합니다. 적절 한 분자량의 검출 관련 아미노산의 C-말단에 분열을 나타냅니다.

결과

모델 프로 테아 제에 의해 효소 특이성의 식별에 대 한 방법의 평가

이 시스템의 효율성은 TPCK-트립 신 및 V8 효소의 기질 특이성 가져온 사용 하 여 평가 되었습니다. TPCK-트립 신 및 V8 효소 아미노산 시퀀스 리 신과 아르기닌 잔류물의 C-터미널 및 aspartic 산 및 글루탐산 잔류물의 카 쪽에서 각각 쪼개 위하여 견적 되었다. 표...

토론

이 프로토콜 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 조직 추출에서 파생 하는 원유 샘플에서 효소 특이성을 식별 하 고 쉽게 여러 샘플 처리에 대 한 조정 될 수 있습니다. 특히, 우리는 기질 특이성에 변화를 일으킬 pH를 조작.

avidin 비타민 b 복합체 복잡 한 (ABC) 메서드, 생화학의 바인딩 특이성 때문에 널리 이용 되는, 우리의 프로토콜에 이용 되었다. ABC의 강한 선호도, 인해 avidin 비?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00102
N,N-dimethylformamide (DMF)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00185
piperidine	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00176
trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)	WAKO Chemical	209-1483
O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00067
1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00014
diisopropylethylamine (DIPEA)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00030
triisopropylsilane (TIS)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00170
ethanedithiol (EDT)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00057
trifluoroacetic acid (TFA)	Millipore	S6612278 403
acetonitrile	Kokusan Chemical	2153025
C18 cartridge column	Waters	WAT051910
poly(oxyethylene) octylphenyl ether	WAKO Chemical	168-11805	Triton X-100
mixing homogenizer	Kinematica	PT3100	polytron homogenizer
Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250	Nakarai Chemical	094-09
glycerol	Nakarai Chemical	170-18
N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin	Sigma-Aldrich	T1426
dimethyl sulfoxide (DMSO)	WAKO Chemical	043-07216
streptavidin sepharose	GE Healthcare	17-511-01
ZipTipC18	Millipore	ZTC18S096
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)	Sigma-Aldrich	C2020
MALDI-TOF mass spectrometry	Bruker Daltonics, Germany	autoflex
2-iminobiotin	Sigma-Aldrich	I4632
Fmoc-amino acids	Watanabe Chemical Co., Ltd.