Gene-dirigido mutagénesis al azar para seleccionar a mutantes de proteasoma desestabilizadoras de la heterocromatina en la levadura de fisión

Resumen

Este artículo describe una metodología detallada para la mutagénesis al azar de un gene de la blanco en la levadura de fisión. Por ejemplo, apuntamos rpt4 +, que codifica una subunidad del proteasoma 19S y defender para las mutaciones que desestabilizan la heterocromatina.

Resumen

Mutagénesis al azar de un gene de la blanco se utiliza comúnmente para identificar las mutaciones que producen el fenotipo deseado. De los métodos que pueden utilizarse para lograr la mutagénesis al azar, error-prone PCR es una estrategia conveniente y eficiente para la generación de un diverso grupo de mutantes (es decir., una biblioteca mutante). Error-prone PCR es el método de elección cuando un investigador intenta mutar una región previamente definida, como la región codificante de un gen dejando otras regiones genómicas inafectado. Después de que la biblioteca mutante se amplifica por PCR propensa a errores, debe ser clonado en un plásmido adecuado. El tamaño de la biblioteca generado por error-prone PCR está limitado por la eficiencia de la clonación del paso. Sin embargo, en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe, el paso de la clonación puede reemplazarse por el uso de una fusión de un solo paso muy eficiente PCR para generar construcciones para la transformación. Mutantes de fenotipos deseados pueden seleccionarse entonces usando reporteros apropiados. Aquí, describimos esta estrategia en detalle, tomando como ejemplo, un reportero insertado en centromérica de la heterocromatina.

Introducción

Genética directa es un método clásico en el que los investigadores buscan a mutantes naturales que muestran un fenotipo particular y realizan análisis genéticos. En la genética reversa, se introducen mutaciones en un gen de interés y se examina el fenotipo. En este último caso, mutagénesis al azar de un gene de la blanco se utiliza a menudo para generar un grupo de mutantes que son posteriormente seleccionados para fenotipos deseados, tales como sensibilidad de temperatura o altera la actividad enzimática. Diversos métodos pueden utilizarse para mutagénesis al azar, incluyendo error-prone PCR¹; De irradiación UV²; mutágenos químicos, tales como Metanosulfonato de etilo (EMS) o ácido nitroso³; el uso de cepas mutator temporal, tales como sobre-expresando mutD5 ⁴; y barajado de ADN⁵.

Aquí, describimos una estrategia genética inversa en la cual utilizamos error-prone PCR para generar piscinas mutantes para un gen blanco en la levadura de fisión. Como uno puede imaginar por su nombre, este método genera mutaciones introduciendo deliberadamente errores durante el PCR. A diferencia de otros métodos de mutagénesis, error-prone PCR permite al usuario definir la región a ser mutagenized. Esto es particularmente útil en esfuerzos para estudiar la función de dominio y una proteína de interés.

Para demostrar este procedimiento mutagénesis al azar, en este documento utilizamos rpt4 +, que codifica la subunidad de proteasoma 19S, como un ejemplo. Rpt4 se ha demostrado que tienen funciones independientes de la proteólisis en organismos distintos de fisión levaduras^6,7,8,9, y un defecto en la proteólisis puede causar efectos indirectos mediante la alteración de las proteínas niveles. Nosotros, por lo tanto, para los mutantes que desencadenó cambios independientes de la proteólisis, con el objetivo de investigar la función del proteasoma en la heterocromatina.

Error-prone PCR puede aplicarse a cualquier región del gene de templar la situación en la que se unen los cebadores. Mutantes que exhiben el cambio fenotípico deseado pueden identificarse con los reporteros apropiados. Aquí, utilizamos un ade6 + reportero insertado en el centrómero 1 exterior repita (otr) región¹⁰. Heterocromatina constitutiva es formada en esta región¹¹, por lo que el reportero ade6 + está silenciado en la condición de tipo salvaje; Esto es indicado por las colonias rojo¹⁰. Una mutación que desestabiliza la heterocromatina constitutiva en el centrómero dará lugar a la expresión de la ade6 + reporter, que se visualiza como colonias blancas.

Protocolo

1. preparación de medios de

1. Preparar Extracto de levadura con suplementos (sí), sí sin adenina (Ade baja de sí), media de Pombe Glutamate (PMG¹²) y PMG sin adenina (Ade-PMG) mezclando los componentes como se describe en la tabla 1. SÍ-Ade (bajo Ade) y placas PMG-Ade tienen todos los mismos componentes, pero la adenina se omite de este último.
   1. Utilice el siguiente stock de sal (50 x): 52,5 g/L MgCl₂·6H₂O 2 g/L CaCl₂·2H₂O 50 g/L de KCl, 2 g/L Na₂para₄ en agua destilada. Filtro esterilice usando un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C.
   2. Utilizar la vitamina siguiente (1, 000 x) stock: 10 g/L de ácido nicotínico, pantotenato de 1 g/L, biotina 10 mg/L en agua destilada, 10 g/L inositol. Filtro esterilice usando un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C.
   3. Utilice el siguiente mineral (10, 000 x) stock: 5 g/L de ácido bórico, 4 g/L MnSO₄, 4 g/L ZnSO₄·7H₂O, 2 g/L FECLAS₂·4H₂O 0.4 g/L MoO₃, KI, 0.4 g/L CuSO₄·5H₂O de 1 g/L , 10 g/L de ácido cítrico en agua destilada. Filtro esterilice usando un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C.
      Nota: Medio líquido sí puede realizarse omitiendo el agar.
2. Medio de autoclave y enfriar a continuación 60 ° C mientras revuelve con una barra de agitación, a una velocidad de 200 rpm.
3. Para las placas sí + G418 (geneticin), agregue solución 1 mL/L G418 al medio sí.
   1. Utilice el siguiente G418 (1, 000 x) stock: G418 100 mg/mL en agua destilada. Filtro de esterilización usando un filtro de tamaño de poro de 0.22 μm, alícuota a tubos de centrífuga de 1.5 mL y almacenar a-20 ° C.
4. Revuelva con otro 5-10 min y alícuota los medios platos de Petri de 90 mm (a 1 L de medio alícuotas a aproximadamente 40 placas de Petri. Almacenar las placas a 4 ° C.

2. clonación de rpt4 + y su 5' / 3' UTRs

1. Realizar la PCR con iniciadores p1 y p2 (figura 1A) usando la fisión levadura DNA genómico (gDNA) como la plantilla en un volumen total de 50 μl (~ 1 μg ADN, enzima de U 20, 1 x buffer de reacción), y aplicando los ciclos de reacción se describe en la tabla 2 para ampliar una base de 3.315 (bp) fragmento formado por rpt4 + y su 5' / 3' UTRs. Purificar el producto PCR utilizando un kit de purificación¹³ como lo indique el fabricante (figura 1A).
2. Digerir la de vector pBlueScript KS(-)¹⁴ y el fragmento de ADN amplificado con rpt4 + con sus 5' / 3' UTRs con BamH1 y Xho1 en un volumen total de 20 μl (~ 1 μg de ADN, 20 de U de enzima, tampón de digestión x 1) a 37 ° C en un baño de agua durante 16-18 h (figura 1B).
3. Gel purifica el vector digerido (gel de agarosa al 1,2%) e inserte el ADN por realizar la electroforesis en gel de agarosa TAE-basado (100 V, 1 h), suprimir las bandas de ADN de los tamaños deseados y aislar el ADN con una de kit de extracción de gel de¹⁵.
4. Ligar el vector y el inserto de ADN con ligase de la DNA de T4 mediante la realización de una reacción de la ligadura de 20 μl que contiene 50-100 ng del vector de la DNA, una ~ 3-fold exceso molar del ADN inserto y 400 U T4 ADN ligasa 1 x buffer de la ligadura. Incubar la mezcla a 18 ° C durante 16-18 h.
5. Transformar el ADN ligado en 100 μl de e. coli DH5α mediante la aplicación de choque térmico de 70 s a 42 ° C. Añadir 1 mL de LB e incubar 1 h a 37 ° C para la recuperación. Realizar la centrifugación (13.800 x g), descartar el sobrenadante, placa de la transformada de e. coli células en placas de LB-ampicilina (LA) e incubar a 37 ° C por 16 h.
6. Tomar 4-8 colonias con palillos de dientes y crecer durante la noche a 37 ° C en medio de 3 mL LA.
7. Aislar la plásmidos con un plásmido purificación kit¹⁶ utilizado según protocolo del fabricante y realizar análisis enzimático de la restricción digestiones con 5 μl del plásmido aislada, 5 U de cada enzima de restricción (BamH1 y Xho1) y 1 x de buffer de restricción. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C en un baño de agua durante 3 h. confirmar la clonación mediante la secuenciación de los plásmidos de candidato.

3. Introducción de la mutación silenciosa (sitio de la restricción deXho1 )

1. Diseño de un par de cartillas 33-bp (p3 y p4) que contienen la mutación deseada en la secuencia complementaria de lo contrario.
2. Realizar la polimerización en cadena con polimerasa de alta fidelidad¹⁷ (figura 1) en un volumen total de 25 μl (10 ng de plásmido clonado, 2 μl de 10 pmol cartilla mezcla, enzima U 2, 1 x buffer de reacción) utilizando los parámetros ciclismo enumerados en la tabla 3.
3. Digerir el plásmido de plantilla con DpnI en un volumen total de 20 μl (20 U enzima, tampón de digestión 1 x) a 37 ° C en un agua de baño para 1 h.
4. Transformar, propagar, aislar y secuenciar el plásmido que contiene la mutación silenciosa, como se describe en pasos de 2.5-2.7.
   Nota: La mutación silenciosa también puede introducirse mediante un método de clonación que permite la Unión de varios fragmentos de la DNA en una sola reacción¹⁸.

4. al azar mutagénesis de rpt4 + por Error-prone PCR

1. Realizar PCR propensa a errores, utilizando el plásmido con la mutación silenciosa (Xho1 sitio) como la plantilla, cartillas p5 y p6, un volumen total de 50 μl (la cantidad de plantilla definida en el paso 4.1.1, 2 μl de mezcla de cartilla de 10 pmol, enzima U 2.5, tampón de reacción x 1) , y una polimerasa especial que está diseñada para generar un error de alta velocidad¹⁹ (figura 1). Realizar PCR como se describe en la tabla 2.
   1. Utilizar 4-5 μg de plásmido de plantilla para controlar la frecuencia de mutación a 1 bp/kb (kilobases).
      Nota: Una alta concentración (> 500 ng/μL) del plásmido, que se puede obtener utilizando un kit de preparación mini-para el²⁰, se requiere.
2. Utilice gel de electroforesis para confirmar un producto PCR de 2670 bp (gel de agarosa al 1,2%). Gel purifica este producto PCR como se describe en el paso 2.5.

5. preparación de los fragmentos PCR de fusión (KAN, 3' UTR)

1. Realizar PCR utilizando pFA6a-KANMX6²¹ como plantilla, cartillas p7 y p8, y las condiciones enumeran en la tabla 4 para obtener el fragmento de marcador (KAN). Gel purifica el fragmento resultante de 1.480-bp como se describe en el paso 2.5 (Figura 1E).
   1. Compruebe si el codón del gen para la mutación y la región de la codificación de su gen adyacente están separados por más de 500 bp. El terminador endógeno no puede utilizarse cuando la región es inferior a 500 bp; algo, el terminador de ADH puede usarse en lugar del terminator endógena. Los cambios de protocolo necesarios para utilizar el terminador de ADH se presentan en la tabla 5.
      Nota: Estos cambios sólo se aplican cuando el terminador de la ADH , que está disponible en el plásmido pFA6a-3HA-KANMX6, se utiliza en lugar del terminator endógena.
2. Realizar la PCR con la clonada rpt4 +-que contiene el vector como la plantilla y las cartillas p9 y p10 en un volumen total de 50 μl (20 ng de plásmido clonado, 2 μl de 10 pmol cartilla mezcla, enzima U 2, 1 x buffer de reacción), utilizando las condiciones presentadas en el cuadro 6. Gel purifican obtenidos 506 bp 3' UTR fragmento (Figura 1E).

6. generación de la construcción de la transformación por fusión PCR (Figura 1E)

1. Preparar los 3 fragmentos (mutagenized rpt4 +, KAN y el 3' UTR) a 50 ng/μl.
2. Realizar fusión que polimerización en cadena de los tres fragmentos utilizando primers p11 y p12, tal como se describe en la tabla 7. (El protocolo de fusión PCR es una modificación del protocolo original²²). Purificar el producto PCR de 4.398-bp principales.
   1. Utilice rpt4 +: KAN:3'UTR fragmentos en una proporción de 1:3:1 para obtener resultados óptimos.
      Nota: La cantidad total de ADN inserto no debe exceder 500 ng. La cantidad recomendada de rpt4 +: KAN:3'UTR es de 50 ng de ng:50 de ng:150. La región mutagenized es aproximadamente 1,6 kb, por lo que el número mínimo de colonias de levaduras que se representan todas las combinaciones posibles de cada base se mutó a los otros tres es 1.600 x 3 = 4.800 colonias. Debido a una reacción de transformación produce típicamente 400-500 colonias, por lo menos 10 reacciones digno de fusión PCR construir es necesario. Esta necesidad puede satisfacerse simplemente aumentando la cantidad de reacción (es decir, el número de tubos PCR) por un factor de diez.

7. transformación de la levadura de fisión por electroporación (Figura 1F)

1. Inocular la levadura a 10 mL de medio sí saturación por incubar durante más de 16 h.
2. Diluir las células a una densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) de 0.2 en 200 mL de sí medio e incubar a 30 ° C con agitación durante 5-6 h, para OD₆₀₀ = 0.6 - 0.8.
3. Concentrar las células OD₆₀₀ = 30, dispensar a cuatro tubos cónicos de 50 mL y enfriar en hielo durante 10 minutos.
4. La cosecha de las células mediante la realización de centrifugación a 1.050 x g durante 3 min a 4 ° C. Coloque los tubos y cubetas de electro 10 en hielo. Realice los pasos 7.3-7.8 en hielo.
5. Deseche el sobrenadante y añadir 15 mL de sorbitol de 1,2 M. Agitar suavemente los tubos para resuspender las células.
6. Centrifugar las células a 1050 x g durante 3 min a 4 ° C.
7. Repita los pasos 7.4 y 7.5. Deseche el sobrenadante. Añadir 500 μl de sorbitol de 1.2 M a cada tubo, resuspender las células y recoger todas las células en un tubo cónico de 15 ml.
8. Añadir sorbitol M 1,2 a 2,4 mL (OD₆₀₀ = 10 por 0,2 mL). Mantenga el tubo en hielo.
9. Añadir 200 μL de células suspendidas de sorbitol (Asegúrese de que se suspenden completamente) a un tubo de EP que contiene la fusión PCR construir, mezclar bien y transferir la muestra a una cubeta de electro.
10. Electroporate las células con las siguientes opciones: hongos, ShS (2.00kV, 1 pulso).
11. Añadir 600 μl de 1,2 M sorbitol a cada cubeta de electro para un volumen total de 800 μl y luego las células en sí cuatro platos (200 μl/placa). Diez cubetas de electro dispensará a 40 sí las placas.
12. Incubar las placas a 30 ° C durante 24 h.
13. Realizar placas réplica a sí + G418 e Incube las placas a 30 ° C durante 3 días.

8. selección de mutantes desestabilizadoras de heterocromatina y comprobación de falsos positivos

1. Para cada placa sí + G418, realizar chapado en réplica a sí-Ade (bajo Ade) y placas PMG-Ade (No Ade). Incubar las placas de réplica durante 1-2 días a 30 ° C, hasta que algunas de las colonias en las placas Ade sí muestran una coloración roja (figura 1).
2. Comparar placas sí-Ade y PMG-Ade y seleccionar las células que muestran color rosa o blanco en la placa sí-Ade y también crecen en la placa de PMG-Ade. No seleccione colonias sin crecimiento en PMG-Ade, ya que son falsos positivos (por ejemplo, lo que refleja que el cassette de KAN se ha integrado en un sitio de destino no en otros lugares en el genoma).
3. Recoger aproximadamente 1 x 10⁵ células de cada colonia e incuban en 10 μl de solución SPZ que contiene 2,5 mg/mL zymolyase 100 T a 37 ° C durante al menos 30 min uso 1 μl de esta solución como la plantilla inicial para Colonia PCR (figura 1 H).
   1. Hacer los SPZ (50 mL) mezclando 30 mL de sorbitol de 2 M, 4,05 mL de 1 M de Na₂HPO₄, 0,95 mL NaH₂PO₄ y 15 mL de agua destilada (pH final, 7.5). Muestras (5 mL) pueden ser complementadas con zymolyase y almacenar en alícuotas de 500 μl a-20 ° C hasta su uso.
4. Realizar la electroforesis en gel (gel de agarosa al 1.2%, 180V, 20 min) para visualizar los resultados de + la Colonia PCR. Seleccione las reacciones que exhiben bandas PCR del tamaño adecuado y digestión 5 μl de cada producto de la reacción con XhoI (4 U enzima, tampón de digestión x 1, baño de agua de 37 ° C, 1 h) para descartar falsos positivos (figura 1 H).
5. Realizar la electroforesis en gel para visualizar los resúmenes XhoI (gel de agarosa 1.2%, 180 V, 20 min). Marque las colonias cuyos productos PCR se cortan por XhoIy parche a las placas sí + G418 (figura 1I).
6. Aislar gDNA de las células de la levadura de fisión y realizar la secuencia de los productos PCR²³. Comparar la secuencia obtenida con la secuencia wild type para identificar mutaciones (figura 1I).
7. Directamente volver a introducir la mutación a las células de tipo salvaje transformándolos con fusión construcciones amplificadas por PCR de las células mutantes²³. Utilice manchado para confirmar el fenotipo de las células mutantes recién hechas (Figura 1J).
   1. Fusión transformación construcción puede ser fácilmente amplificada por PCR con iniciadores p1 y p10 usando la DNA genomic de mutantes como la plantilla en un volumen total de 50 μl (~ 1 μg ADN, enzima de U 20, 1 x buffer de reacción) y la aplicación de los ciclos de reacción se describe en tabla 2 . Transformación de la construcción se puede hacer siguiendo los pasos 7.1-7.13.

Resultados

Los mutantes Rpt4 adquiridos siguiendo los procedimientos descritos en la figura 1 se pueden analizar mediante la evaluación de los colores de las colonias. Los colores de las colonias se han manchado en las placas correspondientes en la disminución de número de células en la figura 2. El reportero ade6 + insertado en la región de heterocromatina es silenciado en el tipo salvaje y colonias rojo muestra en la placa s...

Discusión

Mutagénesis al azar mediante error-prone PCR es una poderosa herramienta para la generación de un diverso grupo de mutantes en una región determinada. Esta técnica es especialmente útil para estudios que intentan evaluar la función de una proteína en una circunstancia específica. Por ejemplo, en el presente documento utilizamos error-prone PCR para evaluar la función de la subunidad del proteasoma 19S, Rpt4, en mantenimiento de heterocromatina. Variando la región dirigida por el error-prone PCR y ajustar las co...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Media
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-10KG
Yeast extract	BD Biosciences	212720
L-Leucine	JUNSEI	87070-0310
Adenine sulfate	ACR	16363-0250
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
L-Histidine	Sigma-Aldrich	H8125
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1.05108.0050
NaCl	JUNSEI	19015-0350
MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	63140
CaCl2	Sigma-Aldrich	12095
Potassium phthalate	Sigma-Aldrich	P6758-500g
Inositol	Sigma-Aldrich	I7508-50G
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B6768-1KG
MnSO4	Sigma-Aldrich	M7634-500G
ZnSO4•7H2O	JUNSEI	83060-031
FeCl2•4H2O	KANTO	CB8943686
Sodium molybdate dihydrate	YAKURI	31621
KI	JUNSEI	80090-0301
CuSO4•5H2O	YAKURI	09605
D-myo-inositol	MP biomedicals	102052
Pantothenate	YAKURI	26003
Nicotinic Acid	Sigma-Aldrich	N4126-500G
(NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Agarose	Biobasic	D0012
G418, geneticin	LPS	G41805
2. Enzyme reactions
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase	Aglient	600380	For site-directed mutagenesis
GeneMorphII Random mutagenesis Kit	Aglient	200500	For error-prone PCR
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Fisher	F-530L	For fusion PCR
Ex Taq DNA Polymerase	Takara	RR001b	For general PCR
BamH1	New England BioLabs	R0136S
Xho1	New England BioLabs	R0146S
Dpn1	New England BioLabs	R0176S
3. Equipment
Velveteen square, black	VWR	89033-116	For replica
Replica-plating tool	VWR	25395-380	For replica
MicroPulser Electroporator	Biorad	1652100	For fission yeast transformation
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	Biorad	1652086	For fission yeast transformation
Thermal Cycler	Bioer	BYQ6078	For fusion PCR ramp reaction