JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

По множеству признаков болезни более физиологически соответствующих моделей в настоящее время разработана и реализована в наркотики discovery программ. Новой модели системы, описанные здесь показано как трехмерные опухоли сфероидов может быть культивировали и показан в высок объём 1536-ну пластины системы для поиска новых онкологических препаратов.

Аннотация

Раковые клетки регулярно были культивировали в двух измерениях (2D) на пластиковую поверхность. Этот метод, однако, не хватает истинной окружающей среды опухоль массы подвергается в естественных условиях. Солидные опухоли расти не как лист придает пластик, но вместо, как коллекция клоновых клеток в трехмерное (3D) пространство, взаимодействующих с их соседями и различных пространственных свойств, таких как нарушение нормальной клеточной полярности. Эти взаимодействия вызывают 3D-культивируемых клеток приобрести морфологических и клеточных характеристик, которые являются более актуальными для опухоли в естественных условиях . Кроме того, опухоль массы находится в прямом контакте с другими типами клеток, таких как стромы и иммунных клеток, а также внеклеточная матрица от всех других типов клеток. Матрица на хранение состоит из макромолекул как коллагена и фибронектина.

В попытке увеличить перевод результатов исследований в онкологии от скамьи в постели многие группы начали расследовать использование 3D модели систем в их стратегиях развития наркотиков. Эти системы являются считается более физиологически соответствующих потому, что они пытаются напомнить сложной и неоднородной среды опухоли. Эти системы, однако, могут быть довольно сложными, и, хотя поддаются роста в 96-луночных форматов и теперь даже в 384, они предлагают несколько вариантов для крупномасштабного роста и скрининг. Это наблюдается разрыв привела к разработке методов, описанных здесь подробно сфероидов опухоли культуры в качестве высокой пропускной способностью в 1536-ну пластины. Эти методы представляют собой компромисс высоко сложных систем на основе матрицы, которые трудны для экрана и обычных 2D анализов. Различных линий клеток рака, укрывательство различные генетические мутации, успешно проверяются, изучение составных эффективность с помощью куратор библиотеки соединений, ориентация Mitogen-Activated протеинкиназы или MAPK путь. Сфероида культуры ответы затем сравниваются в ответ клеток, выращиваемых в 2D, и дифференцированного деятельности сообщается. Эти методы предоставляют уникальный протокол для тестирования соединения деятельности в условиях 3D высокой пропускной способности.

Введение

В последнее десятилетие все больше и больше исследований реализовали использование 3D клетки культуры моделей понять концепции, которые не являются полностью резюмировалась ростом клеток в 2D на пластик. Примеры этих концепций вносимых в нормальной эпителиальных клеток полярности1 где теряются пространственной ориентации апикальной и базального слоя клеток, а также роль внеклеточного матрикса в регулировании выживания и судьбу клеток. В частности, исследований онкологии, использовала 3D модели понять основные биологии раковых клеток и различия между 2D и 3D клетки культуры систем3,4. Развитие более изощренные методы культуры клетки и их дальнейшей адаптации в нескольких хорошо форматы позволило Поиск новых лекарств в 3D параметры. В отличие от клеток, выращенной в условиях, 2D, 3D модели диапазона опухоли в сложности от слоистых сотовых систем5 однотипных клеток сфер различных размеров, до сложных сферах multi-многомодульному-тип6,7, 8. Открытие новых соединений или биопрепаратов, который мощно вызывают гибель клеток в этих системах 3D модель является, таким образом, высокий интерес к кампании развития наркотиков. Конечные точки этих анализов часто идентичны выполняемым в 2D культур для оценки изменений в клеточной пролиферации, но при проводимых в более физиологически соответствующие настройки, они могут выявить истинный уровень зависимостей целевого гена или путь допрашивали.

Как ввели выше, различные модели системы были разработаны для изучения наркотиков ответы в системах 3D культуры, но большинство использовать либо 96 или 384-ну микротитровальных пластины и не легко адаптируется для высокопроизводительного скрининга (HTS) форматов, часто используется в кампании скрининг обнаружения наркотиков. Такие системы включают в себя использование висит капелька технологий, сфероиде культур, пульсирующие клетки с магнитными частицами побудить левитация и культур, включающих природные или синтетические гели как коллаген, Matrigel или полиэтиленгликоля (PEG)2 . Здесь мы представляем подробные методы ранее разработанной методики производить 3D сфероида культур от установленных рак клеточных линий в формате 1536-ну пластины. В этом протоколе весьма определенный средний используется который предотвращает прикрепление обычно адэрентных клеток линии9. Эта система имеет ограничения (т.е., он не может полностью пилки сложную модель системы рака), но тем не менее, эти анализы позволяют высокопроизводительного скрининга больших коллекций малых молекул и поперек сравнения ответ наркотиков 2D и 3D культур против различных клеточных линий и соединений.

Линии клетки выбран для демонстрации методов в этой статье все гавани мутации в генах, относящиеся к MAPK, сигнальный путь, путь, который является весьма dysregulated в рак, и для которых многие терапии доступны. Многие из линии имеют активации онкогенных мутаций в также называют крас, нейробластома ран или НКО, онкогена вируса саркомы Харви крыса или HRA и связанные киназы быстро ускорения фибросаркомы, также известный как вирус Кирстен крыса саркома ПСУР. Последние литературы показывает, что ингибиторы различных узлов этот путь однозначно более эффективным в подмножестве клеточных линий при выращивании под 3D условия9,10. Одно исследование показало, что, когда раковые клетки с активной РАН были культивировали в 3D, они продемонстрировали повышенная чувствительность к MAPK ингибиторы и далее, что такой подход мог бы определить пути и целенаправленных ингибиторов, которые могут быть пропущены в традиционные 2D Настройка. Цель этого исследования заключается в настоящее время методы, используемые для культуры этих клеточных линий, и далее, чтобы продемонстрировать разницу ответы на этих ингибиторов, которые могут наблюдаться только при использовании 3D клеточной культуры систем.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. культивирование сфероидов 1536-ну 3D опухоли

  1. Подготовьте свежие 3D опухоли сфероида Средний стебель (ячейки среднего + нокаут сыворотки замены инсулина трансферрина селен), добавив следующие реагенты до 500 мл Дульбекко изменения среды орлы (DMEM/F12): 1 x пенициллина/стрептомицина, 10 нг/мл человека Основные фибробластический фактор роста (bFGF), 20 нг/мл человеческого эпидермального фактора роста (EGF), 0,4% бычьим сывороточным альбумином (БСА) (часть V), 1 x инсулин трансферрина Селена и замена 1% нокаут (KO) сыворотки (не замораживания оттаивания).
  2. Фильтр стерилизации всей среды с добавки через систему верхней бутылки фильтр 0,4 мкм.
  3. Отсоединить рак клеточных линий, которые росли согласно условий рекомендованные повседневной культуры, от традиционной культуре клетки колбы, омыв им 3 x 1 x фосфат буфер солевой раствор (PBS) и добавить соответствующее количество трипсин 0.25% (от 1 мл в 5 см2) за 5 мин для создания тонкого слоя клеток. Нейтрализовать трипсина с 5 x количество среды, содержащей сыворотку и приступить к подсчитать количество ячеек. Например используйте 25 мл среды для 5 мл трипсина.
  4. Регулировка концентрации клетки решение 62,5 x 104 клеток/мл для семян в общей сложности 500 клеток / колодец в 8 мкл сфероида среды в 1536-ну ткани Культура лечение пластины.
  5. В биологической безопасности кабинета семян клетки, с использованием стерилизованные, небольшие кассету с наконечником из нержавеющей стали с системой на основе перистальтического насоса. Между различными клеточных линий, промойте трубы кассету с 1 x PBS и 70% этанол 10 s.
  6. Кроме того семена клетки с помощью жидкого обработчика находится в пределах комнаты НЕРА фильтрации, стерилизованные, небольшие кассету с наконечником из нержавеющей стали и Перистальтический насос или прилагаемый шприцевый насос, в зависимости от количество пластин на линию клеток требуется.
  7. Уплотнение пластины с помощью дышащей клейкой пластины печать либо вручную или sealer пластины.
  8. Поместите пластины в инкубатор спиннинг на 10 об/мин и 37 ° C с относительной влажности 95% и 5% двуокиси углерода (CO2). Разрешить сфероидов форму для 3 d.

2. выращивание 1536-ну 2D рака линий

Примечание: 1536-ну 2D рака линии следует культивированный 24 h перед добавлением резиновой смеси 3D пластины.

  1. Подготовка среднего 2D рак клеток путем добавления следующих реагентов 500 мл среды соответствующего роста для выбранных строк: 1 x бычьим сывороточным пенициллина/стрептомицина и 10% плода (ФБС).
  2. Фильтр стерилизации всей среды с добавки через систему верхней бутылки фильтр 0,4 мкм.
  3. Отсоединить рак клеточных линий, которые росли согласно условий рекомендованные повседневной культуры, от традиционной культуре клетки колбы, омыв им 3 x 1 x PBS и добавить соответствующее количество трипсин 0.25% (1 мл на 5 см2) за 5 мин до Создайте тонкий слой над клетки. Нейтрализовать трипсина с 5 x количество среды, содержащей сыворотку и приступить к подсчитать количество ячеек. Например используйте 25 мл среды для 5 мл трипсина.
  4. Регулировка концентрации клеток решение 62,5 x 104 клеток/мл для семян в общей сложности 500 клеток на скважину в 8 мкл полной среды в 1536-ну ткани Культура лечение пластины.
  5. В биологической безопасности кабинета семян клетки, с использованием стерилизованные, небольшие кассету с наконечником из нержавеющей стали с системой на основе перистальтического насоса. Между различными клеточных линий, промойте трубы кассету с 1 x стерильные PBS и 70% этанол 10 s.
  6. Кроме того семя клетки с помощью жидкого обработчика находится в пределах комнаты НЕРА фильтрации робототехники, использованием стерилизованные, небольшие кассету с наконечником из нержавеющей стали и Перистальтический насос или прилагаемый шприцевый насос, в зависимости от объема плит в клетку линия, необходимых.
  7. Уплотнение пластины с помощью дышащей клейкой пластины печать либо вручную или sealer пластины.
  8. Поместите пластины в инкубатор спиннинг на 10 об/мин и 37 ° C в течение 24 ч до соединения того, с 5% CO2 и 95% относительной влажности.

3. составные дополнение

  1. Подготовка 8-точка, 3 раза серийный разведений MAPK ингибиторов в 100% диметилсульфоксида (ДМСО) на робота обработки жидкости с концентрацией Топ 10 мм. Ингибитор протеасом Бортезомиб используется как позитивный элемент управления для полного ячейки, убив определить динамический диапазон assay.
  2. Быстрый спина все пробирного пластины и соединения плит на 100 x g для сбора любых конденсации. Удалить клей уплотнение из каждой пластины и место тарелку на акустических распределитель настройки для добавления в общей сложности 8 nL каждого соединения/разрежения, представляющие конечной концентрации 0,1% ДМСО в колодец и топ составные дозы 10 мкм.
  3. После завершения добавления соединения, установите крышку культуры клеток на заказ, из нержавеющей стали, которая предотвращает испарение на тарелку и поместите пластины в спиннинг инкубатора при 37 ° C для 5 d с 5% CO2 и 95% относительной влажности.

4. Обнаружение реагент сложения и обретение необработанных данных

  1. Предварительно теплой достаточное количество реагента лизис клеток, содержащих люциферин обнаружить изменения в аденин трифосфата (АТФ) и, таким образом, изменения в пролиферации клеток при комнатной температуре или в ванну воды 37 ° C. Добавить в общей сложности 3 мкл Реагента обнаружения для каждой скважины с использованием перистальтического насоса и инкубировать пластины при комнатной температуре в течение по крайней мере 15 минут.
  2. Захват люминесценции на тарелку люминометра.

5. обработка данных

  1. Извлечение исходных данных из инструмента и нормализовать все поля, содержащие испытания соединений в среднем всех скважин, содержащие ДМСО только как нейтральный элемент управления. Из этого значения Вычислите процент роста торможение каждого соединения. Это выполняется с использованием функцию формул в Microsoft Excel где f (x) = {(образец значение относительной легких единиц (RLUs) / (среднее значение RLUs ДМСО) * 100)}.
  2. Графические значения нормализованных данных из шага 5.1 против составные концентрации, используя программу построения диаграмм для создания кривых доза реакция и тормозной IC50s.
    Примечание: Мы проанализировали данные с помощью Helios, внутренний инструмент программного обеспечения исследований. Для выполнения этой функции, мы выбрали средство анализа непараметрических кривой.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Целый ряд установленных раковых клеток, что линии, известный расти при условиях 2D культуры были протестированы с использованием методов, описанных здесь. Представитель изображений из различных MAPK мутант рака клеток линии (Калу-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-МЕЛ-30:NRAS и КНС-62:HRAS) показа?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Представленные здесь методы демонстрируют подробный протокол о том, как производить сфероидов опухоли в 1536-ну пластины для крупномасштабных составные показы. Эти методы были изначально адаптировано из работы в национальном институте рака, где опухоли сфероидов были выращены в низкой...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы являются сотрудниками Новартис, и некоторые сотрудники также акционеров.

Благодарности

Авторы хотели бы признать Марк Феррер в национальном центре для продвижения трансляционная наук, национальные институты здравоохранения за его поддержку и руководство по первоначальной разработки этих анализов. Кроме того мы хотели бы поблагодарить Alyson Freeman, Мариэла Jaskelioff, Майкл Acker, Джейкоб Haling и официальное Cooke за их научного вклада и обсуждения как членов команды проекта.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12ATCC30-2006Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors.
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12Lonza12-604FPurchased as a prepared solution.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)Lonza12-115QPurchased as a prepared solution.
Fetal Bovine Serum (FBS)Seradigm1500-500Purchased as a prepared solution.
1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)HycloneSH30042.01Purchased as a prepared solution.
1x Penicillin/StreptomycinGibco15140Purchased as a prepared solution.
10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF)SigmaF0291Resuspend in sterile water.
20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF)SigmaE9644Resuspend in sterile water.
0.4% Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA9418Resuspend in sterile PBS and filter.
1x Insulin Transferrin Selenium (ITS)Gibco51500056
1% KnockOut (KO) Serum ReplacementGibco10828-028Add fresh right before use.
100% Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma276855-100ML
CellTiter-GloPromegaG7573Purchased as a prepared solution.
Consumables
Small Combi CassetteThermoFisher24073295
Small Multiflow CassetteBioTek294085
1536-well sterile TC plates (white)Corning3727
1536-well sterile TC plates (black)Corning3893
Scivax PlatesMBL InternationalNCP-LH384-10
Equipment
Adhesives sealsThermoFisherAB0718
Spinning IncubatorLiCONiC
Stainless Steel LidsThe Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)
ATS Acoustic DispensorEDS Biosystems
Echo Acoustic DispensorLabcyte
LuminometerEnvision-Perkin Elmer
Peristaltic Pump- Multidrop CombiThermoFisher
Liquid Handler-Multiflow FXBioTek

Ссылки

  1. Lee, M., Vasioukhin, V. Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor. Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).
  2. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  3. Weigelt, B., Ghajar, C. M. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).
  4. Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).
  5. Li, L., Lu, Y. Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts. Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).
  6. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  7. Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies. Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).
  8. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
  9. Mathews Griner, L. A., et al. Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells. Cell Death & Disease. 7 (12), e2492(2016).
  10. Polo, M. L., et al. Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice. PLoS One. 5 (5), e10786(2010).
  11. Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
  12. Bhargava, A., et al. Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Elife. 5, e09976(2016).
  13. Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells. Molecular Cancer. 9, 267(2010).
  14. Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer. Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).
  15. Mathews, L. A., et al. Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells. Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).
  16. Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
  17. Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
  18. Sun, L., et al. Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells. Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).
  19. Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
  20. Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
  21. Herter, S., et al. A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1393D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены