استهداف الجين الطفرات العشوائية لتحديد طفرات بروتوزوم هيتيروتشروماتين-زعزعة الاستقرار في انشطار الخميرة

Summary

توضح هذه المقالة منهجية مفصلة للطفرات العشوائية الجينات الهدف في الأنشطار الخميرة. على سبيل مثال، نحن نستهدف rpt4 +، الذي يشفر وحدة فرعية بروتوزوم 19S، وشاشة للطفرات التي تزعزع استقرار هيتيروتشروماتين.

Abstract

عشوائية الطفرات الجينات المستهدفة يستخدم عادة لتحديد الطفرات التي تسفر عن النمط الظاهري المطلوب. من الأساليب التي يمكن استخدامها لتحقيق الطفرات العشوائية، بكر عرضه للخطأ وضع استراتيجية ملائمة وفعالة لتوليد مجموعة متنوعة من طفرات (أي.، مكتبة متحولة). بكر عرضه للخطأ هو الأسلوب المفضل عندما يسعى باحث إلى التحور منطقة محددة مسبقاً، مثل منطقة ترميز الجينات بينما يترك مناطق الجينوم أخرى لم تتأثر. بعد أن يتم تضخيمه المكتبة متحولة ببكر عرضه للخطأ، يجب المستنسخة إلى بلازميد مناسبة. حجم المكتبة التي تم إنشاؤها بواسطة PCR عرضه للخطأ مقيد بكفاءة الخطوة الاستنساخ. ومع ذلك، في انشطار الخميرة، شيزوساكتشاروميسيس بومبي، يمكن استبدال الخطوة الاستنساخ باستخدام الانصهار خطوة واحدة ذات كفاءة عالية PCR لإنشاء بنيات للتحول. ثم يمكن تحديد طفرات تعمل المطلوب استخدام الصحفيين المناسبة. هنا، نحن وصف هذه الاستراتيجية بالتفصيل، آخذا على سبيل مثال، مراسل إدراجها في هيتيروتشروماتين سينتروميريك.

Introduction

علم الوراثة إلى الأمام هو أسلوب كلاسيكية التي تسعى طفرات تحدث بشكل طبيعي النمط الظاهري خاصة عرض الباحثين، وإجراء التحليلات الجينية. في علم الوراثة، وعكس تدخل الطفرات في جينات للفائدة وبحثها في النمط الظاهري. في هذه الحالة الأخيرة، غالباً ما يستخدم عشوائية الطفرات الجينات المستهدفة لتوليد مجموعة المسوخ التي تم تحديدها فيما بعد لتعمل المطلوب، مثل حساسية درجة الحرارة أو تغيير النشاط الأنزيمي. يمكن استخدام أساليب مختلفة لتحقيق الطفرات العشوائية، بما في ذلك عرضه للخطأ PCR¹؛ إشعاع الأشعة فوق البنفسجية²؛ والمطفرات الكيميائية، مثل إيثيل ميثانيسولفوناتي (EMS) أو حمض النيتروز³؛ استخدام سلالات mutator مؤقتة، مثل تلك الإفراط معربا عن mutD5 ⁴؛ والدنا⁵.

وهنا يصف لنا استراتيجية عكس-علم الوراثة التي نستخدم PCR عرضه للخطأ لإنشاء تجمعات متحولة لجينات مستهدفة في انشطار الخميرة. كما قد تخمين واحد من اسمها، ينشئ هذا الأسلوب الطفرات عن طريق إدخال أخطاء عمدا خلال PCR. خلافا لسائر الأساليب الطفرات، بكر عرضه للخطأ يسمح للمستخدم بتحديد المنطقة لتكون موتاجينيزيد. هذا يجعلها مفيدة بشكل خاص في الجهود الرامية إلى دراسة وظيفة البروتين/مجال الاهتمام.

وللتدليل على هذا الإجراء الطفرات العشوائية، هنا نستخدم rpt4 +، والذي يقوم بترميز فرعية بروتوزوم 19S، على سبيل مثال. Rpt4 قد ثبت أن لها وظائف مستقلة بروتيوليسيس في الكائنات الحية خلاف انشطار الخميرة^6،7،،من⁸⁹، ويمكن أن يسبب وجود عيب في بروتيوليسيس الآثار غير المباشرة بتغيير البروتينات المستويات. أننا، لذلك، فحص لطفرات التي أدت إلى التغييرات proteolysis المستقلة، بهدف التحقيق في وظيفة بروتوزوم في هيتيروتشروماتين.

يمكن تطبيقها على أي منطقة الجين PCR عرضه للخطأ بضبط المكان الذي ربط الإشعال. ويمكن تحديد طفرات تحدث التغيير المنشود المظهرية مع الصحفيين المناسبة. هنا، يمكننا الاستفادة من مراسل ade6 + إدراج كرر 1 الخارجي في السنترومير منطقة (otr)¹⁰. ويتكون heterochromatin التأسيسي في هذه المنطقة¹¹، حتى يتم إسكات المراسل ade6 + في حالة البرية من نوع؛ يتم الإشارة إلى هذه المستعمرات الأحمر¹⁰. طفرة يزعزع heterochromatin التأسيسي في السنترومير سيؤدي إلى التعبير عن ade6 + المراسل، الذي هو تصور كمستعمرات بيضاء.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام

1. يعد "استخراج الخميرة" مع ملاحق (نعم)، نعم دون الأدنين (نعم منخفضة Ade)، غلوتامات بومبي المتوسطة (فريق رصد السلام¹²)، وفريق رصد السلام دون الأدنين (فريق رصد السلام-أدى) بخلط المكونات كما هو موضح في الجدول 1. نعم-Ade (Ade منخفضة) ولوحات Ade فريق رصد السلام جميعا من نفس المكونات ولكن محذوفاً الأدنين من هذا الأخير.
   1. استخدم الأسهم الملح (50 س) التالية: 2 غرام/لتر Na₂حتى₄ في الماء المقطر، 50 غرام/لتر بوكل 52.5 غرام/لتر مجكل₂·6H₂س، 2 غرام/لتر كاكل₂·2H₂س. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية حجم مسام 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية.
   2. استخدام فيتامين التالية (1، 000 x) الأوراق المالية: بانتوثينات 1 غرام/لتر، 10 غرام/لتر حمض النيكوتينيك، اينوزيتول 10 غرام/لتر، البيوتين 10 مغ/لتر في الماء المقطر. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية حجم مسام 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية.
   3. استخدام المعادن التالية (10، 000 x) الأوراق المالية: 5 غرام/لتر الماء المقطر، 4 غرام/لتر منسو₄, 4 غرام/لتر زنسو₄·7H₂س، 2 غرام/لتر فيكل₂·4H₂س، 0.4 غرام/لتر مو₃، 1 غرام/لتر كي، 0.4 غرام/لتر CuSO₄·5H₂س ، حامض الستريك 10 غرام/لتر في الماء المقطر. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية حجم مسام 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن إجراء المتوسطة نعم السائل بإهمال في أجار.
2. اﻷوتوكﻻف المتوسطة وباردة إلى أدناه 60 درجة مئوية بينما التحريك مع شريط ضجة، بمعدل 200 لفة في الدقيقة.
3. لوحات نعم + G418 (جينيتيسين)، إضافة 1 مل/لتر G418 حل الأسهم المتوسطة نعم.
   1. استخدام G418 التالية (1، 000 x) الأوراق المالية: 100 مغ/مل G418 في الماء المقطر. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية حجم مسام 0.22 ميكرومتر، الكوة إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي، ومخزن في-20 درجة مئوية.
4. يقلب لآخر دقيقة 5-10 وقاسمه وسائط الإعلام في أطباق بتري 90 ملم (1 لتر مختبرين المتوسط إلى ما يقرب من 40 بيتري الأطباق. تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية.

2-استنساخ rpt4 + ولها 5/3 ' تحيلها

1. إجراء PCR مع الإشعال p1 و p2 (الشكل 1A) استخدام الأنشطار خميرة الحمض النووي (جدنا) كالقالب في إجمالي حجم 50 ميليلتر (~ 1 ميكروغرام الحمض النووي، إنزيم يو 20، 1 x رد فعل المخزن المؤقت)، وتطبيق دورات الرد المبين في الجدول 2 إلى تضخيم قاعدة 3,315 تتألف من rpt4 + ولها 5/3 ' تحيلها يفتت زوج (bp). تنقية المنتج PCR باستخدام أدوات تنقية¹³ حسب توجيهات الشركة المصنعة (الشكل 1A).
2. هضم متجه KS(-) ببلويسكريبت¹⁴ والجزء تضخيم الحمض النووي الذي يحتوي على rpt4 + مع به 5/3 ' تحيلها مع BamH1 و Xho1 في إجمالي حجم 20 ميليلتر (~ 1 ميكروغرام الحمض النووي، إنزيم يو 20، 1 x الهضم العازلة) عند 37 درجة مئوية في حمام مائي ل 16-18 (ح) (الشكل 1B).
3. هلام تطهير ناقلات هضمها (1.2% [اغروس] هلام) وإدراج الحمض النووي بأداء على أساس تاي [اغروس] هلام التفريد (100 V، ح 1) ونسق عصابات الحمض النووي بالأحجام المطلوبة، وعزل الحمض النووي مع مجموعة أدوات استخراج جل¹⁵.
4. اضطر إدراج الحمض النووي باستخدام الحمض النووي T4 ليجاسى بأداء فعل ربط 20 ميليلتر يحتوي على 50-100 نانوغرام من ناقلات الحمض النووي، والمتجهة ~ فائض المولى 3-fold في الحمض النووي إدراج و 400 "ش T4 الحمض النووي" ليجاسى 1 × ربط المخزن المؤقت. احتضان هذا الخليط عند 18 درجة مئوية ح 16-18.
5. تحويل الحمض النووي الواصلة إلى 100 ميليلتر من DH5α كولاي عن طريق تطبيق الصدمة الحرارة 70 s في 42 درجة مئوية. أضف 1 مل رطل واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية للانتعاش. إجراء الطرد المركزي (13,800 س ز)، وتجاهل لوحة طافية، كل من تحول كولاي الخلايا على ألواح الأمبيسلّين رطل (لوس أنجليس)، واحتضان في 37 درجة مئوية ح 16.
6. اختيار المستعمرات 4-8 مع المسواك وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في المتوسط 3 مل لوس أنجليس.
7. عزل البلازميدات مع مجموعة أدوات تنقية بلازميد¹⁶ المستخدمة وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، وأداء ديجيسشنز إنزيم التقييد التحليلية مع 5 ميليلتر من بلازميد معزولة، 5 ش كل إنزيم التقييد (BamH1 و Xho1) و 1 × تقييد المخزن المؤقت. احتضان الخليط رد فعل على 37 درجة مئوية في حمام مائي حاء 3 تأكيد استنساخ حسب تسلسلها والبلازميدات المرشح.

3-الأخذ بالطفرة الصامتة (موقع تقييدXho1 )

1. تصميم زوج من الإشعال 33-بي بي (p3 و p4) التي تحتوي على الطفرة المنشودة في تسلسل وإلا مكملة.
2. إجراء PCR مع عالية الدقة بوليميريز¹⁷ (الشكل 1) في إجمالي حجم 25 ميليلتر (10 نانوغرام بلازميد المستنسخة، 2 ميليلتر 10 pmol التمهيدي مزيج، إنزيم يو 2، 1 x رد فعل المخزن المؤقت) استخدام الدراجات المعلمات المسرودة في الجدول 3.
3. هضم بلازميد القالب مع Dpnفي إجمالي حجم 20 ميليلتر (20 إنزيم يو، س 1 الهضم العازلة) عند 37 درجة مئوية في مياه حمام لح 1.
4. تحويل ونشر، وعزل، وتسلسل بلازميد يحتوي على الطفرة الصامتة، كما هو موضح في الخطوات 2.5 2.7.
   ملاحظة: يمكن أيضا إدخال الطفرة الصامت باستخدام أسلوب استنساخ الذي يسمح بضم عدة شظايا من الحمض النووي في رد واحد¹⁸.

4-عشوائية الطفرات rpt4 + ببكر عرضه للخطأ

1. إجراء PCR عرضه للخطأ، باستخدام بلازميد مع الطفرة الصامتة (موقعXho1 ) كالقالب، p5 الإشعال و p6، إجمالي حجم 50 ميليلتر (مقدار القالب المحدد في الخطوة 4.1.1، 2 ميليلتر ميكس التمهيدي pmol 10، 2.5 يو الإنزيم، 1 x رد فعل المخزن) ، وبوليميريز خاصة التي تم تصميمها لإنشاء خطأ عالية معدل¹⁹ (الشكل 1). تنفيذ بكر كما هو موضح في الجدول 2.
   1. استخدام 4-5 ميكروغرام من بلازميد القالب للتحكم في وتيرة الطفرة إلى بي بي 1/كيلوبايت (كيلوبس).
      ملاحظة: تركيزات عالية (> 500 نانوغرام/ميليلتر) من بلازميد، التي يمكن الحصول عليها باستخدام طقم الإعدادية المصغر²⁰، مطلوب.
2. استخدم جل التفريد لتأكيد منتج PCR من 2670 bp (1.2% [اغروس] هلام). هلام تنقية هذا المنتج بكر كما هو موضح في الخطوة 2، 5.

5-إعداد الانصهار PCR شظايا (أساسه، 3 ' UTR)

1. إجراء PCR باستخدام pFA6a-KANMX6²¹ كقالب، p7 الإشعال و p8، والشروط المدرجة في الجدول 4 للحصول على الجزء ماركر (كان). هلام تطهير الجزء 1,480-بي بي الناتجة كما هو موضح في الخطوة 2، 5 (الشكل 1E).
   1. تحقق إذا كان كودون التوقف من الجينات المستهدفة لمنطقة ترميز الجينات المتاخمة لها والطفرات مفصولة بأكثر من 500 شركة بريتيش بتروليوم. لا يجوز استخدام فاصل الذاتية عند هذه المنطقة هو أقل من 500 bp؛ بدلاً من ذلك، يجب استخدام فاصل ADH بدلاً من فاصل الذاتية. وترد في الجدول 5البروتوكول التغييرات المطلوبة لاستخدام فاصل ADH .
      ملاحظة: هذه التغييرات تنطبق فقط عندما يتم استخدام فاصل ADH ، ومتاح في بلازميد pFA6a-3HA-KANMX6، بدلاً من فاصل الذاتية.
2. أداء بكر مع استنساخ rpt4 +--التي تحتوي على ناقل p9 القالب والإشعال و p10 في إجمالي حجم 50 ميليلتر (20 نغ بلازميد المستنسخة، 2 ميليلتر 10 pmol التمهيدي مزيج، إنزيم يو 2، 1 x رد فعل المخزن المؤقت)، استخدام الشروط الواردة في الجدول 6. هلام تنقية UTR الجزء المتحصل عليها 506-بي بي 3 ' (الشكل 1E).

6-جيل بناء التحول من الانصهار بكر (الشكل 1E)

1. إعداد الأجزاء 3 (موتاجينيزيد rpt4 +واساسه و 3 ' UTR) في 50 نانوغرام/ميليلتر.
2. أداء الانصهار PCR الثلاث شظايا استخدام كبسولة تفجير p11 p12، كما هو موضح في الجدول 7. (بروتوكول للانصهار PCR إدخال تعديل على البروتوكول الأصلي²²). تنقية المنتج بكر 4,398-بي بي الرئيسية.
   1. استخدام rpt4 +: KAN:3 ' UTR شظايا بنسبة 1:3:1 لتحقيق أفضل النتائج.
      ملاحظة: ينبغي إلا يتجاوز المبلغ الإجمالي من الحمض النووي إدراج 500 نانوغرام. الكمية الموصى بها من rpt4 +: KAN:3 ' UTR 50 نانوغرام ng:50 ng:150. منطقة موتاجينيزيد حوالي 1.6 كيلوبايت، ذلك هو الحد الأدنى لعدد من المستعمرات الخميرة التي ستمثل كافة التركيبات الممكنة لكل قاعدة يجري تحور إلى الثلاثة الآخرين 1,600 x 3 = 4,800 المستعمرات. لأن عادة غلة رد فعل التحول واحد 400-500 المستعمرات، مطلوب على الأقل 10 ردود الفعل يستحق الانصهار بكر بناء. ويمكن تلبية هذه الحاجة ببساطة زيادة مقدار رد الفعل (أي عدد أنابيب PCR) بمعامل قدرة عشرة.

7-تحول خميرة الأنشطار قبل انهانسر (الشكل 1F)

1. تطعيم الخميرة إلى 10 مل متوسطة نعم للتشبع بحضانة أنه لأكثر من 16 ح.
2. تمييع الخلايا كثافة بصرية في 600 نانومتر (OD₆₀₀) 0.2 في 200 مل من نعم المتوسطة واحتضان عند 30 درجة مئوية مع الهز ح 5-6، إلى OD₆₀₀ = 0.6-0.8.
3. تركز الخلايا إلى OD₆₀₀ = 30، الاستغناء عن إلى أربعة أنابيب مخروطية 50 مل والبرد على الجليد لمدة 10 دقائق.
4. حصاد الخلايا عن طريق إجراء الطرد المركزي في 1,050 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. وضع الأنابيب والكهربائية 10-الترعة على الجليد. نفذ الخطوات 7.3 7.8 على الجليد.
5. تجاهل المادة طافية وإضافة 15 مل السوربيتول 1.2 متر. بلطف يهز الأنابيب ريسوسبيند الخلايا.
6. الطرد المركزي الخلايا في ز x 1050 لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
7. كرر الخطوات من 7، 4 و 7-5. تجاهل المادة طافية. إضافة 500 ميليلتر من السوربيتول 1.2 متر لكل أنبوبة، ريسوسبيند الخلايا، وجمع كافة الخلايا في أحد أنابيب مخروطية الشكل 15 مل.
8. إضافة السوربيتول 1.2 متر يصل إلى 2.4 مل (OD₆₀₀ = 10 كل 0.2 مل). الاحتفاظ بالانبوب على الجليد.
9. إضافة 200 ميليلتر الخلايا علقت السوربيتول (تأكد من أنها علقت تماما) لأنبوب الجيش الشعبي التي تحتوي على الانصهار PCR بناء ومزيج جيد ونقل العينة إلى الكهربائية-ومبومو.
10. اليكتروبوراتي الخلايا مع الخيارات التالية: الفطريات، وشبكات الطاقة الشمسية المنزلية (2.00kV، نبض 1).
11. إضافة 600 ميليلتر من السوربيتول 1.2 متر لكل الكهربائية ومبومو لإجمالي حجم 800 ميليلتر ومن ثم انتشار الخلايا على أربع لوحات نعم (200 ميليلتر في اللوحة). سوف تستغني عشرة الكهربائية-الترعة إلى 40 نعم لوحات.
12. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية ح 24.
13. قم بالطلاء النسخ المتماثلة إلى نعم + G418 واحتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام.

8-اختيار طفرات Heterochromatin-المزعزعة للاستقرار، والتحقق من وجود إيجابيات كاذبة

1. لكل لوحة نعم + G418، نفذ الطلاء النسخ المتماثلة إلى نعم-Ade (Ade منخفضة) ولوحات فريق رصد السلام-Ade (لا أدى). احتضان لوحات متماثلة لعدة أيام 1-2 في 30 درجة مئوية، حتى تظهر بعض المستعمرات على لوحات Ade نعم تلوين أحمر (الشكل 1).
2. مقارنة لوحات Ade نعم وفريق رصد السلام-أدى وحدد الخلايا التي تظهر الوردي أو الأبيض على لوحة Ade نعم وتنمو أيضا في لوحة فريق رصد السلام Ade. لا تقم بتحديد المستعمرات دون نمو في فريق رصد السلام-أدى، كما أنها نتائج إيجابية خاطئة (مثلاً، مما يعكس أن الكاسيت كان قد أدمج في موقع غير المستهدفة في أماكن أخرى في الجينوم).
3. اختيار حوالي 1 × 10⁵ خلايا من كل مستعمرة واحتضان في 10 ميليلتر من محلول سبز يحتوي على 2.5 ملغ/مل زيمولياسي 100 طن في 37 درجة مئوية على الأقل 30 دقيقة ميليلتر 1 استخدام هذا الحل لأداء كقالب البداية مستعمرة [بكر] (الشكل 1 ح).
   1. جعل سبز (50 مل) بالاختلاط 30 مل السوربيتول م 2، مل 4.05 م 1 غ₂هبو₄، 0.95 مل نة₂بو₄ و 15 مل من الماء المقطر (pH النهائي، 7.5). يمكن استكمالها مع زيمولياسي وتخزينها في مختبرين 500 ميليلتر في-20 درجة مئوية حتى استخدام عينات (5 مل).
4. إجراء التفريد هلام (1.2% [اغروس] هلام، 180V، 20 دقيقة) لتصور النتائج + المستعمرة [بكر]. تحديد ردود الفعل التي يحمل عصابات PCR بالحجم المناسب وهضم 5 ميليلتر لكل منتج رد فعل مع زهوالأول (4 إنزيم يو، س 1 الهضم المخزن المؤقت، وحمام الماء 37 درجة مئوية، ح 1) لحجب إيجابيات كاذبة (ح الشكل 1).
5. إجراء التفريد جل لتصور النبذ إكسهوي (1.2% [اغروس] هلام، 180 الخامس، 20 دقيقة). وضع علامة على المستعمرات منتجات PCR الذي يتم قطع زهوي، والتصحيح لهم إلى لوحات نعم + G418 (الرقم 1I).
6. عزل جدنا من خلايا الخميرة الأنشطار وإجراء تسلسل ل منتجات PCR²³. قارن تسلسل الحصول عليها مع تسلسل البرية من نوع تحديد الطفرات (1I الشكل).
7. مباشرة إعادة إدخال mutation(s) إلى البرية من نوع الخلايا بتحويلها مع ثوابت الانصهار تضخيمه ببكر من خلايا متحولة²³. استخدام اكتشاف للتأكد من النمط الظاهري في خلايا متحولة قدم حديثا (1J الشكل).
   1. يمكن تضخيمه بناء الانصهار التحول بسهولة من بكر مع p1 الإشعال و p10 استخدام الحمض النووي الجينومي لطفرات كالقالب في إجمالي حجم 50 ميليلتر (~ 1 ميكروغرام الحمض النووي، إنزيم يو 20، 1 x رد فعل المخزن المؤقت)، وتطبيق دورات الرد المبين في الجدول 2 . يمكن أن يتم تحول بنية باتباع الخطوات 7.1 7.13.

النتائج

يمكن تحليل طفرات Rpt4 المكتسبة عن طريق اتباع الإجراءات المبينة في الشكل 1 بتقييم ألوان المستعمرات. تم اكتشاف ألوان المستعمرات على لوحات ذات الصلة في تناقص عدد الخلايا في الشكل 2. هو إسكات في البرية من نوع المراسل ade6 + إدراجها في منطقة هيت...

Discussion

الطفرات العشوائية عن طريق PCR عرضه للخطأ أداة قوية لتوليد مجموعة متنوعة من طفرات في منطقة بعينها. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للدراسات التي تسعى إلى تقييم الدالة بروتين تحت ظرف معين. على سبيل المثال، استخدمنا هنا بكر عرضه للخطأ لتقييم وظيفة فرعية بروتوزوم 19S، Rpt4، في الحفاظ على هيتيروتشرومات?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Media
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-10KG
Yeast extract	BD Biosciences	212720
L-Leucine	JUNSEI	87070-0310
Adenine sulfate	ACR	16363-0250
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
L-Histidine	Sigma-Aldrich	H8125
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1.05108.0050
NaCl	JUNSEI	19015-0350
MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	63140
CaCl2	Sigma-Aldrich	12095
Potassium phthalate	Sigma-Aldrich	P6758-500g
Inositol	Sigma-Aldrich	I7508-50G
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B6768-1KG
MnSO4	Sigma-Aldrich	M7634-500G
ZnSO4•7H2O	JUNSEI	83060-031
FeCl2•4H2O	KANTO	CB8943686
Sodium molybdate dihydrate	YAKURI	31621
KI	JUNSEI	80090-0301
CuSO4•5H2O	YAKURI	09605
D-myo-inositol	MP biomedicals	102052
Pantothenate	YAKURI	26003
Nicotinic Acid	Sigma-Aldrich	N4126-500G
(NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Agarose	Biobasic	D0012
G418, geneticin	LPS	G41805
2. Enzyme reactions
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase	Aglient	600380	For site-directed mutagenesis
GeneMorphII Random mutagenesis Kit	Aglient	200500	For error-prone PCR
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Fisher	F-530L	For fusion PCR
Ex Taq DNA Polymerase	Takara	RR001b	For general PCR
BamH1	New England BioLabs	R0136S
Xho1	New England BioLabs	R0146S
Dpn1	New England BioLabs	R0176S
3. Equipment
Velveteen square, black	VWR	89033-116	For replica
Replica-plating tool	VWR	25395-380	For replica
MicroPulser Electroporator	Biorad	1652100	For fission yeast transformation
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	Biorad	1652086	For fission yeast transformation
Thermal Cycler	Bioer	BYQ6078	For fusion PCR ramp reaction