JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол определить специфику протеазы в сырой мыши ткани экстрактов с помощью MALDI-TOF спектрометрии.

Аннотация

Протеаз имеют несколько биологических функций, включая активации/дезактивации и продовольствия переваривания белка. Выявление специфики протеазы имеет важное значение для выявления протеазы функции. Метод, предложенный в настоящем исследовании определяет специфику протеазы, измеряя молекулярная масса уникальных субстратов с помощью матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии. Субстраты содержат иминобиотин, а рассеченного сайт состоит из аминокислот и разделитель состоит из полиэтиленгликоля. Расколотые субстрат будет генерировать уникальный молекулярный вес с помощью рассеченного аминокислоты. Одним из достоинств данного метода является, что он может осуществляться в одном горшке с использованием сырой образцов, и он подходит также для оценки нескольких образцов. В этой статье мы опишем простой экспериментальный метод, оптимизированные с образцами, извлеченные из мыши легочной ткани, включая добычу ткани, размещение пищеварительной субстратов в образцы, очищение пищеварительной субстратов в условиях различных рН и измерение субстратов молекулярный вес с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии. Таким образом эта техника позволяет для выявления специфики протеазы в сырой образцов, полученных из тканей экстрактов с помощью масс-спектрометрия MALDI-TOF, который легко может быть расширена для обработки нескольких образцов.

Введение

Протеаз регулировать физиологические процессы раскалыванием белков, и начало деятельности протеазы в определенное время и местах регулируется1. Поэтому важно определить выражение и активность тканей, которые регулируются на местном уровне и разработать новый метод для обнаружения протеаз. Предлагаемый метод в это исследование направлено на выявление специфики протеазы параллельно для обнаружения протеаз.

Есть несколько методов для обнаружения протеазы специфичности. Метод azocasein well-known для его использования в обнаружении протеаз2 , но ограничены в своей способности для получения дополнительной информации. Зимография является еще одним методом обнаружения всеобъемлющей протеазы, который может использоваться для определения молекулярная масса протеаз3, но он не может использоваться для изучения субстратная специфичность. Специфика протеазы может определяться спектрометрический анализы, используя субстратов, например4p-nitroanilide и флуориметрический анализов, используя кумарин субстратах5 или анализов флуоресценции передачи энергии резонанса (ЛАДА)6. Эти методы позволяют сингл специфичность обнаружения субстратов, содержащихся в одной скважине. В настоящем исследовании специфика протеазы ткани экстрактов рассматривается в различных условиях, как эти экстракты содержат несколько протеаз. Протеазы деятельность регулируется рядом факторов, включая рН, коферменты, протезно групп и ионная сила. Недавно на основе протеомики методы были использованы для выявления специфики протеазы; например метод сообщает Biniossek и др. 7 использует протеома для определения субстратная специфичность даже в сырой экстрактов и позволяет точное определение расщепления активности протеаз, которые признают несколько аминокислотных последовательностей8. Однако этот метод не подходит для анализа многочисленных образцов. В противоположность этому, наш метод позволяет одновременной обработки нескольких образцов, а также использование Matrix-Assisted лазерной десорбции/ионизации время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии для анализа проб облегчает быстрое и простое обнаружение рассеченного субстраты.

Этот документ описывает метод для оценки специфика протеаз с помощью масс-спектрометрия MALDI-TOF для измерения молекулярной массой уникальных субстратов. Молекулярные формы рассеченного субстратов, а также их теоретической молекулярным весом, показаны на рисунке 1 и в таблице 1. Предыдущие исследования использовали субстраты, содержащие polyglycine прокладки и биотин9; Однако эти субстраты ошибочны, потому что polyglycine последовательности может быть расщепляется ферментами, которые признают глицин последовательности. Кроме того высокое сродство между авидином и биотина может привести к низкой восстановления курса. Чтобы улучшить эти недостатки, в этом исследовании мы синтезированных уникальный субстрат, который состоит из полиэтиленгликоля (PEG), иминобиотин и аминокислоты, которые могли бы идентифицировать расщепления сайта (рис. 1). Чтобы различать аминокислоты подобными молекулярными весами проникли, D-Серина был добавлен между PEG распорку и аминокислот на объекте рассеченного.

N-терминальный субстрата было названо с иминобиотин, который позволяет очищение сродства от сырой образцов. Использование иминобиотин вместо биотин является критически важным; биотин имеет сильное сродство с авидин, что приводит к низкой восстановления ставок биотин меченых субстратов из авидин смолы, в то время как иминобиотин в сродство для авидин может быть изменено, рН. Иминобиотин меченых субстратов будет привязан к авидин в условиях выше pH 9, в то время как авидин выпускает иминобиотин меченых субстратов в условиях ниже рН 4. Таким образом иминобиотин был использован для очищения сродства10. В целом мы описываем подробный протокол для выявления специфики протеазы, с использованием уникальных субстратов.

протокол

Животных экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом фармацевтического университета Нихон этики и осуществляется в соответствии с руководящими принципами для ухода и использования лабораторных животных фармацевтического университета Нихон. Протокол был скорректирован для ткани экстракты, полученные от мышей МГП. МГП мышей были приобретены от Nippon SLC Ltd. (Сидзуока, Япония)

1. подготовка субстрата иминобиотин меченых

Субстрат проходит Твердофазный синтез с использованием 9-fluorenylmethyloxycarbonyl группы (Fmoc)-защищенные аминокислоты, как описано ниже11. Таблица 2 использование для определения Fmoc соединения используются в зависимости от желаемого amino acid и этап синтеза.

  1. Ополосните 0.2 g с 10 мл n, N-Диметилформамид (DMF) в столбце синтез Fmoc-NH-Сал смолы.
  2. Добавьте 5 мл 30% пиперидина в DMF. Рок-решение для 10 мин до прилепится группе Fmoc.
  3. Проверьте Fmoc расщепления с trinitrobenzenesulfonic кислотой (ТНБ) тест12: добавить 10 мкл 1% ТНБ в DMF и 10 мкл diisopropylethylamine (DIPEA) 10 x 75 мм2 стеклянные трубки, а затем передачи небольшое количество смолы стекло трубки. Fmoc расщепляется смолы следует разработать оранжевый цвет.
    1. Повторите шаги 1.2-1.3, если этот результат является отрицательным.
  4. Вымойте смолы три раза с 5 мл ДМФ.
  5. Добавьте 5 мл ДМФ, содержащие 0,3 ммоль комплекса Fmoc, перечисленные в таблице 2 (начиная с соединения, используемые на этапе 1), 0,3 ммоль Гексафторофосфат O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium (HCTU), 0,3 ммоль 1- Гидрокси-1H-Бензотриазол, моногидрат (HOBt) и 0,6 ммоль diisopropylethylamine (DIPEA). Рок-решение для 30 минут, чтобы пара его с смолы.
    1. Проверьте этот шаг с ТНБ теста. Если результат положительный, это означает, что реакция не продвинулась достаточно и необходимо повторить этот шаг.
  6. Вымойте смолы три раза с 5 мл ДМФ.
  7. Повторите удлинение реакции, повторив шаги 1.2-1.6, изменив Fmoc соединения, используемые на шаге 1.5 согласно таблице 2.
  8. Добавить 1 мл 2,5% воды, 1% triisopropylsilane (TIS) и 2,5% ethanedithiol (EDT) в trifluoroacetic кислоты, чтобы расщеплять пептидов из смолы и защиты групп. Рок решение для 60 мин.
  9. Фильтр и сбора фильтрата в 50-мл.
  10. Добавить 40 мл холодного диэтиловый этанола и хранить всю ночь при-20 ° C.
  11. 4000 x g центрифуги при-20 ° C на 30 мин собирать гранулы.
  12. Чтобы удалить диэтиловый эфир используйте эксикатор для 3 h.
  13. Добавить 1 мл 50% Ацетонитрил в воде и распустить сырой пептиды. Lyophilize решение для удаления trifluoroacetic кислоты. Повторите это действие несколько раз.
  14. Очищайте пептиды, с помощью столбца картридж C18.
    1. Активируйте смолы в столбце картридж C18, используя 3 мл Ацетонитрил (АКС).
    2. Сбалансировать с 5 мл 5% ACN, 0.1% TFA H2O.
    3. Загрузите сырой синтетических пептидов в столбце картридж C18.
    4. Вымойте с 10 мл 5% ACN, 0.1% TFA H2O.
    5. Элюировать образцы с 3 мл 60% ACN, 0.1% TFA H2O.
  15. Проверьте пептидов, измеряя их молекулярный вес с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии.
    1. Пипетка 1 мкл элюента на целевой тарелку. Сразу же добавьте насыщенный α-циано-4-Гидроксикоричная кислота (CHCA) раствор в ацетонитриле 50% в trifluoroacetic кислота 0,1%
    2. Кристаллизуются смесь по воздушной сушки.
    3. Приобрести массового спектры образцов согласно протоколу производителя прибора.
      1. Вручную установите MALDI-TOF масс-спектрометр для позитивного отражают режим.
      2. Калибровка с помощью CHCA масс-спектрометр, Брадикинин фрагмент 1-7 (monoisotopic молекулярный вес = 756.3997 да) и ангиотензин II (monoisotopic молекулярный вес = 1,045.5423 да).
      3. Приобрести массового спектры синтетических пептидов и затем оценить, сравнив ее с теоретической молекулярной массой.

2. подготовка ткани экстрактов

  1. Анестезировать мышей-самцов ICR в камере ингаляции изофлюрановая и проверки глубины анестезии через мыс пинча. Усыпить мышей от шейки матки дислокации.
  2. С помощью ножниц, сделайте срединной брюшной разрез через кожу, расширение до мечевидного отростка.
  3. Вырезать через диафрагму и собирать все легочной ткани. Нарежьте на мелкие кусочки ткани.
  4. Вымойте ткань три раза с ледяной 50 мм трис амортизированное saline (рН 7,4).
  5. Вес ткани и передачи около 100 мг тканей в стеклянную трубку2 12 x 75 мм.
  6. Добавление 0,3 мл извлечения буфера (50 мм трис буфер, рН 7,4, содержащий 0.1% поли (oxyethylene) octylphenyl эфира).
  7. Однородный образцов ткани легких, с помощью смешивания гомогенизатора.
    1. Прохладный образцы на льду.
    2. Однородности выборок на 20000 об/мин за 30 s в блендере. Повторите этот шаг до тех пор, пока образцы полностью однородной.
      Примечание: Не однородный для более чем 1 минута непрерывно, с тем чтобы избежать увеличения температуры.
  8. Передачи 1000 мкл огневки до 1,5 мл трубки и центрифуги для 5 мин на 10000 x g при 4 ° C.
  9. Передать новые пластиковые трубы 1,5 мл 500 мкл супернатант.
  10. Используйте 10 мкл пример для определения концентрации белка, используя такие методы, как bicinchoninic кислоты (BCA) или метод Кумасси блестящий синий (НБР).
  11. Для предотвращения замерзания, добавьте глицерин 80% образцов для конечной концентрации 50% глицерина.
  12. Хранение образцов-80 ° C до дальнейшего использования.

3. пищеварение субстратов в модель протеазы и экстракты ткани

  1. 10 мкл 0,1 мкг/мкл N-tosyl-L-фенилаланин хлорметил кетон (TPCK)-трипсин, 0,1 мкг/мкл Staphylococcus aureus V8 протеазы или 10 мкг/мкл ткани экстрактов в 890 мкл буфера пищеварение.
    1. Чтобы уточнить разницу в протеазы специфику в зависимости от рН, используйте буферы скорректирована с рН 3, 5, 7 и 9. В состав пищеварение буфера это показано в таблице 3.
    2. Осуществляют отрицательный контроль с помощью неактивные протеазы в ткани экстракты, подготовленный инкубации в кипящей воде (или Отопление при 100 ° C) для 10 мин.
  2. 10 мкл иминобиотин меченых субстратов (растворяют в диметилсульфоксида (ДМСО), конечная концентрация = 100 пмоль/10 мкл).
  3. Инкубируйте 3 часа при 37 ° C переваривать иминобиотин меченых субстратов.
  4. После инкубации остановите пищеварение субстратов с кипящей водой (или нагрева при 100 ° C) для 10 мин.
  5. Центрифуга переваривается субстраты для 5 мин на 10000 x g при 4 ° C.
  6. Перенесите супернатант в новой 1,5 мл трубки.

4. Очистка иминобиотин меченых субстрата

  1. 50 мкл 50% стрептавидина sepharose бисера в 1 М трис буфере (рН 9) содержащий 0,1% оксиетален octylphenyl эфира.
    1. Использование тел тестовой бумаги для обеспечения того, чтобы решение вокруг рН 9. При низком РН раствора, скорректировать его до приблизительно pH 9, добавляя 1 М трис буфере (рН 9) содержащий 0,1% оксиетален octylphenyl эфира. Этот шаг имеет важное значение, как это предполагает привязку иминобиотин меченых субстрата для стрептавидина.
  2. Инкубируйте на ночь при 4 ° C с непрерывной нежный смешивания на колесе ротатор для привязки иминобиотин меченых субстратов стрептавидина. Бисер должен оставаться приостановленной на протяжении всего инкубационного.
  3. Центрифуги для 1 мин на 10000 x g при 4 ° C. Удалите супернатант.
  4. Вымойте бисер пять раз следующим образом:
    1. Добавьте 1000 мкл буфера мытья (50 мм трис буфер, рН 9) бисер.
    2. Мыть за 10 мин при 4 ° C с непрерывной нежный смешивания на колесе ротатора. Бисер должен оставаться приостановленной на протяжении всего инкубационного.
    3. Центрифуга для 1 мин на 10000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
  5. Добавьте 100 мкл 0,2% trifluoroacetic кислоты в бисер.
    1. Используйте тел тестовой бумаги для обеспечения того, чтобы решение ниже рН 2. Если рН раствора является высоким, скорректировать рН ниже 2 путем добавления кислоты 1% trifluoroacetic.
  6. Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре с непрерывной нежный смешивания на колесе ротатора.
  7. Центрифуга для 1 мин на 10000 x g при 4 ° C, затем передать супернатант новой 1,5 мл трубки.

5. Образец подготовки и при содействии матрицы лазерной десорбции/ионизации время полета масс-спектрометрия (MALDI-TOF масс-спектрометрия)

Примечание: Все решения в следующие шаги должны быть подготовлены с высокопроизводительной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)-класс или аминокислоты последовательности класс воды.

  1. Пипетка 500 мкл Ацетонитрил на C18 смолы, чтобы активировать его. Удаление Ацетонитрил используется. Повторите этот шаг три раза.
  2. Сбалансировать C18 смолы с 100 мкл trifluoroacetic кислоты 0,1%. Удаление элюента. Повторите этот шаг три раза.
  3. Чтобы загрузить образцы, связать образцы смолы с помощью пипетки.
  4. Вымойте смолы с 20 мкл trifluoroacetic кислоты 0,1%. Повторите этот шаг пять раз.
  5. Элюировать образцы с 3 мкл 60% Ацетонитрил в 0,1% trifluoroacetic кислоты. Пипетка элюента на целевой пластина для MALDI-TOF масс-спектрометрии. Сразу же добавьте насыщенный раствор α-циано-4-Гидроксикоричная кислоты (CHCA) в 50% Ацетонитрил в 0,1% trifluoroacetic кислоты.
  6. Кристаллизуются смесь по воздушной сушки.
  7. Приобрести массового спектры образцов согласно протоколу производителя прибора.
    1. Вручную установите MALDI-TOF масс-спектрометр для позитивного отражают режим.
    2. Калибровка с помощью CHCA масс-спектрометр, Брадикинин фрагмент 1-7 (monoisotopic молекулярный вес = 756.3997 да) и ангиотензин II (monoisotopic молекулярный вес = 1,045.5423 да).
    3. Приобрести массового спектры образцов, уделяя пристальное внимание массового спектров от 700 до 900 да рассеченного формы биотин меченых субстратов.
  8. Идентифицировать обнаруженных пики, с использованием таблицы 1. Выявление соответствующих молекулярной массы указывает расщепления в C-terminus соответствующих аминокислот.

Результаты

Оценка метода для выявления специфики протеазы, модель протеазы

Эффективность этой системы была оценена с помощью TPCK-трипсина и V8 протеазы, чьи особенности субстрата были получены. TPCK-трипсина и V8 протеазы оценкам прилепится аминокисло...

Обсуждение

Этот протокол использует MALDI-TOF масс-спектрометрии для выявления специфики протеазы в сырой образцов, полученных из тканей экстрактов и легко могут быть расширены для обработки нескольких образцов. В частности мы манипулировать рН, чтобы вызвать изменения в субстратная специфичность.<...

Раскрытие информации

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа частично поддержали Нихон фармацевтического университета исследовательский грант от фармацевтического университета Нихон (2016) и JP17854179 номер гранта KAKENHI МПКСНТ.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)
aminomethyl]phenoxy resin)		Watanabe Chemical Co., Ltd.A00102
N,N-dimethylformamide (DMF)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00185
piperidineWatanabe Chemical Co., Ltd.A00176
trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)WAKO Chemical209-1483
O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00067
1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00014
diisopropylethylamine (DIPEA)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00030
triisopropylsilane (TIS)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00170
ethanedithiol (EDT)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00057
trifluoroacetic acid (TFA)MilliporeS6612278 403
acetonitrileKokusan Chemical2153025
C18 cartridge columnWatersWAT051910
poly(oxyethylene) octylphenyl etherWAKO Chemical168-11805Triton X-100
mixing homogenizerKinematicaPT3100polytron homogenizer
Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250Nakarai Chemical094-09
glycerolNakarai Chemical170-18
N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsinSigma-AldrichT1426
dimethyl sulfoxide (DMSO)WAKO Chemical043-07216
streptavidin sepharoseGE Healthcare17-511-01
ZipTipC18MilliporeZTC18S096
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)Sigma-AldrichC2020
MALDI-TOF mass spectrometryBruker Daltonics, Germanyautoflex
2-iminobiotinSigma-AldrichI4632
Fmoc-amino acidsWatanabe Chemical Co., Ltd.

Ссылки

  1. Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
  2. Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
  3. Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
  4. Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
  5. Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
  6. Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
  7. Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
  8. Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
  9. Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
  10. Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
  11. Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
  12. Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
  13. Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
  14. Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

135MALDI TOF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены