Los extractos de la determinación de la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón por espectrometría de masas MALDI-TOF: manipulando PH para causar cambios de la especificidad

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para determinar la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón crudo usando MALDI-TOF espectrometría de extractos.

Resumen

Las proteasas tienen varias funciones biológicas, incluyendo digestión de comida y la activación/inactivación de proteínas. Identificar la especificidad de la proteasa es importante para revelar la función de la proteasa. El método propuesto en este estudio determina la especificidad de la proteasa midiendo el peso molecular de sustratos únicos mediante desorción/ionización del Laser asistida por matriz de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF). Los sustratos contienen iminobiotin, mientras que el sitio hendido consiste en aminoácidos, y consiste en el separador de glicol de polietileno. El sustrato exfoliado generará un único peso molecular utilizando un aminoácido exfoliado. Uno de los méritos de este método es que se puede llevar a cabo en una maceta utilizando muestras de crudo, y también es adecuado para evaluar las muestras múltiples. En este artículo, describimos un método experimental sencillo optimizado con muestras extraídas de tejido de pulmón de ratón, incluyendo extracción de tejido, colocación de sustratos digestivos en muestras, depuración de digestivos sustratos bajo condiciones de pH diferentes y la medición del peso molecular de los sustratos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. En Resumen, esta técnica permite la identificación de la especificidad de la proteasa en muestras de crudo derivados de extractos de tejidos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, que puede fácilmente ampliarse para el procesamiento de las muestras múltiples.

Introducción

Proteasas regulan procesos fisiológicos por unirse a las proteínas, y el inicio de la actividad de la proteasa en momentos concretos y lugares es regulada¹. Por lo tanto es importante identificar la expresión y actividad de los tejidos que están reguladas localmente y para desarrollar un nuevo método para detectar las proteasas. El método propuesto en este estudio tiene como objetivo identificar la especificidad de la proteasa en paralelo a la detección de las proteasas.

Existen algunos métodos para detectar la especificidad de la proteasa. El método de azocasein es bien sabido para su uso en la detección de las proteasas² pero está limitado en su capacidad para obtener más información. Zymography es otro método de detección integral de proteasa que puede utilizarse para determinar el peso molecular de proteasas³, pero no puede utilizarse para examinar la especificidad de sustrato. Especificidad de la proteasa puede determinarse por análisis espectrométricos, utilizando sustratos como la p-nitroanilida⁴y los análisis fluorométrico, usando cumarina sustratos⁵ o de ensayos de transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia (FRET)⁶. Estos métodos permiten detección única especificidad de sustratos contenidos en un solo pozo. En el presente estudio, la especificidad de la proteasa de extractos de tejido se examina bajo diversas condiciones, ya que estos extractos contienen proteasas múltiples. Actividad de las proteasas es regulada por varios factores, incluyendo fuerza del ion, pH, coenzimas y grupos prostéticos. Recientemente, se han utilizado métodos basados en proteómica para identificar la especificidad de la proteasa; por ejemplo, el método reportado por Biniossek et al. ⁷ el proteoma se utiliza para determinar la especificidad de sustrato incluso en extractos crudos y permite la determinación exacta de la actividad de la hendidura de las proteasas que reconocen múltiples secuencias de aminoácidos⁸. Sin embargo, este método no es adecuado para el análisis de numerosas muestras. En cambio, nuestro método permite el procesamiento simultáneo de múltiples muestras y el uso de mediante desorción/ionización del Laser (MALDI-TOF) de tiempo de vuelo espectrometría de masas para el análisis de la muestra facilita la detección rápida y fácil de la hendida sustratos.

Este documento describe un método para evaluar la especificidad de la proteasa utilizando espectrometría de masas MALDI-TOF para medir el peso molecular de sustratos únicos. Las formas moleculares de sustratos troceados, junto con su peso molecular teórico, se muestran en la figura 1 y tabla 1. Estudios previos han utilizado substratos que contienen separadores de polyglycine y biotina⁹; sin embargo, estos sustratos son defectuosas porque la secuencia de polyglycine puede ser troceada por enzimas que reconocen la secuencia de la glicina. Además, la alta afinidad entre la avidina y la biotina puede conducir a una tasa de recuperación bajo. Para mejorar estos inconvenientes, en este estudio que sintetizaron un sustrato único, que fue compuesto de polietilenglicol (PEG), iminobiotin y un aminoácido que puede identificar el sitio de la hendidura (figura 1). Para discriminar entre aminoácidos de peso molecular similar, D-serina fue agregado entre el espaciador PEG y el aminoácido en el sitio exfoliado.

El N-terminal del sustrato fue etiquetado con iminobiotin, que permite la purificación de la afinidad de muestras de crudo. El uso de iminobiotin en lugar de biotina es crítico; la biotina tiene una fuerte afinidad con la avidina, que se traduce en las tasas de baja recuperación de sustratos marcados con biotina de la resina de la avidina, mientras que la afinidad de iminobiotin de avidina puede ser alterado por pH. Sustratos marcados Iminobiotin se unirán a avidina en condiciones por encima de pH 9, mientras que la avidina libera sustratos marcados con iminobiotin en condiciones por debajo de pH 4. Por lo tanto, iminobiotin fue utilizado para la purificación de afinidad¹⁰. En Resumen, se describe un protocolo detallado para detectar la especificidad de proteasa utilizando sustratos únicos.

Protocolo

Protocolos experimentales animales fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad de Nihon en industria farmacéutica y a cabo conforme a las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio de la Universidad de Nihon Pharmaceutical. El protocolo ha sido ajustado para los extractos de tejidos derivados de ratones ICR. Ratones ICR fueron comprados de Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japón)

1. preparación del sustrato marcado con Iminobiotin

El sustrato pasa por síntesis en fase sólida usando grupo 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-protegidas aminoácidos como se describe a continuación¹¹. Utilizar tabla 2 para determinar el Fmoc-compuesto utilizado, dependiendo de la etapa de síntesis y aminoácido deseado.

1. Swill 0,2 g de resina de Fmoc-NH-SAL con 10 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) en una columna de síntesis.
2. Añadir 5 mL de piperidina de 30% en DMF. Roca de la solución durante 10 minutos a unirse el grupo Fmoc.
3. Compruebe Fmoc escote con el ácido Trinitrobencenosulfónico (TNBS) prueba¹²: Añadir 10 μl de 1% tubo de TNBS en DMF y 10 μl de diisopropylethylamine (DIPEA) a un tubo de vidrio 10 x 75 mm² , entonces la transferencia de una pequeña cantidad de resina del cristal. La resina de Fmoc-hendido debe desarrollar un color naranja.
   1. Repita los pasos 1.3 1.2 Si este resultado es negativo.
4. Lavar la resina tres veces con 5 mL de DMF.
5. Añada 5 mL de DMF conteniendo 0,3 mmol de Fmoc-compuestos enumerados en la tabla 2 (comenzando con el compuesto usado en la etapa 1), 0,3 mmol de hexafluorofosfato de O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium (HCTU), 0,3 mmol de 1- Hidroxi-1H-benzotriazol, monohidrato (TOHB) y 0,6 mmol de diisopropylethylamine (DIPEA). La solución por 30 min acoplar con la resina de la roca.
   1. Compruebe este paso con la prueba TNBS. Si el resultado es positivo, significa que la reacción no ha progresado lo suficiente y este paso debe repetirse.
6. Lavar la resina tres veces con 5 mL de DMF.
7. Repita la reacción de elongación repitiendo los pasos 1.2-1.6, cambiando el Fmoc-compuesto utilizado en el paso 1.5 según tabla 2.
8. Añadir 1 mL de agua de 2.5%, 1% Triisopropilsilano (TIS) y 2.5% Etanoditiol (EDT) de ácido trifluoroacético para unirse a péptidos de los grupos de resina y protección. Roca la solución de 60 minutos.
9. Filtrar y recoger el filtrado en un tubo de 50 mL.
10. Añadir 40 mL de etanol frío dietílico y tienda durante la noche a-20 ° C.
11. Centrifugar a 4.000 x g a-20 ° C para 30 minutos recoger el diábolo.
12. Utilice un desecador durante 3 horas para eliminar el éter dietílico.
13. Añadir 1 mL de acetonitrilo 50% agua y disolver los péptidos crudos. Liofilizar la solución para eliminar el ácido trifluoroacético. Repita este paso varias veces.
14. Purificar los péptidos usando una columna de cartucho C18.
    1. Activar la resina en la columna de cartucho de C18 con 3 mL de acetonitrilo (ACN).
    2. Equilibrar con 5 mL de 5% ACN, 0.1% TFA en H₂O.
    3. Cargar el crudo péptidos sintéticos en la columna de cartucho C18.
    4. Lavar con 10 mL de 5% ACN, 0.1% TFA en H₂O.
    5. Eluir las muestras con 3 mL de 60% ACN, 0.1% TFA en H₂O.
15. Compruebe los péptidos mediante la medición de su peso molecular mediante espectrometría de masas MALDI-TOF.
    1. Pipeta 1 μl del eluyente en un plato blanco. Inmediatamente añadir saturado solución de (CHCA) ácido α-ciano-4-hidroxicinámico en 50% acetonitrilo en 0,1% de ácido trifluoroacético
    2. Cristalizar la mezcla por secado al aire.
    3. Adquisición de espectros de masas de las muestras según protocolo del fabricante del instrumento.
       1. Configurar manualmente el espectrómetro de masas MALDI-TOF para un positivo reflejan el modo.
       2. Calibrar el espectrómetro de masas con CHCA, bradicinina fragmento 1-7 (peso molecular de monoisotopic = Da 756.3997) y angiotensina II (peso molecular de monoisotopic = Da 1,045.5423).
       3. Adquisición de los espectros de masas de péptidos sintéticos y entonces evaluar comparando con el peso molecular teórico.

2. preparación de extractos de tejido

1. Anestesiar ratones ICR machos en una cámara de inhalación isoflurane y verificar la profundidad de la anestesia mediante pellizco del dedo del pie. Eutanasia a los ratones por dislocación cervical.
2. Con unas tijeras, hacer una incisión abdominal de línea media a través de la piel que se extiende hasta el proceso del xiphoid.
3. Corte a través del diafragma y recoger todo el tejido pulmonar. Cortar el tejido en trozos pequeños.
4. Lavar el tejido tres veces con solución salina tamponada con Tris de helado 50 mM (pH 7,4).
5. Peso de los tejidos y el traslado de aproximadamente 100 mg de los tejidos a un tubo de vidrio 12 x 75 mm² .
6. Agregar 0,3 mL de la solución de extracción (50 mM Tris-buffer, pH 7.4, que contiene éter de Octylpheny de poli (oxyethylene) 0.1%).
7. Homogeneizar las muestras de tejido pulmonar utilizando un homogeneizador de la mezcla.
   1. Enfriar las muestras en hielo.
   2. Homogeneizar las muestras a 20.000 rpm durante 30 s en licuadora. Repita este paso hasta que las muestras son totalmente homogéneas.
      Nota: No homogeneizar durante más de 1 minuto de forma continua, para evitar un aumento de temperatura.
8. Transferencia 1.000 μl del homogeneizado en un tubo de 1.5 mL y centrifugar durante 5 min a 10.000 x g a 4 ° C.
9. Transferir 500 μl del sobrenadante a un tubo nuevo de plástico de 1,5 mL.
10. Utilice 10 μl de la muestra para determinar la concentración de proteína, utilizando métodos como el bicinchoninic ácido (BCA) o el método de Coomassie brillante azul (CBB).
11. Para evitar la congelación, añadir glicerol al 80% de las muestras para una concentración final de glicerol al 50%.
12. Almacenar las muestras a-80 ° C hasta su uso posterior.

3. digestión de los sustratos en modelo proteasa y extractos de tejido

1. Añadir 10 μl de 0,1 μg/μl de cetona de clorometil N-tosyl-L-fenilalanina (TPCK)-tripsina, 0,1 μg/μl de proteasa de Staphylococcus aureus V8 o 10 μg/μl de extractos de tejido en 890 μl de un buffer de digestión.
   1. Para aclarar la diferencia en la especificidad de la proteasa dependiendo del pH, use tampones ajustados a pH 3, 5, 7 y 9. La composición del buffer de digestión se muestra en la tabla 3.
   2. Llevar a cabo un control negativo con proteasa inactiva en los extractos de tejido, preparados por la incubación en agua hirviendo (o calentamiento a 100 ° C) durante 10 minutos.
2. Añadir 10 μl de sustratos marcados iminobiotin (disuelto en dimetil sulfóxido (DMSO), concentración final = 100 pmol/10 μl).
3. Incubar durante 3 horas a 37 ° C para digerir sustratos marcados iminobiotin.
4. Después de la incubación, detener la digestión de los sustratos con agua hirviendo (o por calentamiento a 100 ° C) durante 10 minutos.
5. Centrifugue los sustratos digeridos por 5 min a 10.000 x g a 4 ° C.
6. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL.

4. purificación del substrato marcado con Iminobiotin

1. Añadir 50 μl de estreptavidina 50% sepharose granos que contiene 0.1% poly(oxyethylene) Octylpheny éter de 1 M Tris-buffer (pH 9).
   1. Utilice papel de prueba pH para asegurar que la solución es alrededor de pH 9. Si el pH de la solución es bajo, ajustar a pH aproximadamente 9 añadiendo que contiene 0.1% poly(oxyethylene) Octylpheny éter de 1 M Tris-buffer (pH 9). Este paso es importante, ya que implica la Unión del sustrato a estreptavidina marcada con iminobiotin.
2. Incubar durante una noche a 4 ° C con mezcla suave continuo en una rueda de rotor para enlazar los sustratos marcados con iminobiotin a la estreptavidina. Los granos deben permanecer suspendidos a lo largo de la incubación.
3. Centrifugar por 1 min a 10.000 x g a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
4. Lavar los granos cinco veces como sigue:
   1. Añadir 1.000 μl de un buffer de lavado (50 mM Tris-buffer, pH 9) a los granos.
   2. Lavado durante 10 min a 4 ° C con mezcla suave continuo en una rueda de rotor. Los granos deben permanecer suspendidos a lo largo de la incubación.
   3. Centrifugar por 1 min a 10.000 x g a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.
5. Añada 100 μl del 0.2% de ácido trifluoroacético para los granos.
   1. Utilice papel de prueba pH para asegurar que la solución está por debajo de pH 2. Si el pH de la solución es alto, ajustar el pH a continuación 2 agregando 1% de ácido trifluoroacético.
6. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente con mezcla suave continuo en una rueda de rotor.
7. Centrifugar por 1 min a 10.000 x g a 4 ° C, y luego transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL.

5. muestra preparación y desorción láser asistida por matriz/ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF espectrometría de masa)

Nota: Todas las soluciones en los siguientes pasos deben ser preparadas con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)-grado o aminoácido secuencia-grade del agua.

1. Pipetear 500 μl de acetonitrilo en una resina C18 para activarlo. Retire el acetonitrilo utilizado. Repita este paso tres veces.
2. Equilibre la resina C18 con 100 μl de 0,1% de ácido trifluoroacético. Retire el eluyente. Repita este paso tres veces.
3. Para cargar las muestras, las muestras se unen a la resina con ayuda de una pipeta.
4. Lavar la resina con 20 μl de 0,1% de ácido trifluoroacético. Repita este paso cinco veces.
5. Eluir las muestras con 3 μl de 60% de acetonitrilo en 0,1% de ácido trifluoroacético. Pipeta el eluyente en un plato blanco para espectrometría de masas MALDI-TOF. Añada inmediatamente saturado solución de (CHCA) ácido α-ciano-4-hidroxicinámico en 50% acetonitrilo en 0,1% de ácido trifluoroacético.
6. Cristalizar la mezcla por secado al aire.
7. Adquisición de espectros de masas de las muestras según protocolo del fabricante del instrumento.
   1. Configurar manualmente el espectrómetro de masas MALDI-TOF para un positivo reflejan el modo.
   2. Calibrar el espectrómetro de masas con CHCA, bradicinina fragmento 1-7 (peso molecular de monoisotopic = Da 756.3997) y angiotensina II (peso molecular de monoisotopic = Da 1,045.5423).
   3. Adquisición de los espectros de masas de las muestras, prestando mucha atención a los espectros de masas de 700 a 900 Da para la forma hendida de los substratos marcados con biotina.
8. Identificar los picos detectados utilizando la tabla 1. Detección del peso molecular apropiado indica escote en el C-terminal del aminoácido correspondiente.

Resultados

Evaluación del método para la identificación de la especificidad de la proteasa por proteasa de modelo

Se evaluó la eficacia de este sistema utilizando TPCK-tripsina y proteasa V8, cuyas especificidades de sustrato se obtuvieron. Se estimaron TPCK-tripsina y proteasa V8 hender la secuencia de aminoácidos en el c-terminal de los residuos de lisina y arginina y en el lado carboxilo del ácido aspártico y residuos de ácido glut...

Discusión

Este protocolo utiliza la espectrometría de masas MALDI-TOF para identificar la especificidad de la proteasa en muestras de crudo derivados de extractos de tejido y puede fácilmente ampliarse para el procesamiento de las muestras múltiples. En particular, manipulamos pH para causar un cambio en la especificidad de sustrato.

Se utilizó el método de (ABC) complejo avidina-biotina, que ha sido ampliamente utilizado en Bioquímica debido a su especificidad de Unión, en nuestro protocolo. Deb...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00102
N,N-dimethylformamide (DMF)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00185
piperidine	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00176
trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)	WAKO Chemical	209-1483
O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00067
1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00014
diisopropylethylamine (DIPEA)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00030
triisopropylsilane (TIS)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00170
ethanedithiol (EDT)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00057
trifluoroacetic acid (TFA)	Millipore	S6612278 403
acetonitrile	Kokusan Chemical	2153025
C18 cartridge column	Waters	WAT051910
poly(oxyethylene) octylphenyl ether	WAKO Chemical	168-11805	Triton X-100
mixing homogenizer	Kinematica	PT3100	polytron homogenizer
Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250	Nakarai Chemical	094-09
glycerol	Nakarai Chemical	170-18
N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin	Sigma-Aldrich	T1426
dimethyl sulfoxide (DMSO)	WAKO Chemical	043-07216
streptavidin sepharose	GE Healthcare	17-511-01
ZipTipC18	Millipore	ZTC18S096
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)	Sigma-Aldrich	C2020
MALDI-TOF mass spectrometry	Bruker Daltonics, Germany	autoflex
2-iminobiotin	Sigma-Aldrich	I4632
Fmoc-amino acids	Watanabe Chemical Co., Ltd.