基因靶向随机诱变在裂变酵母中选择染色质稳定蛋白酶突变体

摘要

本文介绍了一种用于裂变酵母靶基因随机诱变的详细方法。例如, 我们针对的是rpt4+, 它对19S 蛋白酶体的亚基进行编码, 并筛选出破坏染色质的突变。

摘要

随机突变的目标基因通常是用来确定突变, 产生预期的表型。在可用于实现随机诱变的方法中, 容易出错的 PCR 技术是一种方便而有效的策略, 用于生成多样性的突变体 (i. e, 一个变种人库)。容易出错的 PCR 是一种选择的方法, 当研究人员试图变异一个预先定义的区域, 如编码区域的基因, 而离开其他基因组区域不受影响。突变体库通过易出错的 PCR 扩增后, 必须克隆成合适的质粒。由于克隆步骤的效率的限制, 容易出错的 PCR 所产生的库的大小受到制约。然而, 在裂变酵母中,粟粟中, 克隆步骤可以用高效的一步融合 PCR 来代替, 从而产生转化的构造。然后, 可以使用适当的记者选择所需表型的突变体。在这里, 我们详细描述了这个策略, 以一个例子, 一个记者插入到 centromeric 染色质。

引言

前遗传学是一种经典的方法, 研究人员寻找自然发生的突变体, 显示特定的表型, 并进行遗传分析。在反向遗传学中, 突变被引入到一个感兴趣的基因中, 并检查表型。在后一种情况下, 目标基因的随机突变经常被用来产生一个突变体, 随后被选择为期望的表型, 如温度敏感性或改变的酶活性。各种方法可用于实现随机突变, 包括易出错的 PCR¹;紫外线照射²;化学诱变, 如甲基磺酸乙酯 (EMS) 或一氧化二氮³;使用临时突变菌株, 如过度表达mutD5 ⁴;和 DNA 洗牌⁵。

在这里, 我们描述了一个反向遗传学策略, 我们利用易出错的 PCR 产生突变池的目标基因的裂变酵母。从它的名字可以推测, 这种方法通过在 PCR 过程中故意引入错误来产生突变。与其他突变方法不同, 容易出错的 PCR 允许用户定义要 mutagenized 的区域。这使得它特别有用的努力研究的功能蛋白质/领域的兴趣。

为了演示这个随机的突变过程, 我们在这里使用rpt4+, 它编码19S 蛋白酶体亚基, 作为一个例子。Rpt4 在裂变酵母^{6、7、8、9}之外的有机体中已被证明具有与蛋白质分解无关的功能, 而蛋白质水解的缺陷可能通过改变蛋白而导致间接影响。水平。因此, 我们对突变体进行了筛选, 从而引发了与蛋白水解无关的变化, 目的是研究蛋白酶体对染色质的作用。

通过调整引物的位置, 可将易出错的 PCR 应用于任何基因区域。表现出期望表型变化的突变体可以与适当的记者鉴别。在这里, 我们使用了插入到着丝粒1外部重复 (工程机械)^区域10的ade6+ 记者。本构染色质是在该区域¹¹上形成的, 因此在野外类型条件下, ade6+报告器处于静音状态;红色殖民地¹⁰表示这一点。在着丝粒上破坏本构染色质的突变将导致ade6+ 的表达式, 该报告被可视为白色的菌落。

研究方案

1. 媒体的准备工作

1. 用补充剂 (是的), 没有腺嘌呤 (是低艾德), 粟谷氨酸培养基 (普纳¹²) 和普纳, 没有腺嘌呤 (普纳), 通过混合组件, 如表 1中所述, 准备酵母提取物。是-艾德 (低艾德) 和普纳板有所有相同的成分, 但腺嘌呤是从后者省略。
   1. 使用以下盐 (50x) 库存: 52.5 克/升氯化镁₂· 6H₂O, 2 克/升 CaCl₂· 2H₂O, 50 克/升氯化钾, 2 克/升 Na₂所以₄在蒸馏水。过滤消毒使用0.22 µm 孔径过滤器和存储在4摄氏度。
   2. 使用以下维生素 (1,000x) 股票: 1 克/升泛酸, 10 克/升烟酸, 10 克/升肌醇, 10 毫克/升水生物素在蒸馏水。过滤消毒使用0.22 µm 孔径过滤器和存储在4摄氏度。
   3. 使用以下矿物 (10,000x) 库存: 5 克/升硼酸, 4 克/升 MnSO₄, 4 克/升 ZnSO₄· 7H₂O, 2 克/升 FeCl₂· 4H₂O, 0.4 克/升 MoO₃, 1 克/升, 0.4 克/升丘索₄· 5H₂o, 10 克/升柠檬酸在蒸馏水中。过滤消毒使用0.22 µm 孔径过滤器和存储在4摄氏度。
      注: 是液体培养基可通过省略琼脂制成。
2. 蒸压介质, 冷却到60摄氏度以下, 搅拌时用搅拌棒, 速度为 200 rpm。
3. 对于 YES+G418 (geneticin) 板, 请将1毫升/升 G418 库存解决方案添加到 "是" 介质中。
   1. 使用以下 G418 (1,000x) 库存: 100 毫克/毫升 G418 蒸馏水。过滤消毒使用0.22 µm 孔径过滤器, 整除1.5 毫升离心管, 并存储在-20 摄氏度。
4. 再搅拌 5-10 分钟, 将介质整除成90毫米培养皿 (中等整除数的1升至大约40培养皿。把盘子存放在4摄氏度。

2. 克隆rpt4+及其 5 '/3 ' UTRs

1. 用引物 p1 和 p2 (图 1A) 进行 PCR, 以裂变酵母基因组 DNA (gDNA) 作为模板, 总体积为50µL (~ 1 µg DNA, 20 U 型酶, 1x 反应缓冲器), 并应用表 2中描述的反应周期放大3315基对 (bp) 片段, 包括rpt4+及其 5 '/3 ' UTRs。使用制造商 (图 1A) 指示的纯化套件¹³提纯 PCR 产品。
2. 摘要 pBlueScript KS (-) 向量¹⁴和包含rpt4+的放大 DNA 片段, 其 5 '/3 ' UTRs 与BamH1和Xho1在总容积20µL (~ 1 µg DNA, 20 U 酵素, 1x 消化缓冲) 在37°c 在水浴为 16-18h (图 1B)。
3. 凝胶纯化消化载体 (1.2% 琼脂糖凝胶) 和 DNA 插入通过执行泰基琼脂糖凝胶电泳 (100 V, 1 h), 切除所需尺寸的 dna 带, 并将 dna 与凝胶萃取套件¹⁵隔离。
4. 结扎使用 T4 dna 连接酶的载体和 dna 插入, 执行 20-µL 结扎反应, 含有 50-100 ng 的载体 dna, 3 倍摩尔超过插入 dna, 400 U T4 DNA 连接酶, 1x 结扎缓冲。孵化这种混合物在18°c 16-18 小时。
5. 应用热休克七十年代42摄氏度, 将结扎后的 DNA 转化为100µL 的大肠杆菌DH5α。添加1毫升磅和孵育1小时在37摄氏度, 以恢复。执行离心 (13800 x g), 丢弃上清, 在 LB 氨苄西林 (LA) 板上全部转化的大肠杆菌细胞, 并在37摄氏度孵育16小时。
6. 选择 4-8 殖民地与牙签和增长隔夜在37°c 在3毫升 LA 媒介。
7. 根据制造商的协议, 用质粒纯化套件¹⁶隔离粒度, 并执行分析限制酶消解与5µL 的分离质粒, 5 U 的每种限制酶 (BamH1和Xho1) 和1x 限制缓冲区。在37摄氏度的水浴中孵育反应混合物3小时. 通过序列候选质粒对克隆进行确认。

3. 引入无声变异 (Xho1限制网站)

1. 设计一对 33-bp 引物 (p3 和 p4), 其中包含所需的突变在其他补充序列。
2. 使用表 10中列出的循环参数, 用高保真聚合酶¹⁷ (图 1C) 的总体积25µL (10 ng 克隆质粒, 2 µL 2 pmol 底漆混合, 3 U 酶, 1x 反应缓冲器) 进行 PCR。
3. 将模板质粒与DpnI 一起消化, 总容积为20µL (20 U 酵素, 1x 消化缓冲) 在37°c 在水浴中1小时。
4. 如步骤 2.5-2.7 所述, 对含有无声突变的质粒进行变换、传播、分离和序列化。
   注意:这种无声突变也可以使用一种克隆方法来引入, 它允许在单个反应¹⁸中加入多个 DNA 片段。

4. 随机突变的rpt4+由易出错 PCR

1. 执行易出错的 PCR, 使用质粒与无声突变 (Xho1站点) 作为模板, 引物 p5 和 p6, 总容量50µL (在步骤4.1.1 定义的模板量, 2 µL 10 pmol 底漆混合, 2.5 U 酵素, 1x 反应缓冲)以及用于生成高错误率¹⁹ (图 1D) 的特殊聚合酶。按照表 2中的说明执行 PCR。
   1. 使用 4-5 µg 模板质粒控制突变频率为 1 bp/kb (kilobase)。
      注意:一个高浓度 (> 500 ng/µL) 的质粒, 可以获得使用迷你准备套件²⁰, 是必需的。
2. 用凝胶电泳确认 2670 bp (1.2% 琼脂糖凝胶) 的 PCR 产物。凝胶纯化此 PCR 产品, 如步骤2.5 所述。

5. 合成 PCR 片段 (菅直人, 3 ' UTR)

1. 使用 pFA6a-KANMX6²¹作为模板、引物 p7 和 p8, 以及表4中列出的条件来获取标记 (菅直人) 片段, 执行 PCR。凝胶纯化产生的 1480 bp 片段, 如步骤 2.5 (图 1E) 所述。
   1. 检查以突变为目标的基因的停止密码子和相邻基因的编码区域是否由超过500的 bp 分离。当该区域小于 500 bp 时, 可能不使用内生终结器;相反, 应该使用抗利尿终止符而不是内生终止符。表 5中显示了使用抗利尿终结器所需的协议更改。
      注意:仅当使用 pFA6a-3HA-KANMX6 质粒中可用的抗利尿终结器而不是内生终止符时, 这些更改才适用。
2. 用克隆的rpt4+包含的向量作为模板和引物 p9 和 p10, 在总容积50µL (20 ng 克隆质粒中) 进行 PCR, 2 µL 10 pmol 底漆混合, 2 U 型酶, 1x 反应缓冲器), 使用表 6中提供的条件。凝胶纯化获得的 506-bp 3 ' UTR 片段 (图 1E)。

6. 融合 PCR 法生成转换构造 (图 1E)

1. 在 50 ng/µL 上准备3个片段 (mutagenized rpt4+、菅直人和 3 ' UTR)。
2. 使用底漆 p11 和 p12 进行三片段的融合 PCR, 如表7所述。(融合 PCR 的协议是对原始协议²²的修改。净化主要的 4398-bp PCR 产品。
   1. 使用rpt4+: KAN:3'UTR 碎片的比率为 1:3: 1, 以获得最佳结果。
      注意:插入 DNA 的总量不应超过 500 ng。建议的rpt4+数量: KAN:3'UTR 是 50 ng:150 ng:50 ng。mutagenized 区域约为 1.6 kb, 因此, 将每个基地的所有可能组合的最低数量的酵母菌落, 将被变异到其他三是 1600 x 3 = 4800 殖民地。由于一个转化反应通常产生 400-500 菌落, 至少有10反应价值的融合 PCR 结构是需要的。这种需要可以通过简单地增加反应量 (即, PCR 管的数量) 来满足, 系数为十。

7. 用电穿孔法转化裂变酵母 (图 1F)

1. 接种酵母到10毫升的是培养基饱和通过孵化超过16小时。
2. 稀释细胞到光学密度在600毫微米 (OD₆₀₀) 0.2 在200毫升是中等和孵化在30°c 与震动为 5-6 h, 到 OD₆₀₀ = 0.6-0.8。
3. 将单元格集中到 OD₆₀₀ = 30, 免除四50毫升锥形管, 并在冰上冷却10分钟。
4. 以 1050 x g 为3分钟, 在4摄氏度进行离心, 收获细胞。把管子和10电小试管放在冰上。在冰上执行步骤 7.3-7.8。
5. 丢弃上清, 加入15毫升1.2 米山梨醇。轻轻摇动管子, 并用重悬细胞。
6. 离心细胞在 1050 x g 3 分钟在4摄氏度。
7. 重复步骤7.4 和7.5。放弃上清。添加500µL 1.2 米山梨醇的每管, 并用重悬细胞, 并收集所有的细胞在一个15毫升锥管。
8. 添加1.2 米山梨醇高达2.4 毫升 (OD₆₀₀ = 10 每0.2 毫升)。把管子放在冰上。
9. 添加200µL 山梨醇悬浮细胞 (确保它们完全悬浮) 到含有融合 PCR 结构的 EP 管, 混合好, 并将样品转移到电试管。
10. Electroporate 细胞具有以下选择: 真菌, ShS (2.00kV, 1 脉冲)。
11. 添加600µL 1.2 米山梨醇对每个电试管的总容量800µL, 然后传播细胞在四是板材 (200 µL/板材)。十电小试管将免除40是板材。
12. 在30摄氏度孵化出24小时的板材。
13. 对 YES+G418 进行复制, 并在30摄氏度的3天内孵化板材。

8. 染色质不稳定突变体的选择和检查误报

1. 对于每个 YES+G418 板, 执行副本电镀, 以是艾德 (低艾德) 和普纳 (无艾德) 板。将复制板孵化 1-2 天, 在30摄氏度, 直到一些在 YES 板上的殖民地显示红色着色 (图 1G)。
2. 比较是艾德和普纳板, 并选择显示粉红色或白色的在 "是" 板上, 也生长在普纳板上的细胞。不要在普纳上选择没有生长的菌落, 因为它们是假阳性 (例如,反映了菅直人在基因组其他地方的非目标站点被集成)。
3. 从每个菌落中选取大约 1 x 10⁵单元格, 并在10µL 的 SPZ 溶液中孵化, 其中包含2.5 毫克/毫升 zymolyase 100 T, 37 摄氏度, 至少30分钟. 使用此解决方案的1µL 作为菌落 PCR (图 1H) 的起始模板执行。
   1. 使 SPZ (50 毫升) 混合30毫升2米山梨醇, 4.05 毫升1米 Na₂HPO₄, 0.95 毫升 NaH₂PO₄和15毫升蒸馏水 (最终 pH, 7.5)。样品 (5 毫升) 可以补充与 zymolyase 和存储在 500-µL 整除数在-20 °c, 直到使用。
4. 进行凝胶电泳 (1.2% 琼脂糖凝胶, 180V, 20 分钟), 以可视化的结果 + 菌落 PCR。选择与XhoI (4 U 酵素, 1x 消化缓冲, 37 °c 水浴, 1 h) 一起展示适当的大小的 PCR 带和消化5µL 的反应产品, 以筛出误报 (图 1H)。
5. 进行凝胶电泳以可视化XhoI文摘 (1.2% 琼脂糖凝胶, 180 V, 20 分钟)。标记其 PCR 产品由XhoI剪切的菌落, 并将它们贴到 YES+G418 板上 (图 1I)。
6. 将 gDNA 与裂变酵母细胞分离, 并执行 PCR 产品的序列化²³。将获得的序列与野类型序列进行比较, 以识别突变 (图 1I)。
7. 通过将突变细胞的 PCR 扩增的融合结构转化为野生型细胞, 直接将突变引入²³。使用斑点来确认新制作的突变细胞中的表型 (图 1J)。
   1. 利用突变体的基因组 DNA 作为模板, 在50µL (~ 1 µg DNA、20 p1 酶、1x 反应缓冲器) 中, 通过 PCR 与引物和 p10, 可以很容易地扩增融合转化结构, 并应用表2中描述的反应周期. .构造的转换可以通过以下步骤 7.1-7.13 完成。

结果

通过遵循图 1中描述的过程, 可以通过评估菌落的颜色来分析获得的 Rpt4 突变体。在减少图 2中的单元格数时, 会在相关的板块上发现菌落的颜色。插入到染色质区域的ade6+报告器在野生类型中被静音, 并显示在 "YES" 板块中的红色菌落。一旦染色质被破坏, 并且ade6+报告器被表达, 可以在 "YES" 板块中观察到白色的菌落, ...

讨论

随机突变通过容易出错的 PCR 是一个强大的工具, 以产生一个不同的突变池在某一地区。这种技术对于那些试图在特定情况下评估蛋白质功能的研究尤其有用。例如, 我们在这里使用了易出错的 PCR 评估19S 蛋白酶体亚基, Rpt4, 在染色质维护的功能。通过改变容易出错的 PCR 和调整筛选条件的区域, 我们能够在感兴趣的基因组区域和屏幕上变异细胞, 以期望的表型。最近, 一种类似的方法被用来隔离在主...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Media
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-10KG
Yeast extract	BD Biosciences	212720
L-Leucine	JUNSEI	87070-0310
Adenine sulfate	ACR	16363-0250
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
L-Histidine	Sigma-Aldrich	H8125
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1.05108.0050
NaCl	JUNSEI	19015-0350
MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	63140
CaCl2	Sigma-Aldrich	12095
Potassium phthalate	Sigma-Aldrich	P6758-500g
Inositol	Sigma-Aldrich	I7508-50G
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B6768-1KG
MnSO4	Sigma-Aldrich	M7634-500G
ZnSO4•7H2O	JUNSEI	83060-031
FeCl2•4H2O	KANTO	CB8943686
Sodium molybdate dihydrate	YAKURI	31621
KI	JUNSEI	80090-0301
CuSO4•5H2O	YAKURI	09605
D-myo-inositol	MP biomedicals	102052
Pantothenate	YAKURI	26003
Nicotinic Acid	Sigma-Aldrich	N4126-500G
(NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Agarose	Biobasic	D0012
G418, geneticin	LPS	G41805
2. Enzyme reactions
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase	Aglient	600380	For site-directed mutagenesis
GeneMorphII Random mutagenesis Kit	Aglient	200500	For error-prone PCR
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Fisher	F-530L	For fusion PCR
Ex Taq DNA Polymerase	Takara	RR001b	For general PCR
BamH1	New England BioLabs	R0136S
Xho1	New England BioLabs	R0146S
Dpn1	New England BioLabs	R0176S
3. Equipment
Velveteen square, black	VWR	89033-116	For replica
Replica-plating tool	VWR	25395-380	For replica
MicroPulser Electroporator	Biorad	1652100	For fission yeast transformation
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	Biorad	1652086	For fission yeast transformation
Thermal Cycler	Bioer	BYQ6078	For fusion PCR ramp reaction