Generación de esferoides tumorales tridimensional de alto rendimiento para la detección de drogas

Resumen

En una amplia variedad de indicaciones de enfermedad, modelos más fisiológico relevantes están siendo programas de descubrimiento de drogas desarrollado e implementado en. El nuevo sistema del modelo aquí descrito muestra tumor cómo tridimensional de esferoides pueden ser cultivados y defendidos en un sistema de base de placa de alto rendimiento 1536-bien buscar nuevos medicamentos de Oncología.

Resumen

Las células cancerosas han sido cultivadas habitualmente en dos dimensiones (2D) en una superficie de plástico. Esta técnica, sin embargo, carece de un tumor verdadero medio ambiente masa está expuesta a en vivo. Tumores sólidos crecen no como una hoja de plástico, pero en su lugar como una colección de células clonales en una tridimensional (3D) espacio interactuando con sus vecinos y con distintas propiedades espaciales como la alteración de la polaridad celular normal. Estas interacciones provocan las células cultivadas 3D adquieren características morfológicas y celulares que son más relevantes para tumores en vivo . Además, un tumor masa está en contacto directo con otros tipos celulares como células stromal e inmunes, así como la matriz extracelular de todos los tipos de célula. La matriz depositada se compone de macromoléculas como colágeno y fibronectina.

En un intento por aumentar la traducción de resultados de la investigación en oncología de banco a cabecera, muchos grupos han comenzado a investigar el uso de sistemas de modelo 3D en sus estrategias de desarrollo de drogas. Estos sistemas son probablemente más fisiológico relevantes porque intentar recapitular el ambiente complejo y heterogéneo de un tumor. Estos sistemas, sin embargo, pueden ser bastante complejos y, aunque susceptibles de crecimiento en formatos de 96 pozos y algunos incluso en 384, ofrecen pocas opciones para el crecimiento a gran escala y proyección. Esto observado diferencia ha conducido al desarrollo de los métodos descritos aquí en detalle esferoides tumorales de cultura en una capacidad de alto rendimiento en placas 1536 pocillos. Estos métodos representan un compromiso para los sistemas basados en matriz muy complejos, que son difíciles de pantalla y los análisis 2D convencionales. Una variedad de líneas celulares de cáncer que diferentes mutaciones genéticas son correctamente evaluados, examinar eficacia compuesto mediante el uso de una biblioteca de comisariado de compuestos contra el camino del Kinase de proteína Mitogen-Activated o MAPK. Las respuestas de la cultura de esferoide entonces se compararon con la respuesta de las células cultivadas en 2D, y se divulgan actividades diferenciadas. Estos métodos proporcionan un protocolo único para las pruebas de actividad compuesto en un entorno 3D de alto rendimiento.

Introducción

En la última década, cada vez más estudios han implementado el uso de modelos de cultura celular 3D para entender conceptos que no son completamente recapitulados por cultivo de células en 2D en el plástico. Ejemplos de estos conceptos incluyen las alteraciones en células epiteliales normales polaridad¹ donde la orientación espacial de las capas basals y apicales de las células se pierden, así como el papel de la matriz extracelular en la regulación de la supervivencia y el destino celular. Investigación oncológica, en particular, ha utilizado modelos 3D para entender la biología básica de las células cancerosas y las diferencias entre 2D y 3D de la célula cultura sistemas^3,4. El desarrollo de técnicas más sofisticadas de la cultura de célula y su posterior adaptación a formatos múltiples bien ha permitido la búsqueda de nuevos fármacos en entornos 3D. En contraste con las células cultivadas bajo condiciones de 2D, modelos en 3D de la gama de tumores en la complejidad de sistemas celulares⁵ esferas solo tipo de células de diferentes tamaños, esferas de celdas de tipo complejo^{6,7, 8}. el descubrimiento de nuevos compuestos o productos biológicos que potentemente inducen muerte celular en estos sistemas de modelo 3D es, por tanto, de gran interés en las campañas de desarrollo de drogas. Puntos finales de estos ensayos son a menudo idénticos a los realizados en culturas 2D para evaluar los cambios en la proliferación celular, pero cuando llevó a cabo en un entorno más fisiológicamente relevante, puede revelar el verdadero nivel de dependencia de la gene de la blanco o vía interrogado.

Como anteriormente, se han desarrollado una variedad de sistemas modelo para estudiar las respuestas de la droga en los sistemas de cultivo 3D, pero la mayoría utiliza o placas de microtitulación de 96 o 384 pocillos y no es fácilmente adaptable a los formatos de high-throughput screening (HTS) de uso frecuente en campañas de proyección de descubrimiento de drogas. Tales sistemas incluyen el uso de colgantes tecnologías de gotita, culturas del esferoide, pulsátil de las células con partículas magnéticas para inducir la levitación y las culturas incorpora geles naturales o sintéticos tales como colágeno, Matrigel o polietilenglicol (PEG)² . Aquí, presentamos los métodos detallados de una técnica previamente desarrollado para producir cultivos 3D esferoide de líneas celulares de cáncer establecido en un formato de placa de la pozo 1536. En este protocolo, se utiliza un medio altamente definido que evita que el accesorio de celular normalmente adherente líneas⁹. Este sistema tiene limitaciones (es decir, no puede recapitular completamente un sistema modelo complejo de cáncer), pero sin embargo, estos ensayos permiten una proyección de alto rendimiento de grandes colecciones de moléculas pequeñas y transversales comparaciones de la respuesta de la droga entre las culturas 2D y 3D contra una variedad de líneas de células y compuestos.

Las líneas celulares seleccionaron para demostrar los métodos en este artículo todo Puerto mutaciones en genes relacionados con la vía, un camino que es muy desequilibrada en el cáncer, de señalización de MAPK y de que muchos tratamientos están disponibles. Muchas de las líneas tienen activación oncogénicas mutaciones en el virus del Sarcoma de rata Kirsten también denominado KRAS, el RAS de Neuroblastoma o ANR, oncogene del virus del Sarcoma de Harvey rata o HRAS y las quinasas asociadas rápidamente acelerado Fibrosarcomas, también conocido como RAFs. La literatura reciente sugiere que los inhibidores de distintos nodos de esta vía son únicamente más eficaces en un subgrupo de las líneas celulares cuando se cultivan bajo condiciones 3D^9,10. Un estudio encontró que cuando las células cancerosas con RAS activa fueron cultivadas en 3D, demostró una mayor sensibilidad a los inhibidores de la MAPK y además, que este enfoque podría identificar vías y dirigido inhibidores que podrían perderse en el tradicional 2D ajuste. El objetivo de este estudio es presentar los métodos utilizados para estas líneas celulares de la cultura, y además, para demostrar el diferencial de las respuestas a estos inhibidores que se pueden observar solamente cuando se usa 3D celular sistemas de cultivo.

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Protocolo

1. cultivo de esferoides de Tumor bien 1536 3D

1. Preparar un tallo mediano fresco 3D tumor esferoide (medio celular + recambio de nocaut suero insulina-transferrina-selenio) mediante la adición de los reactivos siguientes a 500 mL de medio de águilas modificado de Dulbecco (DMEM/F12): 1 x penicilina/estreptomicina, 10 ng/mL de humanos factor de crecimiento básico del fibroblasto (bFGF), 20 ng/mL de humano factor de crecimiento epidérmico (EGF), 0.4% albúmina de suero bovino (BSA) (fracción V), 1 x insulina-transferrina-selenio y el reemplazo de suero 1% nocaut (KO) (no hielo-deshielo).
2. Filtro-esterilizar el medio entero con los suplementos a través de un sistema de filtro superior de la botella 0.4 μm.
3. Separar las líneas celulares de cáncer, que han ido creciendo según condiciones de cultivo de rutina recomendados, de los frascos tradicionales de cultivo de células lavándolas x 3 con fosfato 1 x tampón salino (PBS) y agregar una cantidad apropiada de tripsina 0.25% (1 mL por 5 cm²) durante 5 minutos crear una fina capa sobre las células. Neutralizar la tripsina con 5 veces la cantidad de medio que contiene el suero y proceder a contar las células. Por ejemplo, utilizar 25 mL de medio de 5 mL de tripsina.
4. Ajustar la concentración de la solución de células a 62,5 x 10⁴ células/mL para un total de 500 células por pocillo en 8 μl del medio del esferoide de la semilla en las placas de tejido-cultura-Tratado de 1536-bien.
5. En un gabinete de seguridad biológica, las células usando un cassette de punta de acero inoxidable esterilizado, pequeño con un sistema basado en la bomba peristáltica de la semilla. Entre diferentes líneas celulares, limpie el tubo del casete con 1 x PBS y el 70% de etanol durante 10 s.
6. Por otra parte, la semilla las células usando un controlador líquido situado dentro de un cuarto de HEPA-filtrado utilizando una cinta esterilizada, la pequeña punta de acero inoxidable y una bomba peristáltica o una bomba de jeringa adjunta, dependiendo del número de placas por línea celular es necesitada.
7. Sellar las placas usando un sello de placa adhesiva transpirable ya sea manualmente o usando un sellador de placas.
8. Coloque las placas en una incubadora de spinning de 10 rpm y 37 ° C con 5% dióxido de carbono (CO₂) y 95% de humedad relativa. Permita que los esferoides a forma d 3.

2. cultivo de 1536-bien 2D del cáncer

Nota: Las líneas de cáncer 2D 1536-bien se deben cultivar 24 h antes de la adición del compuesto a las placas 3D.

1. Preparar un medio de células de cáncer 2D mediante la adición de los reactivos siguientes a 500 mL de un medio de crecimiento apropiado para las líneas seleccionadas: 1 x penicilina/estreptomicina y 10% suero fetal bovino (FBS).
2. Filtro-esterilizar el medio entero con los suplementos a través de un sistema de filtro superior de la botella 0.4 μm.
3. Separar las líneas celulares de cáncer, que han ido creciendo según condiciones de cultivo de rutina recomendados, de los frascos tradicionales de cultivo de células lavándolas 3 x 1 x PBS y agregar una cantidad apropiada de tripsina 0.25% (1 mL por 5 cm²) por 5 min a crear una capa fina sobre las células. Neutralizar la tripsina con 5 veces la cantidad de medio que contiene el suero y proceder a contar las células. Por ejemplo, utilizar 25 mL de medio de 5 mL de tripsina.
4. Ajustar la concentración de la solución de células a 62,5 x 10⁴ células/mL para un total de 500 células por pocillo en 8 μl de medio completo de semillas en placas tratados con tejido y cultura 1536-bien.
5. En un gabinete de seguridad biológica, las células usando un cassette de punta de acero inoxidable esterilizado, pequeño con un sistema basado en la bomba peristáltica de la semilla. Entre las diferentes líneas celulares, limpie el tubo del casete con 1 x PBS estéril y el 70% de etanol durante 10 s.
6. Por otra parte, la semilla las células usando un controlador líquido situado dentro de una sala de robótica HEPA-filtrado usando un cassette de punta de acero inoxidable esterilizado, pequeño y una bomba peristáltica o la bomba de jeringa adjunta, según el volumen de las placas por celda línea necesitada.
7. Sellar las placas usando un sello de placa adhesiva transpirable ya sea manualmente o usando un sellador de placas.
8. Coloque las placas en una incubadora de spinning de 10 rpm y 37 ° C durante 24 h antes de la adición compuesta, con 5% CO₂ y 95% de humedad relativa.

3. adición de compuestos

1. Preparar diluciones de 8 puntos, 3-fold serie de inhibidores de la MAPK en 100% de dimetilsulfóxido (DMSO) en un robot de manipulación de líquidos con una concentración superior de 10 mM. El inhibidor de proteasoma Bortezomib se utiliza como control positivo de una celda completa matando para determinar el rango dinámico del ensayo.
2. Centrifugado rápido todo ensayo placas y placas compuestas a 100 x g para recoger la condensación. Retire el sello adhesivo de cada placa y coloque una placa en una configuración acústica dispensador para agregar un total de 8 nL de cada compuesto/dilución representando a una concentración final de 0.1% DMSO por pozo y una dosis superior compuesta de 10 μm.
3. Una vez finalizada la adición del compuesto, coloque una tapa de cultura de célula a medida, acero inoxidable que previene la evaporación de la placa y coloca la placa en una incubadora de spinning a 37 ° C durante 5 d, con 5% CO₂ y 95% de humedad relativa.

4. adición de reactivo detección y adquisición de datos

1. Precaliente un volumen adecuado de un reactivo de lisis de la célula que contiene luciferin para detectar cambios en trifosfato de adenina (ATP) y, por lo tanto, en la proliferación celular a temperatura ambiente o en baño de agua de 37 ° C. Añadir un total de 3 μl del reactivo de detección a cada pocillo utilizando una bomba peristáltica e incubar la placa a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos.
2. Captura de la luminiscencia en un luminómetro de placa.

5. procesamiento de datos

1. Extraer los datos en bruto del instrumento y normalizar todos los campos que contienen compuestos de prueba para la media de todos los pozos que contiene DMSO solamente como el control neutral. Calcular a partir de este valor, la inhibición del crecimiento porcentual de cada uno de ellos. Esto se ha completado utilizando la función fórmula en Microsoft Excel donde f (x) = {(muestra unidades de luz relativas de valor (RLUs) / (promedio de valor de DMSO RLUs) * 100)}.
2. Generar las curvas de dosis-respuesta y IC50s inhibitorio graficando los valores de los datos normalizados de medida 5.1 contra la concentración de compuesto utilizando un programa de graficación.
   Nota: Se analizaron los datos utilizando Helios, una herramienta de software interna de NIBR. Para completar esta función, seleccionamos la herramienta de análisis no paramétrico de la curva.

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Resultados

Una variedad de células de cáncer establecido líneas que crecen bien bajo condiciones de cultivo 2D se analizaron usando los métodos descritos aquí. Imágenes representativas de una variedad de cáncer mutante MAPK líneas celulares (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS y KNS-62:HRAS) se ven en la figura 1. Estas imágenes demuestran que aunque las líneas celulares tienen morfologías diferentes, cada uno formado estructuras 3D en las placas de e...

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Discusión

Los métodos presentados aquí demuestran un protocolo detallado en cómo producir esferoides tumorales en placas 1536 pocillos para proyecciones a gran escala de compuestos. Estos métodos fueron inicialmente adaptados del trabajo del Instituto Nacional del cáncer donde esferoides tumorales fueron cultivadas en los ensayos de rendimiento bajo en placas bien 6 y 96 pocillos para hacer preguntas sobre las dependencias genéticas y sensibilidad compuesto^{13, 14}

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12	ATCC	30-2006	Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors.
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12	Lonza	12-604F	Purchased as a prepared solution.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Lonza	12-115Q	Purchased as a prepared solution.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Seradigm	1500-500	Purchased as a prepared solution.
1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Hyclone	SH30042.01	Purchased as a prepared solution.
1x Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140	Purchased as a prepared solution.
10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF)	Sigma	F0291	Resuspend in sterile water.
20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma	E9644	Resuspend in sterile water.
0.4% Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418	Resuspend in sterile PBS and filter.
1x Insulin Transferrin Selenium (ITS)	Gibco	51500056
1% KnockOut (KO) Serum Replacement	Gibco	10828-028	Add fresh right before use.
100% Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	276855-100ML
CellTiter-Glo	Promega	G7573	Purchased as a prepared solution.
Consumables
Small Combi Cassette	ThermoFisher	24073295
Small Multiflow Cassette	BioTek	294085
1536-well sterile TC plates (white)	Corning	3727
1536-well sterile TC plates (black)	Corning	3893
Scivax Plates	MBL International	NCP-LH384-10
Equipment
Adhesives seals	ThermoFisher	AB0718
Spinning Incubator	LiCONiC
Stainless Steel Lids	The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)
ATS Acoustic Dispensor	EDS Biosystems
Echo Acoustic Dispensor	Labcyte
Luminometer	Envision-Perkin Elmer
Peristaltic Pump- Multidrop Combi	ThermoFisher
Liquid Handler-Multiflow FX	BioTek