מהדור בתפוקה גבוהה תלת מימדי הגידול Spheroids להקרנה סמים

Summary

במגוון רחב של מחלות אינדיקציות, דגמים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית מתנהג הסמים מפותחת, מיושמים לתוך גילוי תוכניות. המערכת החדשה דגם המתוארים כאן מדגים איך תלת מימדי הגידול יכול להיות תרבותי ולא הוקרן תפוקה גבוהה 1536-ובכן צלחת מערכת מבוססת לחיפוש תרופות חדשות אונקולוגיה spheroids.

Abstract

תאים סרטניים יש באופן שגרתי תרבותי בשני מימדים (2D) על משטח פלסטיק. טכניקה זו, עם זאת, חסרה את הסביבה נכון גידול בנפח גדול חשוף vivo בתוך. גידולים מוצקים גדלים לא כמו סדין המצורפת פלסטיק, אבל במקום כאוסף של תאים המשובטים תלת מימדי (3D) מרחב אינטראקציה עם שכניהם, ועם מאפיינים המרחבי ברורים כגון שיבוש קוטביות סלולרית רגילה. אינטראקציות אלה לגרום תלת-ממד תרבותי תאים לרכוש מאפיינים מורפולוגיים הסלולר רלבנטיות יותר ויוו גידולים. בנוסף, גידול בנפח גדול עומד בקשר ישיר עם סוגי תאים אחרים כגון תאי סטרומה ואת המערכת החיסונית, כמו גם של מטריצה חוץ-תאית של כל סוגי תאים אחרים. המטריקס שהופקדו מורכבת של מקרומולקולות כגון קולגן fibronectin.

בניסיון להגביר את התרגום של ממצאי המחקר באונקולוגיה מן הספסל אל מיטתה, קבוצות רבות החלו לחקור את השימוש במערכות דגם התלת-ממד באסטרטגיות הפיתוח שלהם סמים. מערכות אלו נחשבים רלבנטי יותר מבחינה פיזיולוגית, כי הם מנסים לסכם את הסביבה הטרוגנית ומורכבת של הגידול. מערכות אלו, עם זאת, יכול להיות מורכב למדי,, למרות נוטה צמיחה בשנת 96-ובכן תבניות, וחלק עכשיו אפילו ב- 384, והם מציעים מספר אפשרויות הצמיחה בקנה מידה גדול, הקרנה. זה נצפתה הפער הוביל להתפתחות של השיטות המתוארות כאן בפירוט כדי תרבות גידול spheroids בתפקיד תפוקה גבוהה ב- 1536-ובכן צלחות. שיטות אלה מייצגים פשרה למערכות מורכבות מאוד מבוסס-מטריקס, אשר קשה מסך וקונבנציונאלי מבחני 2D. מגוון רחב של שורות תאים סרטן מחסה מוטציות גנטיות שונות מוקרנים בהצלחה, בחינת היעילות מורכבים באמצעות ספריית אצר של תרכובות מיקוד מסלול Mitogen-Activated קינאז או MAPK. התגובות תרבות ספרואיד משווים לאחר מכן על התגובה של התאים גדלו ב 2D, פעילויות דיפרנציאלית מדווחים. שיטות אלה מספקים פרוטוקול ייחודי לבדיקת פעילות מורכבת בסביבה תלת-ממד תפוקה גבוהה.

Introduction

בעשור האחרון, יותר ויותר מחקרים יש ליישם את השימוש תא תלת-ממד מודלים תרבות כדי להבין את המושגים לא recapitulated באופן מלא על ידי גידול התאים ב- 2D על הפלסטיק. דוגמאות של מושגים אלה כוללים מסעה קוטביות תאים אפיתל רגיל¹ שבו יאבדו הכיוון המרחבי של הפסגה, הבסיס שכבות של תאים, כמו גם את התפקיד של מטריצות בוויסות הישרדות, גורל. המחקר האונקולוגי, בפרט, השתמשה דגמי תלת-ממד כדי להבין את הביולוגיה בסיסי של תאים סרטניים, ההבדלים בין 2D and 3D תא תרבות מערכות^3,4. הפיתוח של טכניקות מתוחכמות יותר של תרבות תא ושל שלהם התאקלמות נוספת לתבניות רב טוב אפשרה את החיפוש אחר תרופות חדשות הגדרות תלת-ממד. בניגוד לתאים לגדול בתנאים 2D, 3D מודלים של גידולים בטווח המורכבות של מערכות סלולריות בשכבות⁵ באופן חד-תא-type כדורים בגדלים שונים, הספירות מולטי-cell-סוג מורכב^{6,7, 8}. הגילוי של תרכובות הרומן או תכשירים זה מנע בעוצמה לגרום מוות תאי במערכות אלו דגם התלת-ממד היא, אפוא, עניין גבוהה סמים פיתוח קמפיינים. נקודות הקצה של מבחני אלה הם לעתים קרובות זהים לאלו שבוצעו בתרבויות 2D להעריך שינויים התפשטות תאים, אבל כאשר התנהלה באווירה רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית, לחפור רמת התלות של ג'ין היעד או מסלול להיות אמיתי חקרו.

כפי שהובאו לעיל, מגוון רחב של מערכות מודל פותחו כדי ללמוד תגובות סמים במערכות תרבות תלת-ממד, אך הרוב להשתמש גם צלחות microtiter 96 או 384-ובכן, אינם בקלות לצורכי תפוקה גבוהה ההקרנה (HTS) התבניות המשמשות לעתים קרובות ב קמפיינים ההקרנה של גילוי סמים. מערכות אלה כוללות שימוש תלוי droplet טכנולוגיות, ספרואיד תרבויות, רוטט תאים עם חלקיקים מגנטיים לזירוז ריחוף, תרביות ג'ל טבעי או סינתטי כגון קולגן, Matrigel או פוליאתילן גליקול (PEG)² . כאן, אנו מציגים את השיטות מפורט של טכניקה מפותחת בעבר כדי לייצר של שורות תאים סרטן הוקמה בתבנית 1536-ובכן צלחת תרבויות ספרואיד תלת-ממד. ב פרוטוקול זה, מדיום מאוד מוגדרים משמש אשר מונע את הקובץ המצורף של שורות תאים בדרך כלל חסיד⁹. מערכת זו יש מגבלות (כלומר, זה לא מסכם את הדברים באופן מלא מערכת מודל מורכב של סרטן), אבל בכל זאת, מבחני אלה לאפשר הקרנה תפוקה גבוהה של אוספים גדולים של מולקולות קטנות והשוואות חריץ בצורת הצלב של סמים תגובה בין תרבויות 2D and 3D נגד מגוון רחב של שורות תאים וחיבורים.

הקווים התא שנבחר כדי להדגים השיטות במאמר זה כל הנמל מוטציות בגנים הקשורים את MAPK איתות, שביל אשר הוא מאוד dysregulated ב סרטן, עבור הרפוי רבים אשר הינם זמינים. רבים מן הקווים יש הפעלת מוטציות oncogenic הווירוס קירסטן עכברוש סרקומה המכונה גם קראס, RAS נוירובלסטומה או NRAS, אונקוגן וירוס את הארווי עכברוש סרקומה או HRAS ו של kinases המשויך במהירות מואצת Fibrosarcomas, הידוע גם בשם RAFs. הספרות האחרונות עולה כי מעכבי של צמתים שונים של מסלול זה הן באופן ייחודי יותר אפקטיבי בקבוצת משנה של הקווים התא כאשר גדל תחת תנאים 3D^9,10. מחקר אחד מצא כי כאשר תאים סרטניים עם ראס הפעיל היו תרבותי ב- 3D, הם הפגינו רגישות מוגברת של מעכבי MAPK, יתר על כן, כי גישה זו יכולה לזהות מסלולים, ממוקד מעכבי עלול לפספס ב דו-ממדי מסורתי הגדרה. מטרת מחקר זה היא להציג את שיטות השתמשו כדי תרבות שורות תאים אלה, עוד יותר, כדי להדגים את האבחנות השונות התגובות האלה מעכבי אשר יכול להיות שנצפו רק בעת שימוש 3D תא מערכות התרבות.

Protocol

1. culturing של הגידול 1536-ובכן 3D Spheroids

1. להכין טרי הגידול 3D ספרואיד בינוני גבעול (תא בינוני + החלפת סרום נוקאאוט אינסולין-transferrin-סלניום) על-ידי הוספת ריאגנטים הבאים של עד 500 מ"ל של מדיום נשרים שונה של Dulbecco (DMEM/F12): פניצילין x 1/סטרפטומיצין, 10 ננוגרם למ"ל של בן אנוש בסיסי פיברובלסט גורם גידול (bFGF), 20 ng/mL של האדם גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), 0.4% אלבומין שור (BSA) (V שבר), 1 x אינסולין-transferrin-סלניום, והחלפת נוקאאוט 1% (KO) סרום (לא להקפיא-הפשרה).
2. מסנן-לעקר המדיום כולו תוספי דרך מערכת סינון בקבוק-העליון 0.4 מיקרומטר.
3. ניתוק הקווים התא סרטן, אשר יש גדלים בהתאם לתנאים מומלצים תרבות שגרתית, מן המבחנות תא-תרבות מסורתית בשטיפה 3 x עם פוספט 1 x buffered כמות מספקת של 0.25% טריפסין (1 מ"ל תמיסת מלח (PBS) והוספת לכל 5 ס מ²) עבור 5 דקות כדי ליצור שכבה דקה על פני התאים. לנטרל את טריפסין עם 5 x כמות המדיום המכיל את הנסיוב והמשך לספור את התאים. לדוגמה, השתמש 25 מיליליטר בינוני 5 מ של טריפסין.
4. התאם את הריכוז של הפתרון תא 62.5 x 10⁴ תאים למ"ל על מנת זרע סך של 500 תאים לכל באר µL 8 ספרואיד בינוני לתוך הלוחות רקמות-תרבות-מטופלים 1536-. טוב.
5. ב- cabinet בטיחות ביולוגית, זרע את התאים באמצעות קלטת מעוקרות, קטן נירוסטה-ראש-פלדה עם מערכת סינון מבוססת על המשאבה. בין שורות תאים שונים, ריקון הצנרת של הקלטת עם 1-PBS ו- 70% אתנול 10 s.
6. לחלופין, זרע את התאים באמצעות נוזלי עוזר ממוקם בתוך חדר HEPA-מסוננים באמצעות קלטת מעוקרות, קטן נירוסטה-ראש-פלדה, משאבה סחרור או משאבת מזרק מצורף, בהתאם למספר הצלחות בכל שורה התא זקוק.
7. חותם את הצלחות באמצעות גושפנקה לנשימה צלחת דבק גם באופן ידני או באמצעות סילר לאיטום של צלחת.
8. מקם את הצלחות חממה ספינינג שוכן בגובה 10 סל ד ו- 37 ° C עם 5% פחמן דו-חמצני (CO₂) ו- 95% לחות יחסית. אפשר את spheroids טופס בתלת-ממד.

2. culturing קווי סרטן 2D 1536-ובכן

הערה: הקווים סרטן 2D 1536-טוב צריך להיות מחונן 24 שעות לפני התוספת של המתחם אל צלחות תלת-ממד

1. להכין מדיום התא סרטן 2D על-ידי הוספת ריאגנטים הבאים של 500 מ ל מדיום הגידול המתאים עבור השורות שנבחרו: 1 x פניצילין/סטרפטומיצין ו-10% עוברית שור סרום (FBS).
2. מסנן-לעקר המדיום כולו תוספי דרך מערכת סינון בקבוק-העליון 0.4 מיקרומטר.
3. ניתוק הקווים התא סרטן, אשר יש גדלים בהתאם לתנאים מומלצים תרבות שגרתית, מן המבחנות תא-תרבות מסורתית בשטיפה 3 x 1 x PBS, הוספת כמות מספקת של 0.25% טריפסין (1 מ"ל לכל 5 ס מ²) במשך כשלוש דקות ליצור שכבה דקה על פני התאים. לנטרל את טריפסין עם 5 x כמות המדיום המכיל את הנסיוב והמשך לספור את התאים. לדוגמה, השתמש 25 מיליליטר בינוני 5 מ של טריפסין.
4. התאם את הריכוז של הפתרון תא 62.5 x 10⁴ תאים למ"ל על מנת זרע סך של 500 תאים לכל באר µL 8 בינוני מלא לוחות רקמות-תרבות-מטופלים 1536-. טוב.
5. ב- cabinet בטיחות ביולוגית, זרע את התאים באמצעות קלטת מעוקרות, קטן נירוסטה-ראש-פלדה עם מערכת סינון מבוססת על המשאבה. בין השורות תאים שונים, ריקון הצנרת של הקלטת עם 1-PBS סטרילי ו 70% אתנול 10 s.
6. לחלופין, זרע את התאים באמצעות נוזלי עוזר ממוקם בתוך חדר רובוטיקה HEPA-מסוננים באמצעות קלטת מעוקרות, קטן נירוסטה-ראש-פלדה, משאבה סחרור או את משאבת מזרק מצורף, בהתאם לנפח של הצלחות בכל תא קו הדרושים.
7. חותם את הצלחות באמצעות גושפנקה לנשימה צלחת דבק גם באופן ידני או באמצעות סילר לאיטום של צלחת.
8. מקם את הצלחות חממה ספינינג שוכן בגובה 10 סל ד ו- 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעןת לפני התוספת מורכבים, עם 5% CO₂ ו- 95% לחות יחסית.

3. בנוסף במתחם

1. להכין דילולים מתומן, מקופלים ל- 3 סידורי של מעכבי MAPK ב- 100% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) על רובוט נוזלי-טיפול עם ריכוז העליון 10 מ מ. הפרוטאזום Bortezomib משמש פקד חיובי עבור תא מלאה הורג כדי לקבוע את הטווח הדינמי של וזמינותו.
2. הכל מהיר-ספין assay צלחות וצלחות מתחם ב g x 100 כדי לאסוף את כל עיבוי. להסיר את החותם דבק כל צלחת ומניחים צלחת על הגדרת מנפק אקוסטי כדי להוסיף סך של 8 nL של כל המתחם/דילול המייצגים ריכוז סופי של דימתיל סולפוקסיד 0.1% לכל טוב מנה מורכבת העליון של 10 מיקרומטר.
3. לאחר השלמת התוספת של המתחם, במקום מכסה תרבות בהזמנה אישית, פלדת תא אשר מונע התאדות בצלחת ומניחים את הצלחת לתוך חממה ספינינג ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 ימים, עם 5% CO₂ ו- 95% לחות יחסית.

4. זיהוי ריאגנט תוספת ו את הקניית נתונים גולמיים

1. לחמם אמצעי אחסון נאותים של ריאגנט פירוק התא המכיל luciferin כדי לזהות שינויים אדנין טריפוספט (ATP) ושינויים, לפיכך, את התפשטות תאים בטמפרטורת החדר או באמבט מים 37 º C. להוסיף סך של µL 3 מהתרכובת זיהוי מכל קידוח באמצעות משאבה סחרור, דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפחות.
2. ללכוד את הארה על luminometer צלחת.

5. עיבוד נתונים

1. לחלץ את הנתונים הגולמיים של המכשיר, לנרמל את כל השדות המכילים תרכובות מבחן לממוצע של כל בארות המכיל דימתיל סולפוקסיד לבד של הפקד נייטרלי. משווי זה לחשב את שיעור הצמיחה עיכוב של כל המתחם. זה הושלמה באמצעות הפונקציה נוסחה ב- Microsoft Excel שבה f (x) = {(לדגום ערך יחידות קלות יחסית (RLUs) / (ממוצע דימתיל סולפוקסיד ערך RLUs) * 100)}.
2. ליצור עקומות מנה-תגובה של IC50s מעכבות על-ידי יצירת גרפים את הערכים של נתונים מנורמל מ שלב 5.1 נגד הריכוז מורכבים באמצעות תוכנית graphing.
   הערה: ניתחנו את הנתונים באמצעות הליוס, כלי תוכנה NIBR פנימי. כדי להשלים פעולה זו, בחרנו בכלי ניתוח עקומת nonparametric.

תוצאות

מגוון של תא סרטני הוקמה קווים ידועה לגדול גם בתנאים תרבות 2D נבדקו באמצעות השיטות המתוארות כאן. להחליפן בתמונות מתוך מגוון של סרטן מוטציה MAPK תא קווים (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-מל-30:NRAS ולאחר KNS-62:HRAS) ניתן לראות באיור1. תמונות אלה מדגימים כי למרות הקווים תא מורפולוגיו?...

Discussion

השיטות המובאות כאן מדגימים פרוטוקול מפורט על איך לייצר spheroids הגידול ב- 1536-ובכן לוחות עבור הקרנות מתחם בקנה מידה גדול. שיטות אלה היו בתחילה ממאמרו של עבודה במכון הסרטן הלאומי שבו הגידול spheroids גדלו במבחני בתפוקה נמוכה ב- 6-ובכן, 96-ובכן צלחות לשאול שאלות אודות יחסי תלות גנטית וגם רגישות מתחם

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12	ATCC	30-2006	Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors.
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12	Lonza	12-604F	Purchased as a prepared solution.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Lonza	12-115Q	Purchased as a prepared solution.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Seradigm	1500-500	Purchased as a prepared solution.
1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Hyclone	SH30042.01	Purchased as a prepared solution.
1x Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140	Purchased as a prepared solution.
10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF)	Sigma	F0291	Resuspend in sterile water.
20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma	E9644	Resuspend in sterile water.
0.4% Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418	Resuspend in sterile PBS and filter.
1x Insulin Transferrin Selenium (ITS)	Gibco	51500056
1% KnockOut (KO) Serum Replacement	Gibco	10828-028	Add fresh right before use.
100% Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	276855-100ML
CellTiter-Glo	Promega	G7573	Purchased as a prepared solution.
Consumables
Small Combi Cassette	ThermoFisher	24073295
Small Multiflow Cassette	BioTek	294085
1536-well sterile TC plates (white)	Corning	3727
1536-well sterile TC plates (black)	Corning	3893
Scivax Plates	MBL International	NCP-LH384-10
Equipment
Adhesives seals	ThermoFisher	AB0718
Spinning Incubator	LiCONiC
Stainless Steel Lids	The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)
ATS Acoustic Dispensor	EDS Biosystems
Echo Acoustic Dispensor	Labcyte
Luminometer	Envision-Perkin Elmer
Peristaltic Pump- Multidrop Combi	ThermoFisher
Liquid Handler-Multiflow FX	BioTek