Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli

Özet

Bu makalede ayrıntılı bir metodoloji fisyon mayası bir hedef gen rasgele mutagenesis için. Örnek olarak, biz bir alt birim 19S proteasome ve ekran heterochromatin istikrarsızlaştırmak mutasyonlar için kodlar rpt4 +, hedef.

Özet

Bir hedef gen rasgele mutagenesis sık istenen fenotip verim mutasyonlar tanımlamak için kullanılır. Rastgele mutagenesis elde etmek için kullanılabilecek yöntemleri, hataya PCR mutantların farklı bir havuz oluşturmak için uygun ve verimli bir strateji olduğunu (i.e., mutasyona uğramış bir kütüphane). Hataya PCR yönteminin seçimi olduğunda bir araştırmacı genomik diğer bölgeler etkilenmemiş bırakarak bir genin kodlama bölge gibi önceden tanımlanmış bir bölge mutasyona istiyor. Mutant kütüphane tarafından hataya PCR güçlendirilmiş sonra uygun bir plazmid klonlanmış gerekir. Hataya PCR tarafından oluşturulan Kütüphane boyutu klonlama adım verimlilik ile sınırlıdır. Ancak, fisyon mayası, Schizosaccharomyces pombe, klonlama adım yüksek verimli tek adımlı füzyon dönüşüm yapıları oluşturmak için PCR kullanımı tarafından değiştirilebilir. İstenen fenotipleri mutantlar sonra uygun gazetecilere kullanarak seçilebilir. Burada, biz bir örnek, centromeric heterochromatin eklenen bir muhabir olarak alınmıştır ayrıntılı olarak, bu strateji tanımlarlar.

Giriş

İleri genetik hangi araştırmacılar belirli bir fenotip görüntülemek doğal olarak meydana gelen mutantlar aramak ve genetik çözümlemesi klasik bir yöntemdir. Ters Genetik mutasyonlar faiz bir gen tanıtıldı ve fenotip inceledi. İkinci durumda, hedef gen rasgele mutagenesis kez daha sonra sıcaklık hassasiyeti gibi istenen fenotipleri için seçilir veya enzimatik aktivite değiştirilen mutant bir havuz oluşturmak için kullanılır. Rastgele mutagenesis, hataya PCR¹de dahil olmak üzere elde etmek için çeşitli yöntemler kullanılabilir; UV ışınlama²; kimyasal mutajen, etil methanesulfonate (EMS) veya Nitröz asit³gibi; Bu mutD5 ⁴aşırı ifade gibi geçici mutator suşları kullanımı; ve DNA⁵karıştırma.

Burada, hangi biz hataya PCR için bir hedef gen mutasyona uğramış havuzları fisyon mayası oluşturmak için kullanmak için bir ters-genetik strateji tanımlarlar. Bir adından tahmin edebileceğiniz gibi bu yöntem kasten PCR sırasında hataları tanıtarak mutasyonlar oluşturur. Diğer mutagenesis yöntemlerinden farklı olarak, hataya PCR mutagenized için bölge tanımlamak kullanıcı sağlar. Bu çabaları ilgi bir protein/etki alanı işlevinin çalışması için özellikle faydalı kılmaktadır.

Bu rasgele mutagenesis yordamı göstermek için biz burada 19S proteasome alt birim kodlar, rpt4 +, örnek olarak kullanın. Rpt4 fisyon mayası^6,7,8,9farklı organizmalarda proteolizis bağımsız işlevler için gösterilmiştir ve proteolizis bir üründe proteinler değiştirerek dolaylı etkilere neden düzeyleri. Biz bu nedenle, proteolizis bağımsız değişiklikler, proteasome heterochromatin Tarih işlevi araştırma amacı ile tetiklenen mutantlar tarandı.

Hataya PCR, astar bağlama konumu ayarlama tarafından herhangi bir gen bölgesine uygulanabilir. İstenen fenotipik değişikliği gösteren mutantlar ile uygun gazetecilere tespit edilebilir. Burada, eklenen bir ade6 + muhabir kullanılan Şeması 1 dış tekrar (otr) bölgesi¹⁰. Ade6 + muhabir vahşi Türü koşulunu susturdu Yani bünye heterochromatin bu bölge¹¹, oluşturulur; Bu kırmızı kolonileri¹⁰tarafından belirtilir. Şeması, bünye heterochromatin oynattığını bir mutasyon hangi beyaz koloniler görüntülenir ade6 + muhabir ifade sağlayacaktır.

Protokol

1. medya hazırlanması

1. Maya Özü Takviyeler ile (Evet), Evet adenin (Evet düşük Ade), Pombe Glutamat orta (PMG¹²) ve PMG adenin (PMG-Ade) Tablo 1' de açıklandığı gibi bileşenleri karıştırarak hazırlayın. Evet-Ade (Ade düşük) ve PMG-Ade plakaları, aynı bileşenleri hakkına sahiptir, ancak adenin ikinci gelen atlanır.
   1. Aşağıdaki tuz (50 x) hisse senedi kullanın: 52.5 g/L MgCl₂·6H₂O, 2 g/L CaCl₂·2H₂O, 50 g/L KCl,₄ ' te distile su böylece 2 g/L Na₂. Filtre 0,22-µm gözenek boyutu filtre sterilize ve 4 ° C'de depolayın
   2. Aşağıdaki vitamini kullanmak (1, 000 x) hisse senedi: 1 g/L pantothenate, 10 g/L nikotinik asit, 10 g/L inositol, 10 mg/L biotin distile su içinde. Filtre 0,22-µm gözenek boyutu filtre sterilize ve 4 ° C'de depolayın
   3. Aşağıdaki maden kullanın (10, 000 x) hisse senedi: 5 g/L Borik asit, 4 g/L MnSO₄, 4 g/L ZnSO₄·7H₂O, 2 g/L FeCl₂·4H₂O, 0.4 g/L MoO₃, 1 g/L KI, 0.4 g/M CuSO₄·5H₂O , 10 g/L sitrik asit distile su içinde. Filtre 0,22-µm gözenek boyutu filtre sterilize ve 4 ° C'de depolayın
      Not: Evet sıvı orta agar ihmal olarak yapılabilir.
2. Otoklav orta ve 60 ° C 200 rpm hızında bir heyecan çizgiyle karıştırma sırasında aşağıda için serin.
3. Evet + G418 (geneticin) plakalar için 1 mL/L G418 hisse senedi çözüm Evet Orta olarak ekleyin.
   1. Aşağıdaki G418 kullanın (1, 000 x) hisse senedi: 100 mg/mL G418 distile su içinde. Filtre sterilize 0,22-µm gözenek boyutu filtre, 1,5 mL santrifüj tüpleri ve mağaza aliquot-20 ° C'de kullanma
4. Başka bir 5-10 dk ve aliquot için medya içine 90 mm Petri yemekler (1 litre kabaca 40 Petri yemekler için orta aliquots. ilave edin Plakayı 4 ° C'de depolayın

2. klonlama rpt4 + ve onun 5' / 3' UTRs

1. PCR astar p1 ve p2 ile gerçekleştirmek (şekil 1A) fisyon kullanarak şablonu olarak toplam hacmi 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzim reaksiyon arabellek x 1), genomik DNA (gDNA) Maya ve Tablo 2 ' de açıklanan tepki döngüleri uygulama yükseltmek 3,315 Bankası rpt4 + ve onun 5' / 3' UTRs oluşan çift (bp) parçası. Bir arıtma seti¹³ (şekil 1A) üretici tarafından belirtilen şekilde kullanarak PCR ürünü arındırmak.
2. PBlueScript KS(-) vektör¹⁴ ve 16-18 için bir su banyosunda 37 ° C'de rpt4 + ile onun 5' / 3' UTRs BamH1 ve Xho1 ile 20 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzim, 1 x sindirim arabellek) toplam hacmine içeren güçlendirilmiş DNA parçası sindirmek h (şekil 1B).
3. Jel arındırmak sindirilir vektör (% 1.2 özel jel) ve DNA eklemek TAE-esaslı özel Jel Elektroforez (100 V, 1 h) gerçekleştirme, DNA bantları istenilen boyutlarda bilincin ve jel ekstraksiyon kiti¹⁵ile DNA izole.
4. Vektör ve DNA ekle 50-100 ng vektörünün DNA ' sını içeren 20 µL ligasyonu tepki gerçekleştirerek T4 DNA ligaz kullanarak ligate bir ~ Ekle DNA, 400 U T4 DNA ligaz ve 1 tüp ligasyonu arabellek x 3 kat molar fazlalığı. Bu karışım için 16-18 h 18 ° C'de kuluçkaya.
5. Isı şok 70 için uygulayarak ve birleştirilmiş DNA E. coli DH5α 100 µL dönüştürmek 42 ° C'de s 1 mL LB ekleyin ve kurtarma için 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya. Santrifüjü (13,800 x g) gerçekleştirmek, tüm dönüştürülmüş E. coli LB-Ampisilin (LA) Tabaklarda hücreleri ve 16 h için 37 ° C'de kuluçkaya süpernatant, plaka atın.
6. 4-8 kolonileri kürdan ile almak ve gece 3 mL LA orta 37 ° C'de büyür.
7. Üreticinin protokole göre kullanılan bir plazmid arıtma kiti ile¹⁶ plazmid ayırmak ve izole plazmid, 5 U her restriksiyon enzimi (BamH1 ve / 5 µL ile analitik restriksiyon enzimi sindirim gerçekleştirmek Xho1) ve 1 x kısıtlama arabellek. 37 ° C 3 h. aday plazmid sıralama tarafından klonlama Onayla için bir su banyosunda tepki karisimin kuluçkaya.

3. giriş sessiz mutasyon (Xho1 kısıtlama Site)

1. Aksi takdirde tamamlayıcı sırayla istenen mutasyon içeren 33-bp astar (p3 ve p4) çifti Tasarla.
2. Yüksek sadakat polimeraz¹⁷ ile (şekil 1 c) toplam hacmi çok 25 µL PCR gerçekleştirmek (10 ng klonlanmış plazmid, 10 pmol astar mix, 2 U enzim, 1 x reaksiyon arabellek 2 µL) Bisiklete binme parametrelerini kullanarak listelenen Tablo 3' te.
3. Ben bir su 37 ° C'de 20 µL (20 U enzim, 1 x sindirim arabellek) toplam hacmine 1 s banyo Dpnile şablon plazmid sindirmek.
4. Dönüşümü, yaymak, ayırma ve adımları 2.5-2.7 açıklandığı gibi sessiz mutasyon içeren Plazmid dizi.
   Not: Sessiz mutasyon aynı zamanda birden fazla DNA parçalarının tek tepki¹⁸katılmak için izin veren bir klonlama yöntemi kullanarak tanıttı olabilir.

4. rasgele Mutagenesis rpt4 + hataya PCR tarafından

1. Hataya PCR, plazmid sessiz mutasyon (Xho1 sitesi) ile kullanarak gerçekleştirmek şablonu, astar p5 ve p6, toplam hacmi 50 µL (Adım 4.1.1, 10 pmol astar mix, 2.5 U enzim, 1 x reaksiyon arabellek 2 µL tanımlanmış şablon miktarı) olarak , ve yüksek bir hata üretmek için tasarlanmış özel bir polimeraz oranı¹⁹ (şekil 1 d). PCR Tablo 2' de açıklandığı gibi gerçekleştirin.
   1. 4-5 µg şablon plazmid, mutasyon sıklığı 1 bp/KB (kilobaz) kontrol etmek için kullanın.
      Not: Bir yüksek konsantrasyon (> 500 ng/µL) bir mini hazırlık seti²⁰kullanarak elde edilebilir, plazmid gereklidir.
2. Jel Elektroforez, PCR ürünü 2670 BP (% 1.2 özel jel) onaylamak için kullanın. Jel 2.5 adımda anlatıldığı gibi bu PCR ürünü arındırmak.

5. füzyon PCR parçaları (KAN, 3' UTR) hazırlanması

1. PFA6a-KANMX6²¹ şablonu, astar p7 ve p8 kullanarak PCR gerçekleştirmek ve koşulları işaretleyici (KAN) parçası elde etmek için Tablo 4'te listelenmiş. Jel 2.5 (şekil 1E) adımda anlatıldığı gibi elde edilen 1.480-bp parçası arındırmak.
   1. Hedef için mutasyon ve kodlayıcı bölge onun bitişik gen gen kodonu fazla 500 tarafından ayrılmış Eğer kontrol kan basıncı. Bu bölgede 500'den az olduğunda endojen Sonlandırıcı kullanılamaz bp; daha doğrusu, ADH Sonlandırıcı endojen Sonlandırıcı yerine kullanılmalıdır. ADH Sonlandırıcı kullanmak için gereken protokol değişiklikleri Tablo 5' te sunulmaktadır.
      Not: PFA6a-3HA-KANMX6 plazmid mevcuttur, ADH Sonlandırıcı endojen Sonlandırıcı yerine kullanıldığında bu değişiklikler yalnızca geçerli.
2. PCR klonlanmış rpt4 +ile gerçekleştirmek-vektör olarak şablon ve astar p9 ve toplam hacmi 50 µL p10 içeren (20 ng klonlanmış plazmid, 10 pmol astar mix, 2 U enzim, 1 x reaksiyon arabellek 2 µL), Tablo 6' da sunulan koşul kullanma. Jel (şekil 1E) elde edilen 506-bp 3' UTR parçası arındırmak.

6. nesil Fusion PCR (şekil 1E) dönüşümü yapı

1. 3 parçaları (mutagenized rpt4 +, KAN ve 3' UTR) 50 ng/µL, hazır olun.
2. PCR üç parçaları astar p11 ve p12, kullanarak tablo 7'de açıklandığı gibi füzyon gerçekleştirin. (Fusion PCR için bir değişiklik orijinal protokolü²²protokoldür.) Önemli 4,398-bp PCR ürünü arındırmak.
   1. Rpt4 +kullanın: KAN:3'UTR parçaları 1 oranında: 3:1 en iyi sonuçlar için.
      Not: INSERT DNA'ın toplam tutarı 500 geçmemelidir ng. Önerilen miktarı rpt4 +: KAN:3'UTR 50 ng:150 ng:50 ng olduğunu. Diğer üç mutasyona uğramış her Bankası tüm olası birleşimlerini için hesap olacaktır Maya kolonileri az sayıda 1,600 x 3 = 4800 bu yüzden yaklaşık 1,6 kb, mutagenized bölgesidir koloniler. Bir dönüştürme tepki genellikle 400-500 kolonileri verimleri çünkü değer en az 10 reaksiyonlar füzyon PCR oluşturmak gereklidir. 10 kat yalnızca tepki tutarı (Yani, PCR tüpleri sayısı) artırarak bu ihtiyacı karşılanabilir.

7. fisyon mayası elektroporasyon (şekil 1F) tarafından dönüşümün

1. Maya Evet orta doygunluk için 10 ml den fazla 16 h için kuluçka tarafından aşılamak.
2. 600 optik bir yoğunluk hücrelere seyreltik nm (OD₆₀₀) 0,2 200 ml Evet orta ve 30 ° C'de 5-6 h, OD₆₀₀ için sallayarak ile kuluçkaya = 0,6 - 0,8.
3. OD₆₀₀ hücrelere konsantre = 30, dört 50 mL konik tüpler için dağıtmak ve chill buz 10 dk için.
4. 4 ° C'de 3 dk aralıklarla 1.050 x g de gerçekleştirerek hücreleri hasat Tüpler ve 10 electro-cuvettes Buza koyun. 7.3-7,8 adımları buz üzerinde gerçekleştirin.
5. Süpernatant atın ve 1, 2 M sorbitol 15 mL ekleyin. Hücreleri resuspend tüplere hafifçe sallayın.
6. Hücreleri vasıl 1050 x g 4 ° C'de 3 dk santrifüj kapasitesi
7. 7.4 ve 7,5 adımları yineleyin. Süpernatant atmak. 1, 2 M sorbitol 500 µL her tüp eklemek, hücreleri resuspend ve bir 15 ml konik tüp içinde hücrelerin tümünü toplamak.
8. 1, 2 M sorbitol eklemek 2.4 mL (OD₆₀₀ = 0.2 mL başına 10). Tüp buz üzerinde tutun.
9. 200 µL (onlar tam olarak askıya emin olun) sorbitol askıya hücre eklemek için füzyon PCR içeren bir EP tüp oluşturun, iyice karıştırın ve örnek bir elektro-küvet için transfer.
10. Electroporate aşağıdaki seçenekleri içeren hücreleri: Mantarlar, ShS (2.00kV, 1 darbe).
11. Her elektro-küvet için 800 µL toplam hacmi 1.2 M sorbitol 600 µL ekleyin ve sonra hücreleri dört Evet plakaları (200 µL/plaka) yayıldı. On elektro-cuvettes 40'a Evet plakaları dağıtmak olacaktır.
12. Plakayı 24 h 30 ° C'de kuluçkaya.
13. Evet + G418 için yineleme kaplama gerçekleştirmek ve tabak 30 ° C'de 3 gün kuluçkaya.

8. seçimi, Heterochromatin kararsız hale mutantlar ve yanlış pozitif olarak kontrol

1. Her Evet + G418 plaka için yineleme kaplama Evet-Ade (Ade düşük) ve PMG-Ade (Hayır Ade) plakalar için gerçekleştirin. Bazı Evet-Ade plakaları kolonileri kırmızı rengi (şekil 1G) göstermek kadar yineleme tabak 30 ° C'de 1-2 gün kuluçkaya.
2. Evet-Ade ve PMG-Ade plakaları ve pembe veya beyaz Evet-Ade plaka üzerinde göstermek ve ayrıca PMG-Ade plaka üzerinde büyümeye seçme hücreleri karşılaştırın. Yanlış pozitif (KAN kaset genom başka bir yerindeki bir sigara hedef sitede entegre yansıtanmesela ) oldukları gibi kolonileri PMG-Ade, büyüme olmadan seçin.
3. Her koloni yaklaşık 1 x 10⁵ hücreleri seçin ve 2,5 mg/mL zymolyase 100 T en az 30 dk. kullanım 1 µL PCR (şekil 1 H) koloni için başlangıç şablon olarak gerçekleştirmek için bu çözüm için 37 ° C'de içeren SPZ çözüm 10 µL kuluçkaya.
   1. SPZ (50 mL) 2 M sorbitol 30 mL, 1 M Na₂HPO₄4,05 mL, 0.95 mL NaH₂PO₄ ve 15 mL distile su (son pH, 7,5) karıştırılarak olun. Örnekleri (5 mL) zymolyase ile desteklenmiş ve 500 µL aliquots-20 ° c kadar kullanmak saklanır.
4. Sonuçlarını + koloni PCR görselleştirmek için Jel Elektroforez (% 1.2 özel jel, 180V, 20 dk) gerçekleştirin. Uygun Boyut grupları PCR sergi ve her reaksiyon ürünü Xhoile 5 µL sindirmek reaksiyonlar seçin ben (4 U enzim, 1 x sindirim tampon, 37 ° C su banyosu, 1 h) yanlış pozitif (Resim 1 H) ekran için.
5. XhoI özetleri (% 1.2 özel jel, 180 V, 20 dk) görselleştirmek için Jel Elektroforez gerçekleştirin. PCR ürünleri XhoItarafından kesilir ve bunları Evet + G418 tabak (şekil 1I) yama kolonileri işaretleyin.
6. GDNA füzyon Maya hücreleri izole ve PCR ürünleri²³nın gerçekleştirin. Elde edilen sıra mutasyonlar (şekil 1I) tanımlamak için vahşi-tipi kol ile karşılaştırın.
7. Doğrudan mutation(s) vahşi tipi hücrelere mutant hücreleri²³PCR tarafından güçlendirilmiş füzyon yapıları ile dönüştürerek yeniden tanıtmak. Lekelenme fenotip yeni yapılan mutant hücrelerdeki (şekil 1J) onaylamak için kullanın.
   1. Füzyon dönüşümü yapı kolay güçlendirilmiş PCR tarafından astar p1 ve p10 ile genomik DNA mutant toplam hacmi 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzim reaksiyon arabellek x 1), şablon olarak kullanarak ve Tablo 2 açıklanan tepki döngüleri uygulama . Yapı dönüşümü 7.1-7,13 adımları izleyerek yapılabilir.

Sonuçlar

Şekil 1 ' de açıklanan yordamları izleyerek Edinsel Rpt4 mutantlar koloniler renklerinin değerlendirmek tarafından çözümlenebilir. Kolonilerin renkleri şeklinde ilermek cep numarasını Şekil 2' deki ilgili plakalar üzerine lekeli. Heterochromatin bölge eklenen ade6 + muhabir vahşi türü susturdu ve kırmızı kolonileri Evet-Ade tabak içinde gösterir. Bir kez heterochromatin dengeleri bozdu ve ade6 ...

Tartışmalar

Rastgele mutagenesis hataya PCR ile belirli bir bölgede mutantların farklı bir havuz oluşturmak için güçlü bir araçtır. Bu teknik özellikle belirli bir koşulda bir proteinin işlevini değerlendirmek için arama çalışmaları için yararlıdır. Örneğin, biz burada kullanılan hataya PCR 19S proteasome alt birimi, Rpt4, heterochromatin bakım işlevini değerlendirmek için. Değişen tarafından bölge tarafından hataya PCR hedef ve tarama Koşulları ayarlama, faiz ve ekran için istenen fenotip genomi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Media
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-10KG
Yeast extract	BD Biosciences	212720
L-Leucine	JUNSEI	87070-0310
Adenine sulfate	ACR	16363-0250
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
L-Histidine	Sigma-Aldrich	H8125
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1.05108.0050
NaCl	JUNSEI	19015-0350
MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	63140
CaCl2	Sigma-Aldrich	12095
Potassium phthalate	Sigma-Aldrich	P6758-500g
Inositol	Sigma-Aldrich	I7508-50G
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B6768-1KG
MnSO4	Sigma-Aldrich	M7634-500G
ZnSO4•7H2O	JUNSEI	83060-031
FeCl2•4H2O	KANTO	CB8943686
Sodium molybdate dihydrate	YAKURI	31621
KI	JUNSEI	80090-0301
CuSO4•5H2O	YAKURI	09605
D-myo-inositol	MP biomedicals	102052
Pantothenate	YAKURI	26003
Nicotinic Acid	Sigma-Aldrich	N4126-500G
(NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Agarose	Biobasic	D0012
G418, geneticin	LPS	G41805
2. Enzyme reactions
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase	Aglient	600380	For site-directed mutagenesis
GeneMorphII Random mutagenesis Kit	Aglient	200500	For error-prone PCR
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Fisher	F-530L	For fusion PCR
Ex Taq DNA Polymerase	Takara	RR001b	For general PCR
BamH1	New England BioLabs	R0136S
Xho1	New England BioLabs	R0146S
Dpn1	New England BioLabs	R0176S
3. Equipment
Velveteen square, black	VWR	89033-116	For replica
Replica-plating tool	VWR	25395-380	For replica
MicroPulser Electroporator	Biorad	1652100	For fission yeast transformation
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	Biorad	1652086	For fission yeast transformation
Thermal Cycler	Bioer	BYQ6078	For fusion PCR ramp reaction