جيل الماغنيسيوم الفائق الورم ثلاثية الأبعاد لفحص المخدرات

Summary

عبر مجموعة واسعة من مؤشرات المرض، يجري النماذج ذات الصلة أكثر فسيولوجيا المخدرات المتقدمة وتنفذ في اكتشاف البرامج. النظام النموذجي الجديد الموصوفة هنا يوضح الورم ثلاثي الأبعاد كيف يمكن مثقف الماغنيسيوم وفرزهم في نظام القائم على لوحة الفائق 1536-جيدا للبحث عن أدوية جديدة لعلاج الأورام.

Abstract

وقد تم مثقف الخلايا السرطانية بشكل روتيني في بعدين (2D) على سطح بلاستيك. هذا الأسلوب، ومع ذلك، تفتقر إلى البيئة الحقيقية ورم يتعرض فيفو فيكتلة. الأورام الصلبة تنمو ليس كورقة تعلق على البلاستيك، ولكن بدلاً من ذلك كمجموعة من الخلايا الاستنساخ في ثلاثية الأبعاد (3D) مساحة التفاعل مع جيرانهم، ومع الخصائص المكانية متميزة مثل اضطراب الاستقطاب الخلوي العادي. هذه التفاعلات تسبب الخلايا المستزرعة 3D اكتساب الخصائص المورفولوجية والخلوية التي أكثر صلة بأورام في فيفو . بالإضافة إلى ذلك، وجود ورم الشامل في الاتصال المباشر مع سائر أنواع الخلايا مثل الخلايا اللحمية ومحصنة، فضلا عن المصفوفة خارج الخلية من جميع أنواع الخلايا الأخرى. مصفوفة أودعت تتألف من الجزيئات الكبيرة مثل الكولاجين وفيبرونيكتين.

في محاولة لزيادة ترجمة نتائج البحوث في علم الأورام من مقاعد البدلاء إلى جانب السرير، بدأت العديد من المجموعات للتحقيق في استخدام نظم النموذج الثلاثي الأبعاد في استراتيجياتها الإنمائية الخاصة بالمخدرات. ويعتقد أن أكثر فسيولوجيا ذات الصلة نظراً لأنها محاولة لتلخيص البيئة المعقدة وغير متجانسة من ورم في هذه النظم. هذه الأنظمة، ومع ذلك، يمكن أن تكون معقدة جداً، وعلى الرغم من أن قابلة للنمو في تنسيقات 96-جيدا، وبعضها الآن حتى في 384، أنها توفر خيارات قليلة للنمو على نطاق واسع والفرز. ولاحظ هذه الفجوة قد أدى إلى تطوير الأساليب الموصوفة هنا بالتفصيل للثقافة الورم الماغنيسيوم في قدرة الإنتاجية العالية في لوحات 1536-جيدا. هذه الطرق تمثل حلاً وسطا للأنظمة المستندة إلى مصفوفة معقدة للغاية، من الصعب على الشاشة، وفحوصات 2D التقليدية. مجموعة متنوعة من خطوط خلايا السرطان إيواء الطفرات الوراثية مختلفة يتم فحصهم بنجاح، دراسة فعالية مركب باستخدام مكتبة المنسق من مركبات استهداف ميتوجيناكتيفاتيد البروتين كيناز أو MAPK المسار. ثم تتم مقارنة الردود ثقافة كروي لاستجابة الخلايا التي نمت في 2D، ويتم الإبلاغ عن الأنشطة التفاضلية. هذه الأساليب تقديم بروتوكول فريدة لاختبار نشاط المجمع في إعداد 3D الفائق.

Introduction

في العقد الماضي، نفذت دراسات أكثر وأكثر استخدام نماذج الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد لفهم المفاهيم التي لا يرد موجز لها تماما بزراعة الخلايا في 2D على البلاستيك. وتشمل أمثلة لهذه المفاهيم المصطنعة في الخلايا الظهارية العادية قطبية¹ حيث يتم فقدان التوجه المكاني لطبقات قمي والقاعدية للخلايا، فضلا عن دور المصفوفة خارج الخلية في تنظيم بقاء ومصير الخلية. أبحاث علم الأورام، على وجه الخصوص، قد تستخدم نماذج ثلاثية الأبعاد لفهم البيولوجيا الأساسية للخلايا السرطانية والفروق في 2D و 3D خلية ثقافة النظم^3،4. وقد مكن تطوير تقنيات استزراع خلية أكثر تطورا وعلى تكييف إضافية إلى صيغ متعددة جيدا البحث عن عقاقير جديدة في إعدادات ثلاثية الأبعاد. وعلى النقيض من الخلايا التي نمت في ظروف 2D، 3D نماذج من مجموعة الأورام في التعقيد من الطبقات الخلوية نظم⁵ مجالات نوع واحد من الخلايا ذات أحجام مختلفة، إلى مجالات متعددة سيل من نوع معقد^{6،7، 8}-اكتشاف مركبات جديدة أو البيولوجي التي أظهرت تسبب موت الخلايا في هذه النظم نموذج ثلاثي الأبعاد، بالتالي، ارتفاع الفوائد في حملات التنمية المخدرات. نقاط النهاية لهذه الاختبارات غالباً ما تكون مطابقة لما تم تنفيذه في 2D الثقافات لتقييم التغييرات في تكاثر الخلايا، ولكن عندما تجري في أجواء أكثر فسيولوجيا ذات صلة، أنها قد تكشف عن المستوى الحقيقي لتبعية الجينات المستهدفة أو يجري المسار استجوب.

كما عرضت أعلاه، مجموعة متنوعة من نظم نموذجية قد وضعت لدراسة الردود المخدرات في نظم الاستزراع 3D، ولكن الأغلبية تستخدم أما لوحات microtiter 96 أو 384-جيدا وليست قابلة للتكيف بسهولة إلى صيغ الفرز (HTS) الفائق غالباً ما تستخدم في حملات الفحص اكتشاف المخدرات. تشمل هذه النظم استخدام معلقة التكنولوجيات الحبرية، الثقافات كروي، النبض الخلايا مع جزيئات مغناطيسية للحث على الارتفاع، والثقافات التي تتضمن المواد الهلامية الطبيعية أو الاصطناعية مثل الكولاجين أو ماتريجيل أو البولي إثيلين غليكول (شماعة)² . نقدم هنا، مفصلاً أساليب تقنية المتقدمة سابقا لإنتاج الثقافات كروي ثلاثي الأبعاد من خطوط خلايا السرطان المنشأة في شكل لوحة 1536-جيدا. في هذا البروتوكول، تستخدم وسيلة محددة بدرجة عالية مما يمنع إلحاق خلية عادة ملتصقة خطوط⁹. هذا النظام قد القيود (أيأنها لا يمكن أن الخص تماما نظام طراز معقدة للسرطان)، ولكن على الرغم من ذلك، تمكن هذه الاختبارات فرز الفائق لمجموعات كبيرة من الجزيئات الصغيرة وإجراء مقارنات عبر فتحه لاستجابة المخدرات بين الثقافات 2D و 3D ضد مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا والمركبات.

خطوط الخلايا المحددة لإظهار الأساليب الموجودة في هذه المقالة كل ميناء الطفرات في الجينات المتصلة ب MAPK إشارات الطريق، طريق الذي هو الغاية dysregulated في السرطان، وتتوفر فيه العديد من العلاجات. العديد من الخطوط بتفعيل النمطان الطفرات في فيروس "ساركومه الفئران كيرستن" يشار إليه أيضا كراس ورأس نيوروبلاستوما أو تجاوزها والسرطاني الفيروس "هارفي الفئران ساركومه" أو HRAS ومؤنزم المرتبطة "فيبروساركوماس التعجيل بسرعة"، المعروف أيضا رافس. الأدب الأخيرة تشير إلى أن مثبطات الفروع المختلفة لهذا المسار فريد أكثر نجاعة في مجموعة فرعية من خطوط الخلايا عندما نمت تحت ظروف 3D^9،10. وجدت إحدى الدراسات أن عندما كانت استزراع الخلايا السرطانية مع RAS نشطة في 3D، أنها برهنت على الوعي المتزايد بمثبطات MAPK، وعلاوة على ذلك، أن هذا النهج يمكن أن تحدد مسارات واستهدفت الموانع التي قد تكون أخطأت في 2D التقليدية الإعداد. والهدف من هذه الدراسة تقديم الأساليب المستخدمة لثقافة هذه خطوط الخلايا، وعلاوة على ذلك، تثبت التفاضلية الردود على هذه الموانع التي يمكن ملاحظتها فقط عند استخدام 3D الخلية نظم الثقافة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-استزراع من الماغنيسيوم الورم 3D 1536-جيدا

1. إعداد ورم 3D طازجة كروي جذعية متوسطة (المتوسطة خلية + خروج المغلوب المصل استبدال الأنسولين-ترانسفيرين-السيلينيوم) عن طريق إضافة الكواشف التالية إلى 500 مل من "تعديل النسور المتوسطة" دولبيكو (DMEM/F12): 1 x البنسلين/ستربتوميسين، 10 نانوغرام/مل من الإنسان أساسية تنتجها الخلايا الليفية عامل النمو (بفجف)، 20 نانوغرام/مليلتر من البشرية البشرة عامل النمو (لو)، 0.4% ألبومين المصل البقري (BSA) (جزء الخامس)، 1 x الأنسولين-ترانسفيرين-السيلنيوم، واستبدال المصل 1% خروج المغلوب (كو) (عدم تجميد أذاب).
2. عامل التصفية-تعقيم المتوسطة كامل مع الملاحق من خلال نظام تصفية أعلى زجاجة 0.4 ميكرومتر.
3. فصل خطوط خلايا السرطان، التي ظلت تنمو وفقا لشروط الثقافة الروتينية الموصى به، من قوارير زراعة الخلايا التقليدية بغسلها 3 x مع 1 x فوسفات مخزنة المالحة (PBS) وإضافة مبلغ مناسب من 0.25% التربسين (1 مل كل 5 سم²) لمدة 5 دقائق لإنشاء طبقة رقيقة فوق الخلايا. تحييد التربسين مع 5 × المبلغ للوسائط التي تحتوي على المصل والمضي قدما لعد الخلايا. على سبيل المثال، استخدام 25 مل متوسطة 5 مل التربسين.
4. ضبط تركيز حل خلية 62.5 × 10⁴ خلايا/مل من أجل البذور مجموعة خلايا 500 كل بئر في 8 ميليلتر من المتوسطة كروي في لوحات الأنسجة-الثقافة-تعامل 1536-جيدا.
5. في مجلس الوزراء سلامة بيولوجية، بذور الخلايا باستخدام كاسيت معقم، صغيرة مقلوب من الفولاذ المقاوم للصدأ مع نظام يقوم على مضخة تمعجية. بين خطوط الخلايا المختلفة، تدفق أنابيب الكاسيت مع 1 x برنامج تلفزيوني و 70% إيثانول 10 s.
6. وبدلاً من ذلك، بذور الخلايا باستخدام معالج سائل الموجود داخل غرفة هيبا تصفيتها باستخدام أما كاسيت مقلوب من الفولاذ المقاوم للصدأ معقمة، صغيرة ومضخة تمعجية أو مضخة الحقن مرفقة، اعتماداً على عدد اللوحات كل خط الخلية المطلوبة.
7. ختم لوحات استخدام ختم لوحة لاصقة تنفس أما يدوياً أو باستخدام السدادة لوحة.
8. وضع اللوحات في حاضنة لغزل في الدقيقة 10 37 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 95% و 5% ثاني أكسيد الكربون (CO₂). تسمح الماغنيسيوم إلى نموذج لمد 3.

2-استزراع خطوط السرطان 2D 1536-جيدا

ملاحظة: خطوط السرطان 2D 1536-كذلك ينبغي مثقف 24 ساعة قبل إضافة المجمع إلى لوحات ثلاثية الأبعاد.

1. تعد وسيلة خلية سرطان 2D عن طريق إضافة الكواشف التالية إلى 500 مل وسيط النمو المناسب للبنود المحددة: 1 × البنسلين/ستربتوميسين و 10% الجنين المصل البقري (FBS).
2. عامل التصفية-تعقيم المتوسطة كامل مع الملاحق من خلال نظام تصفية أعلى زجاجة 0.4 ميكرومتر.
3. فصل خطوط خلايا السرطان، التي ظلت تنمو وفقا لشروط الثقافة الروتينية الموصى به، من قوارير زراعة الخلايا التقليدية بغسلها 3 x 1 x برنامج تلفزيوني وإضافة مبلغ مناسب من 0.25% التربسين (1 مل كل 5 سم²) لمدة 5 دقائق إلى قم بإنشاء طبقة رقيقة فوق الخلايا. تحييد التربسين مع 5 × المبلغ للوسائط التي تحتوي على المصل والمضي قدما لعد الخلايا. على سبيل المثال، استخدام 25 مل متوسطة 5 مل التربسين.
4. ضبط تركيز حل خلية 62.5 × 10⁴ خلايا/مل من أجل البذور مجموعة خلايا 500 كل بئر في 8 ميليلتر الكامل المتوسطة إلى لوحات الأنسجة-الثقافة-تعامل 1536-جيدا.
5. في مجلس الوزراء سلامة بيولوجية، بذور الخلايا باستخدام كاسيت معقم، صغيرة مقلوب من الفولاذ المقاوم للصدأ مع نظام يقوم على مضخة تمعجية. بين خطوط خلية مختلفة، تدفق أنابيب الكاسيت مع 1 x العقيمة PBS و 70% إيثانول 10 s.
6. وبدلاً من ذلك، بذور الخلايا باستخدام معالج سائل الموجود داخل غرفة الروبوتات هيبا تصفيتها باستخدام أما كاسيت مقلوب من الفولاذ المقاوم للصدأ معقمة، صغيرة ومضخة تمعجية أو مضخة الحقن المرفقة، تبعاً لحجم لوحات كل خلية خط اللازمة.
7. ختم لوحات استخدام ختم لوحة لاصقة تنفس أما يدوياً أو باستخدام السدادة لوحة.
8. وضع اللوحات في حاضنة لغزل في الدقيقة 10 37 درجة مئوية عن 24 ساعة قبل إضافة مركب، مع أول أكسيد الكربون 5%₂ و 95% رطوبة نسبية.

3-مجمع بالإضافة

1. يعد تخفيف 8 نقطة، 3-fold المسلسل من مثبطات MAPK في 100% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) على روبوت مناولة السائل بتركيز أعلى 10 ملم. مثبط بروتوزوم بورتيزوميب كعنصر إيجابي لخلية كاملة قتل لتحديد النطاق الديناميكي للفحص.
2. الاعتداء السريع-تدور جميع لوحات ولوحات المركب في 100 غ س لجمع أي التكثيف. إزالة الختم لاصقة من كل لوحة ووضع لوحة على إنشاء موزع صوتية إضافة ما مجموعة 8 nL لكل مجمع/تمييع يمثلون بتركيز نهائي [دمس] 0.1% من كل بئر وجرعة مركب أعلى من 10 ميكرون.
3. بعد الانتهاء من إضافة المجمع، ضع غطاء ثقافة خلية مصنوعة خصيصا، والفولاذ المقاوم للصدأ الذي يمنع التبخر على اللوحة، ووضع اللوحة في حاضنة غزل في 37 درجة مئوية لمد 5، مع أول أكسيد الكربون 5%₂ و 95% رطوبة نسبية.

4-كشف كاشف الإضافة والحصول البيانات الخام

1. قبل الحارة حجم مناسب من الكاشف تحلل الخلية التي تحتوي على لوسيفرين للكشف عن التغييرات في الأدنين ثلاثي الفوسفات (ATP)، ومن ثم التغيرات في انتشار الخلية في درجة حرارة الغرفة أو في حمام مائي 37 درجة مئوية. إضافة إجمالي 3 ميليلتر من الكشف عن الكاشف لكل بئر باستخدام مضخة تمعجية واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل.
2. التقاط التﻷلؤ في لومينوميتير لوحة.

5-معالجة البيانات

1. استخراج البيانات الخام من الصك وتطبيع جميع الحقول التي تحتوي على مركبات اختبار المتوسط لجميع الآبار التي تحتوي على [دمس] وحدها كعنصر محايد. من هذه القيمة، حساب تثبيط نمو النسبة المئوية لكل مجمع. هذا هو إنجاز باستخدام الصيغة الدالة في Microsoft Excel حيث f (x) = {(نموذج القيمة النسبية وحدات خفيفة (رلوس)/(متوسط القيمة [دمس] رلوس) * 100)}.
2. إنشاء منحنيات الاستجابة للجرعة والمثبطة IC50s بقيم البيانات الموحدة من الخطوة 5.1 ضد تركيز مركب باستخدام برنامج الرسوم البيانية برسوم بيانية.
   ملاحظة: قمنا بتحليل البيانات باستخدام هيليوس، أداة برمجيات نيبر داخلية. لإكمال هذه المهمة، اخترنا أداة تحليل منحنى nonparametric.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

مجموعة متنوعة من الخلايا السرطانية ثابتة تم اختبار خطوط معروفة لتنمو جيدا في ظل ظروف الثقافة 2D باستخدام الأساليب المذكورة هنا. صور الممثل من مجموعة متنوعة من السرطان متحولة MAPK الخلية خطوط (كالو-6:KRAS، NCI-H1299:NRAS، كورونا-ميل-30:NRAS، وكيلونيوتن-62:HRAS) ينظر في الشكل 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الأساليب المقدمة هنا إظهار بروتوكول مفصلة حول كيفية إنتاج الماغنيسيوم ورم في لوحات 1536-جيدا لعروض مجمع على نطاق واسع. هذه الأساليب كانت في البداية مقتبسة من العمل في المعهد الوطني للسرطان حيث كانت تزرع الماغنيسيوم ورم في فحوصات الإنتاجية المنخفضة في لوحات 6-جيدا وكذلك 96 طرح أسئلة حول تبعيا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12	ATCC	30-2006	Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors.
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12	Lonza	12-604F	Purchased as a prepared solution.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Lonza	12-115Q	Purchased as a prepared solution.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Seradigm	1500-500	Purchased as a prepared solution.
1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Hyclone	SH30042.01	Purchased as a prepared solution.
1x Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140	Purchased as a prepared solution.
10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF)	Sigma	F0291	Resuspend in sterile water.
20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma	E9644	Resuspend in sterile water.
0.4% Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418	Resuspend in sterile PBS and filter.
1x Insulin Transferrin Selenium (ITS)	Gibco	51500056
1% KnockOut (KO) Serum Replacement	Gibco	10828-028	Add fresh right before use.
100% Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	276855-100ML
CellTiter-Glo	Promega	G7573	Purchased as a prepared solution.
Consumables
Small Combi Cassette	ThermoFisher	24073295
Small Multiflow Cassette	BioTek	294085
1536-well sterile TC plates (white)	Corning	3727
1536-well sterile TC plates (black)	Corning	3893
Scivax Plates	MBL International	NCP-LH384-10
Equipment
Adhesives seals	ThermoFisher	AB0718
Spinning Incubator	LiCONiC
Stainless Steel Lids	The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)
ATS Acoustic Dispensor	EDS Biosystems
Echo Acoustic Dispensor	Labcyte
Luminometer	Envision-Perkin Elmer
Peristaltic Pump- Multidrop Combi	ThermoFisher
Liquid Handler-Multiflow FX	BioTek