Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas

Resumo

Uma grande variedade de indicações de doença, modelos mais fisiologicamente relevantes estão sendo programas de descoberta de drogas desenvolvida e implementada em. O novo sistema de modelo aqui descrito demonstra como tridimensional tumor esferoides podem ser cultivadas e exibidos em um sistema de baseado em placa de 1536-bem elevado-throughput para pesquisar novas drogas de Oncologia.

Resumo

As células cancerosas rotineiramente têm sido cultivadas em duas dimensões (2D) em uma superfície de plástico. Esta técnica, no entanto, carece o verdadeiro ambiente um tumor massa é exposta ao vivo em. Tumores sólidos crescem não como uma folha anexada ao plástico, mas em vez disso como uma coleção de células clonais em um tridimensional (3D) espaço interagindo com seus vizinhos e com distintas Propriedades espaciais tais como o rompimento da polaridade celular normal. Essas interações causam células 3D-cultivadas para adquirir características morfológicas e celulares que são mais relevantes para tumores na vivo . Além disso, um tumor em massa está em contato direto com outros tipos de células, como células do estroma e imunes, bem como de todos os outros tipos de células, a matriz extracelular. A matriz depositada é composta de macromoléculas como o colágeno e fibronectina.

Na tentativa de aumentar a tradução dos resultados da investigação em oncologia do banco ao lado da cama, muitos grupos começaram a investigar o uso de sistemas de modelo 3D em suas estratégias de desenvolvimento de drogas. Estes sistemas são pensados para ser mais fisiologicamente relevantes porque eles tentam recapitular o ambiente heterogêneo e complexo de um tumor. Estes sistemas, no entanto, podem ser bastante complexos, e, embora passível de crescimento em formatos de 96 poços e alguns agora mesmo em 384, oferecem poucas opções para o crescimento em grande escala e triagem. Este observado lacuna levou ao desenvolvimento dos métodos aqui descritos pormenorizadamente esferoides de tumor de cultura em uma capacidade de alta produtividade em placas de 1536-bem. Esses métodos representam um compromisso aos sistemas baseados na matriz altamente complexos, que são difíceis de tela e ensaios 2D convencionais. Uma variedade de linhas de células de câncer abrigando diferentes mutações genéticas são rastreados com êxito, examinando a eficácia do composto usando uma biblioteca com curadoria de compostos visando o caminho Mitogen-Activated proteína quinase ou MAPK. As respostas de cultura esferoide são então comparadas com a resposta das células cultivadas em 2D, e diferenciais atividades são relatadas. Esses métodos fornecem um protocolo exclusivo para testes de atividade composta num ambiente 3D de alto rendimento.

Introdução

Na última década, cada vez mais estudos têm implementado o uso de modelos de cultura celular 3D para entender conceitos que não são totalmente instaurados pelo crescimento de células em 2D em plástico. Exemplos desses conceitos incluem as alternâncias na célula epitelial normal polaridade¹ onde a orientação espacial das camadas basais e apicais das células são perdidos, bem como o papel da matriz extracelular na regulação da sobrevivência e destino da célula. Pesquisa de Oncologia, em particular, tem usado modelos 3D para entender a biologia básica das células cancerosas e as diferenças entre 2D e 3D celular cultura sistemas^3,4. O desenvolvimento de técnicas mais sofisticadas de cultura celular e sua adaptação adicional para formatos múltiplos bem permitiu a busca de novas drogas nas configurações 3D. Em contraste com células cultivadas sob condições 2D, modelos 3D de variedade de tumores em complexidade de sistemas celulares em camadas⁵ single-célula do tipo esferas de tamanhos diferentes, para o complexo de multi-cell-tipo de esferas^{6,7, 8}. a descoberta de novos compostos ou produtos biológicos que induzem a morte celular potente nestes sistemas modelo 3D é, portanto, de grande interesse nas campanhas de desenvolvimento de drogas. Pontos de extremidade destes ensaios muitas vezes são idênticos às realizadas em culturas 2D para avaliar alterações na proliferação celular, mas quando realizado em uma configuração mais fisiologicamente relevante, eles podem revelar o verdadeiro nível de dependência do gene alvo ou caminho sendo interrogado.

Como apresentado acima, uma variedade de sistemas modelo foram desenvolvidos para estudar respostas de drogas nos sistemas de cultura 3D, mas a maioria usa ou placas de microtitulação de 96 ou 384-bem e não é facilmente adaptável para os formatos de elevado-throughput screening (HTS) geralmente usados em campanhas de rastreio droga descoberta. Tais sistemas incluem o uso de tecnologias da gota, culturas de esferoide, células com partículas magnéticas para induzir a levitação, culturas e incorporando géis naturais ou sintéticas, como o colágeno, Matrigel ou polietileno glicol (PEG)^{2 a pulsar de suspensão} . Aqui, apresentamos os métodos detalhados de uma técnica previamente desenvolvido para produzir culturas 3D esferoide de linhas de células de câncer estabelecido em um formato de placa 1536. Neste protocolo, um meio altamente definido é usado que impede a fixação de linhas de células normalmente aderentes⁹. Este sistema tem limitações (ou seja, é totalmente não pode recapitular um sistema complexo modelo de câncer), mas, no entanto, estes ensaios permitem uma seleção de alto rendimento de grandes coleções de pequenas moléculas e comparações transversalmente da resposta da droga entre 2D e 3D culturas contra uma variedade de linhas de células e compostos.

As linhas de células selecionado para demonstrar os métodos neste artigo todos harbor mutações em genes relacionados com a MAPK, sinalizando o caminho, um caminho que é altamente prejudicado em câncer, e para que muitos terapêutica estão disponíveis. Muitas das linhas tem ativação oncogênicas mutações no vírus Kirsten Rat Sarcoma também conhecido como KRAS, o RAS Neuroblastoma ou ARN, do oncogene do vírus Harvey Rat Sarcoma ou HRAS e os associado quinases Fibrosarcomas rapidamente acelerado, também conhecido como Bruno. Literatura recente sugere que os inibidores de diferentes nós deste percurso são excepcionalmente mais eficazes em um subconjunto das linhas celulares quando cultivadas sob condições 3D^9,10. Um estudo descobriu que quando as células cancerosas com RAS ativo foram cultivadas em 3D, eles demonstraram uma sensibilidade aumentada aos inibidores de MAPK e ainda mais, que esta abordagem poderia identificar caminhos e alvo inibidores que podem ser perdidos em 2D tradicional configuração. O objetivo deste estudo é apresentar os métodos de cultura destas linhas de celular, e ainda mais, para demonstrar o diferencial de respostas para estes inibidores que podem ser observadas somente quando estiver usando 3D célula sistemas de cultura.

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Protocolo

1. cultivo de esferoides Tumor 1536-bem 3D

1. Preparar um tronco médio tumor 3D fresco esferoide (substituição de soro de nocaute, meio celular + selênio-insulina-transferrina), adicionando os seguintes reagentes para 500 mL de meio de águias de modificado de Dulbecco (DMEM/F12): 1 x penicilina/estreptomicina, 10 ng/mL de humanos básico fator de crescimento fibroblástico (bFGF), 20 ng/mL de humano fator de crescimento epidérmico (EGF), 0,4% albumina de soro bovino (BSA) (fração V), 1 x insulina-transferrina-selênio e substituição de soro 1% nocaute (KO) (não congelamento-descongelamento).
2. Filtro-esterilize o meio inteiro com os suplementos através de um sistema de filtro de garrafa-topo 0,4 µm.
3. Destacar as linhas de células de câncer, que tem vindo a crescer de acordo com as condições de cultura de rotina recomendado, dos frascos de cultura celular tradicional lavando-os 3 x com fosfato 1x tampão salino (PBS) e adicionando uma quantidade apropriada de tripsina 0,25% (1 mL por 5cm²) por 5 min criar uma camada fina sobre as células. Neutralizar a tripsina com 5 x a quantidade do meio contendo o soro e proceder a contagem das células. Por exemplo, use 25 mL de meio para 5 mL de tripsina.
4. Ajuste a concentração da solução de célula a 62,5 x 10⁴ células/mL para um total de 500 células por poço em 8 µ l de meio de esferoide de sementes para as placas de tecido-cultura-Tratado de 1536-bem.
5. Em uma câmara de segurança biológica, propagar as células usando uma fita de aço inox-ponta esterilizada, pequena com um sistema de bomba peristáltica-base. Entre as linhas de célula diferente, irrigue o tubo da fita com 1X PBS e 70% etanol por 10 s.
6. Alternativamente, as sementes as células usando um manipulador líquido localizado dentro de um quarto de HEPA-filtrado usando uma fita de aço inox-ponta esterilizada, pequena e uma bomba peristáltica ou uma bomba de seringa anexado, dependendo do número de placas por célula linha necessária.
7. Sele as placas usando um selo de placa adesiva respirável ou manualmente ou usando um aferidor de placa.
8. Coloque as placas em uma incubadora de fiação fixado em 10 rpm e 37 ° C com 5% de dióxido de carbono (CO₂) e 95% de humidade relativa. Permitir que os esferoides ao formulário para 3-d.

2. cultivo de linhas 2D 1536-bem câncer

Nota: As linhas de câncer 2D 1536-bem devem ser cultivadas 24 h antes da adição do composto com as placas 3D.

1. Preparar um meio de células de câncer 2D, adicionando os seguintes reagentes a 500 mL de um meio de cultura apropriado para as linhas selecionadas: 1 x penicilina/estreptomicina e 10% soro bovino fetal (FBS).
2. Filtro-esterilize o meio inteiro com os suplementos através de um sistema de filtro de garrafa-topo 0,4 µm.
3. Destacar as linhas de células de câncer, que tem vindo a crescer de acordo com as condições de cultura de rotina recomendado, dos frascos de cultura celular tradicional lavando-os 3 x com 1X PBS e adicionando uma quantidade apropriada de tripsina 0,25% (1 mL por 5 cm²) por 5 min para Crie uma camada fina sobre as células. Neutralizar a tripsina com 5 x a quantidade do meio contendo o soro e proceder a contagem das células. Por exemplo, use 25 mL de meio para 5 mL de tripsina.
4. Ajuste a concentração da solução de célula a 62,5 x 10⁴ células/mL para um total de 500 células por poço em 8 µ l de meio completo de sementes em placas de tecido-cultura-Tratado de 1536-boas.
5. Em uma câmara de segurança biológica, propagar as células usando uma fita de aço inox-ponta esterilizada, pequena com um sistema de bomba peristáltica-base. Entre as linhas de célula diferente, irrigue o tubo da fita com 1X PBS estéril e de 70% etanol por 10 s.
6. Alternativamente, propagar as células usando um manipulador líquido localizado dentro de uma sala de robótica HEPA-filtrado usando uma fita de aço inox-ponta esterilizada, pequena e uma bomba peristáltica ou a bomba de seringa anexado, dependendo do volume das placas por célula linha necessária.
7. Sele as placas usando um selo de placa adesiva respirável ou manualmente ou usando um aferidor de placa.
8. Coloque as placas em uma incubadora de fiação fixado em 10 rpm e 37 ° C por 24 h antes da adição de composto, com 5% CO₂ e 95% de humidade relativa.

3. compostos de adição

1. Prepare diluições de 8 pontos, 3 vezes seriais de inibidores MAPK em 100% dimetilsulfóxido (DMSO) em um robô de manipulação de líquido com uma concentração superior de 10 mM. O inibidor de proteossomo Bortezomib é usado como um controle positivo para uma célula completa matando para determinar a gama dinâmica do ensaio.
2. Rápido-gire todo ensaio placas e placas compostas em 100 g de x para coletar qualquer condensação. Remova o selo de adesivo de cada prato e coloque uma placa em uma afinação acústica dispensador para adicionar um total de 8 nL de cada composto/diluição, representando uma concentração final de 0,1% DMSO por alvéolo e uma dose superior composta de 10 µM.
3. Após a adição do composto é concluída, coloque uma tampa de cultura celular feito sob medida, de aço inoxidável que evita a evaporação sobre a chapa e coloque a placa em uma incubadora de fiação a 37 ° C para a 5D, com 5% CO₂ e 95% de humidade relativa.

4. detecção adição de reagente e a aquisição de dados brutos

1. Pré-aquecer um volume adequado de um reagente de lise celular contendo luciferina para detectar alterações em trifosfato (ATP), adenina e, assim, as alterações a proliferação celular em temperatura ambiente ou em banho maria a 37 ° C. Adicionar um total de 3 µ l de reagente a deteção a cada poço usando uma bomba peristáltica e incube a placa na temperatura ambiente pelo menos 15 min.
2. Capture a luminescência luminómetro uma placa.

5. processamento de dados

1. Extrair os dados brutos do instrumento e normalizar todos os campos que contêm compostos de teste para a média de todos os poços contendo DMSO sozinho como o controle de neutro. Partir deste valor, calcule a inibição do crescimento percentual de cada composto. Isso é concluído usando a função fórmula no Microsoft Excel onde f (x) = {(amostra de unidades de luz valor relativo (RLUs) / (média de valor de DMSO RLUs) * 100)}.
2. Gere as curvas dose-resposta e IC50s inibitório representando graficamente os valores de dados normalizados da etapa 5.1 contra a concentração de compostos usando um programa gráfico.
   Nota: Foram analisados os dados usando o Helios, uma ferramenta de software interna NIBR. Para completar esta função, selecionamos a ferramenta de análise de curva não paramétrico.

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Resultados

Uma variedade de células de câncer estabelecido linhas conhecidas para crescer bem em condições de cultura 2D foram testadas usando os métodos descritos aqui. Linhas de células de imagens representativas de uma variedade de câncer mutante MAPK (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS e KNS-62:HRAS) são vistos na Figura 1. Essas imagens demonstram que, embora as linhas de celular têm diversas morfologias, cada um formado estruturas 3D nas placas d...

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Discussão

Os métodos apresentados aqui demonstram um protocolo detalhado sobre como produzir esferoides de tumor em placas de 1536-bem para as sessões de composto em grande escala. Esses métodos foram inicialmente adaptados do trabalho no Instituto Nacional de câncer onde esferoides de tumor foram cultivadas em ensaios de baixa produtividade em placas 6-poços e 96 poços para fazer perguntas sobre genéticas dependências e sensibilidade composto^{13, 14 ,}

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12	ATCC	30-2006	Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors.
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12	Lonza	12-604F	Purchased as a prepared solution.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Lonza	12-115Q	Purchased as a prepared solution.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Seradigm	1500-500	Purchased as a prepared solution.
1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Hyclone	SH30042.01	Purchased as a prepared solution.
1x Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140	Purchased as a prepared solution.
10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF)	Sigma	F0291	Resuspend in sterile water.
20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma	E9644	Resuspend in sterile water.
0.4% Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418	Resuspend in sterile PBS and filter.
1x Insulin Transferrin Selenium (ITS)	Gibco	51500056
1% KnockOut (KO) Serum Replacement	Gibco	10828-028	Add fresh right before use.
100% Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	276855-100ML
CellTiter-Glo	Promega	G7573	Purchased as a prepared solution.
Consumables
Small Combi Cassette	ThermoFisher	24073295
Small Multiflow Cassette	BioTek	294085
1536-well sterile TC plates (white)	Corning	3727
1536-well sterile TC plates (black)	Corning	3893
Scivax Plates	MBL International	NCP-LH384-10
Equipment
Adhesives seals	ThermoFisher	AB0718
Spinning Incubator	LiCONiC
Stainless Steel Lids	The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)
ATS Acoustic Dispensor	EDS Biosystems
Echo Acoustic Dispensor	Labcyte
Luminometer	Envision-Perkin Elmer
Peristaltic Pump- Multidrop Combi	ThermoFisher
Liquid Handler-Multiflow FX	BioTek