نموذج 3D أورجانوتيبيك الميلانوما جلد كروي

Summary

هنا، نقدم بروتوكولا لإنشاء أورجانوتيبيك 3D الميلانوما جلد كروي نموذج الذي يلخص كل بنية وتعقيد متعددة الخلايا من الجهاز/ورم في الجسم الحي ولكن وفي الوقت نفسه يلائم المنهجية التجريبية التدخل.

Abstract

التحول الخبيث من الخلايا الصباغية، الخلايا الصبغية لجلد الإنسان، يسبب تشكيل لسرطان الجلد، سرطان عدوانية شديدة مع زيادة إمكانات المنتشر. في الآونة الأخيرة، مونو-تشيموثيرابيس مواصلة تحسين بسرطان الجلد تركيبة معينة العلاج بمثبطات كيناز المستهدفة. سرطان الجلد المنتشر لا يزال مرض يهدد الحياة نظراً لأن الأورام يحمل المقاومة الأولية أو تطوير المقاومة للعلاجات الرواية، وبالتالي استعادة القدرات الورمية. ضروري من أجل تحسين نجاح العلاج من سرطان الجلد الخبيث، تحديد الآليات الجزيئية التي تمنح المقاومة ضد نهج العلاج التقليدي؛ ومع ذلك، فإنه يتطلب نماذج مبتكرة الخلوية في المختبر . هنا، نحن نقدم في المختبر أورجانوتيبيك ثلاثية الأبعاد (3D) سرطان الجلد كروي نموذجا يمكن تصور البنية في فيفو الميلانوما الخبيثة وقد تضمن أفكاراً جديدة في داخل الأورام فضلا عن التفاعلات المضيف الورم. النموذج يتضمن أرقام محددة من الماغنيسيوم الميلانوما ناضجة والمتفاوتة في نموذج تعمير 3D جلد الإنسان كامل تتألف من خلايا الجلد الأولية. مركز التكوين والتمايز الخلوي الماغنيسيوم الميلانوما جزءا لا يتجزأ مشابهة للواحدة من الميلانوما الجلدية ورم خبيث في فيفو. استخدام نموذج كروي سرطان الجلد أورجانوتيبيك هذا دواء فحص منصة دعم تحديد المستجيبين لتحديد مجموعة من طرق العلاج، بينما تدخر عبء العلاج غير الضروري لغير المستجيبين، مما يؤدي إلى زيادة الاستفادة من التدخلات العلاجية.

Introduction

جلد الإنسان يتكون من اثنين من الأجزاء الأخرى المتميزة التي تؤدي وظائف مختلفة في حماية الجسم من الآثار الضارة بالبيئة¹. حجرة الجلد السفلي يتكون من النسيج الضام الليفي مطاطا. وهو يتألف من ألياف الكولاجين والايلاستين فضفاضة متصلة توليفها من قبل الخلايا الليفية، تخدم وظيفة حاجز ميكانيكية. الأدمة مفصولة من البشرة العليا الصفيحة القاعدية التي تنتج كمصفوفة خارج الخلية بسبب اتصال مستمر بين المقصورات الجلد على حد سواء. وعلى النقيض من باطن الجلد، البشرة ظهارة الحرشفية الذي يتكون أساسا من الخلايا الكيراتينيه ويمكن أن تكون متباينة في أربع طبقات. باسل الطبقة يتكون من غير متمايزة الكيراتينيه القاعدية التي تنبثق باستمرار من خلايا الجلد السلف تساوت خلال مراحل أنواع الطبقة و الطبقة الحبيبية في الطبقة القرنية حماية الجسم من الجفاف والالتهابات². الخلايا الصباغية هي الانحياز في الغشاء القاعدي، والتواصل من خلال ملحقات الجذعية مع الخلايا الكيراتينيه متعددة. وهي تنتج صبغة الميلانين لحماية أنسجة الجلد من الآثار الضارة للأشعة فوق البنفسجية، مثل شيخوخة الجلد والكبت المناعي والتهاب واستحثاث سرطان الجلد غير الميلانوما. الأشعة فوق البنفسجية الإشعاعات مساهمة لتحويل الخلايا الصباغية إلى الميلانوما الخبيثة، غير ما زال قيد المناقشة³.

تطوير الميلانوما متباينة في مراحل تطور الورم المختلفة، وتتميز ببعض التغيرات الوراثية والسمات النسجية⁴. أنها تنشأ أما حيثياته ، أو من وحمة الفطرية أو المكتسبة بسبب محلي زيادة انتشار الخلايا الصباغية تسبب نيوبلسا حميدة. تحويل هذه الآفة السلائف في الأنسجة ديسبلاستيك تم التعديل الهيكلي التي تحتوي على خلايا أتيبيك، التي قد تستمر إلى المرحلة الخبيثة الأولى، في مرحلة النمو شعاعي (RGP). وتتسم هذه المرحلة المبكرة من تطور الورم بالخلايا إشعاعيا تنتشر داخل البشرة، تظهر بعض الخلايا الغازية محلياً داخل الأدمة الحليمية. أثناء سرطان الجلد (VGP) المرحلة اللاحقة من النمو الرأسي إظهار الخلايا فعلا النمط الظاهري المنتشر والغازية باختراق الصفيحة القاعدية لاختراق أعمق أجزاء الأدمة، فضلا عن النسيج تحت الجلد⁵. وأخيراً، سرطان الجلد المنتشر (مم) يمثل المرحلة التقدم الأكثر عدوانية مع خلايا المنتشر عناصره ينتشر في جميع أنحاء نظام الدم والليمفاوية لغزو ديستالي أجهزة مثل الكبد والرئة والدماغ⁶.

حتى الآن، لا يزال التشخيص المبكر تليها الجراحة العلاج الأكثر فاعلية لسرطان الجلد الخبيث. غير أن يظل التشخيص للمرضى الذين يعانون من ورم خبيث البعيدة،⁷، لا سيما الفقيرة نظراً لنظم العلاج الكيميائي الكلاسيكي يضفي إلا القليل بقاء المنفعة^8،9. ومع ذلك، بعد عقود من الركود، التقدم الذي أحرز مؤخرا في العلاجات المستهدفة قد تحسنا التشخيص لسرطان الجلد الخبيث.

التقلبات الكبرى mitogen تنشيط مسارين ورأس-سلاح الجو الملكي البريطاني--مجاهدي خلق-إيرك ومسارات الإشارات PI3K-عكة-فتن، يقدم الدوافع الرئيسية لتطور سرطان الجلد، خصوصا عند تنشيط مؤثرا الطفرات نقطة من BRAFV600 وبروتو و يتم تجاوزها الحالي¹⁰. وبناء على ذلك، وعدت اختراع المستهدفة kinase مثبطات فائدة علاجية للمرضى الذين يعانون من سرطان الجلد المنتشر. العديد من التجارب السريرية التي أجريت على هذه النقطة لم تحقق فائدة كبيرة للمرضى الذين يعانون من سرطان الجلد المنتشر. ما يقرب من جميع الردود جزئية، مع يتدنى مرضى تظهر المقاومة الأولية. وعلاوة على ذلك، لوحظ اقتناء الثانوي المقاومة مما أدى إلى انتكاسة في أغلبية المرضى^11،12.

يصبح من الواضح أن تحليل حالة الطفرة وحدها ليست كافية لوضع استراتيجية علاجية أقوى. أدوات تشخيصية جديدة سريعة وموثوق بها ضرورية لتسجيل بشكل منهجي وتحليل مدى استجابة الخلايا السرطانية الفردية. قد تم الحصول على الغالبية العظمى من البيانات المتاحة حاليا بشأن سرطان الجلد البشري من الثقافات الخلية الميلانوما ثنائي الأبعاد (2D). الخلايا السرطانية، مع ذلك، نمت في 3D يسمح الحديث المتبادل بين الخلايا بين السرطان متمايزة الجمهرات الفرعية الخلية، وكذلك بين الخلايا السرطانية والأنسجة غير حولت المضيفة المحيطة. ولذلك، سيكون من الأفضل لإعادة بناء البيئة ثلاثية الأبعاد التي وضعت سرطان الجلد، لاستخدامها كفحص السريري النموذجي^13،14.

Protocol

تم إجراء جميع الأنسجة البشرية العمل باستخدام بروتوكولات المؤسسية المعتمدة.

1-الفصل بين الأدمة والبشرة من الجلد البشري (القلفة الأحداث من الختان)

1. ضع القلفة (عادة 1-2 سم²) في طبق ثقافة خلية معقمة غير لاصقة (Ø 10 سم) وتغطية ذلك مع 10-12 مل من المحلول الملحي مخزنة فوسفات⁺ (برنامج تلفزيوني، 0.5 مم مجكل₂، كاكل 0.9 مم₂، الرقم الهيدروجيني 7.2 = برنامج تلفزيوني⁺). قم بإزالة جميع الأنسجة (الدهنية) الزائدة باستخدام مشرط معقم والملقط.
2. قص الجلد إلى قطع 3 مم × 5 مم وغسلها ببرنامج تلفزيوني، ونقلها إلى طبق ثقافة خلية معقمة غير لاصقة (Ø 6 سم). وتغطي قطع الأنسجة مع 5-7 مل ديسباسي الحل (2 U/mL في برنامج تلفزيوني). ختم الطبق ثقافة الخلية مع الفيلم البارافين واحتضانها ح 16 عند 4 درجة مئوية.
3. سحب البشرة من الجزء الجلدي مع ملقط معقم اثنين. نقل قطع الأنسجة تشريح للفرد غير لاصقة خلية ثقافة الأطباق (Ø 6 سم) وتغطي كل منها مع برنامج تلفزيوني⁺.

2-عزل الخلايا الكيراتينيه الأولية من البشرة

1. بعناية إزالة برنامج تلفزيوني⁺ من طبق ثقافة الخلية باستخدام ماصة باستور ويغسل قطع أنسجة البشرة (القسم 1.3) مع برنامج تلفزيوني. قطع البشرة إلى أجزاء أصغر (1 مم²) وجمعها في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. إضافة 10 مل 1 × التربسين-يدتا (يسخن إلى 37 درجة مئوية)، واحتضان لمدة 5 دقائق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. دوامة تعليق الأنسجة كل 2 دقيقة.
2. وقف رد الفعل الأنزيمي بإضافة 1 مل مصل العجل الجنين (FCS). ريسوسبيند الخلايا من بيبيتينج صعودا وهبوطاً مع 10 مل ماصة بلاستيكية لدقيقة 4 في محاولة لتجنب فقاعات ورغوة تشكيل.
3. بيبيت تعليق خلية في خلية مصفاة (المسام حجم 100 ميكرومتر)، وضعت على رأس أنبوب مخروطي طازجة 50 مل، وشطف x 3 مع 5 مل برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الخلايا في ز 200 x للحد الأدنى 5 ريسوسبيند بيليه خلية في المتوسط الثقافة 2-6 مل المتضمن مع الجنتامايسين 1% (v/v). تحديد عدد الخلايا يدوياً بواسطة عد الخلايا في خلايا 6 × 10⁵ هيموسيتوميتير والبذور في قارورة ثقافة الخليوي T75.

3-زراعة الخلايا الكيراتينيه الأولية

1. احتضان الكيراتينيه الابتدائي معزول في الخطوة 2.3 في حاضنة خلية على 37 درجة مئوية و 5% CO₂ في المتوسط keratinocyte دون سفح المنحدر القاري، إلى 50-70% كونفلوينسي.
2. لمرور الخلايا الكيراتينيه بعناية إزالة المتوسطة، وإضافة 5 مل برنامج تلفزيوني-يدتا، واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. تحقق إذا كانت الخلايا قد بدأت فصل من قارورة الثقافة تحت مجهر خفيفة (4 X التكبير: الخلايا تظهر مستدير الزوايا بل هي لا تزال تعلق!). إذا لم يكن كذلك، استبدال القديم برنامج تلفزيوني-يدتا يدتا برنامج تلفزيوني جديد وإعادة احتضانها لآخر 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
3. إضافة 5 مل 1 x التربسين-أدتا إلى خلايا دائرية لا تزال مغطاة 10 مل برنامج تلفزيوني-يدتا وإعادة احتضانها لهم لمدة 1-3 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وقف رد الفعل الأنزيمي بإضافة 1 مل FCS وجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. الطرد المركزي الخلايا في 200 غ س لمدة 5 دقائق، ريسوسبيند بيليه في المتوسط keratinocyte والبذور 6 × 10⁵ خلايا في T75 خلية ثقافة قارورة جديدة.
   ملاحظة: لتوليد يعيد بناء البشرة أورجانوتيبيك، الكيراتينيه الأولية يجب استخدام لا بعد مرور 3-4.

4-عزل الخلايا الليفية الأولية من الأدمة

1. قطع الأنسجة الجلدية (القسم 1.3) إلى قطع أصغر حجماً (1 مم²) وتحويلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل. إضافة 10 مل كولاجيناز-الحل (5 U/mL في برنامج تلفزيوني⁺) واحتضانها لمدة 45 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. الطرد المركزي الخليط من قطع الأنسجة والخلايا في 200 غ س لمدة 5 دقائق.
2. أغسل بيليه خلية مرتين مع 10 مل دميم تحتوي على 4.5 غرام/لتر جلوكوز ولام الجلوتامين، ولكن دون بيروفات L. وأخيراً ريسوسبيند قطع الأنسجة في 2 مل دميم الذي يحتوي على 1% (v/v) مع الجنتامايسين والسفح 10%. تحويلها إلى قارورة ثقافة الخليوي T25 واحتضانها لهم في حاضنة خلية على 37 درجة مئوية و 5% CO₂ بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: حجم صغير يسمح الليفية لترحيل من الأنسجة-تحت الأنقاض ويجبرهم على إرفاق قارورة الثقافة.
3. في صباح اليوم التالي، إضافة آخر 6 مل دميم/مع الجنتامايسين/FCS واحتضان لمدة 2-3 أيام عند 37 درجة مئوية حتى وصلت إلى الخلايا كونفلوينسي 80-90%.

5-زراعة الخلايا الليفية الأولية

1. للمرور الخلايا الليفية وإزالة المتوسطة ويغسل خلايا ملتصقة مع برنامج تلفزيوني. إضافة مل 5 1 × يدتا التربسين واحتضان لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية.
2. وقف رد الفعل الأنزيمي بإضافة 5 مل دميم/FCS وجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. الطرد المركزي الخلايا في 200 غ س لمدة 5 دقائق، ريسوسبيند بيليه في المتوسط دميم، والبذور 6 × 10⁵ خلايا في T75 خلية ثقافة قارورة جديدة.
   ملاحظة: لتوليد يعيد بناء البشرة أورجانوتيبيك، الخلايا الليفية الأولية يجب استخدام لا بعد مرور 4-6.

6-جيل من سرطان الجلد 3D الماغنيسيوم عبر أسلوب قطره معلقة

1. الثقافة الميلانوما الخلايا (مثلاً، 451، لو، أو أي خط خلية سرطان الجلد من الفائدة) وفقا للبروتوكولات العامة، استخدام ربمي الذي يحتوي على 10% FCS¹⁵.
   1. لتوليد سرطان الجلد الماغنيسيوم من حجم ونوعية مماثلة، يغسل خلايا سرطان الجلد في برنامج تلفزيوني، إضافة 5 مل من 1 x يدتا التربسين في برنامج تلفزيوني للخلايا في T175 خلية قارورة الثقافة، واحتضان لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). تحييد التربسين بإضافة 5 مل RPMI/10% FCS. حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في ز 200 x 5 كحد أدنى لإعادة تعليق بيليه الخلية في ربمي/FCS بتركيز نهائي من خلايا/مل 10,000 حسبما يقرره عد في هيموسيتوميتير.
2. بقعة 40 × 25 ميليلتر (= خلايا 250) تعليق خلية على السطح الداخلي لغطاء صحن الثقافة معقمة غير لاصقة الخلية (Ø 10 سم) ماصة إلكترونية المتعددة باستخدام. بحركة سريعة ولكنها ناعمة، يستدير الغطاء ووضعه على الطبق الثقافة كل منهما الخلية التي تحتوي على 5 مل برنامج تلفزيوني.
   1. ثقافة "أطباق قطره معلقة" في حاضنة خلية على 37 درجة مئوية و 5% CO₂ ل 10-14 يوما، تبعاً لنوع الخلية المستخدمة.
      ملاحظة: الخلايا مرحلة النمو ملم عادة تنمو بشكل أسرع وتشكل الماغنيسيوم أكثر صلابة في إسقاط معلقة بالمقارنة مع خلايا الميلانوما المستمدة من RGP أو VGP. للتقييم الفردي، ومراقبة النمو كروي تحت منظار أو تحت مجهر خفيفة (4 X التكبير). عادة، تصبح الماغنيسيوم يمكن اكتشافها بعد 48 ساعة تحت منظار أو تحت مجهر خفيفة (4 X التكبير). بعد 10-14 يوما، تكون مرئية دون أي جهاز التكبير.
3. 5 أيام بعد اكتشاف قطره الأولية، إضافة 10 ميليلتر من جديد RPMI/10% FCS المتوسطة لكل قطره. وفي وقت لاحق، تبادل 10 ميليلتر في المتوسط كل يوم. استخدام عبوة الإلكترونية مفيدة جداً في هذه الخطوة.
4. اعتماداً على نوع الخلية، حصاد الماغنيسيوم (انظر المادة 10 للحصول على تفاصيل) بعد 10-15 يوما قبل الشطف بلطف لهم قبالة غطاء صحن ثقافة الخلية مع برنامج تلفزيوني. جمع لهم في طبق ثقافة جديدة غير لاصقة خلية.
   ملاحظة: فترة زراعة تعتمد على مرحلة نمو ورم خلايا سرطان الجلد عند أنها استمدت في البداية، مثلاً، الماغنيسيوم المستمدة من الخلايا 451-لو تنمو إلى حوالي 500 ميكرومتر في القطر في غضون 12 يوما لاستزراع في إسقاط معلقة¹⁵ .

7-جيل المقصورة الجلد من الجلد كامل أورجانوتيبيك يعيد

1. إنشاء نماذج الجلد باستخدام خلية 24-بئر microporous غشاء إدراجات (المسام حجم 8 ميكرومتر) توضع في لوحات 24-جيدا.
   ملاحظة: تأكد من عدم استخدام معلقة ولكن الدائمة إدراج، نظراً لأنها سوف توضع في لوحة 6-جيدا لزراعة الهواء السائل في مرحلة لاحقة.
2. إعداد الحل (GNL) تحييد جل¹⁵، فضلا عن وسائط الإعلام الثقافة المشار إليها ملم ونمو غشائي وسائط الإعلام (EGM)^16،17. لمنع تخثر الدم، تخزين الكولاجين النوع الأول (عادة ما تكون من ذيل الفئران، 3.5-4 مغ/مل في حمض الخليك N 0.02) على الجليد حتى الاستخدام، لأنه يبدأ بهلام في الرايت
3. إعادة تعليق 1 × 10⁵ الليفية لإدراج في GNL ومزيج تعليق خلية بسرعة مع الكولاجين بنسبة 1:3 في وحدة تخزين نهائي من 500 ميليلتر/إدراج. إعمار المزيج بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً لتجنب تشكيل فقاعة فقاعات قد يؤثر على نوعية الجلد.
4. السماح للهلام الجلد الفردية تسوية بإبقائها دون المتوسط في RT لمدة 30 دقيقة في غطاء عقيمة. بعد ذلك تغطي كل جل مع دميم المحتوية على الجلوكوز 4.5 غرام/لتر، 1% ل الجلوتامين، FCS 10%، ودون L-بيروفات، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.

8-جيل حجرة البشرة من الجلد كامل أورجانوتيبيك يعيد

1. في اليوم التالي إزالة المتوسطة من المواد الهلامية الجلدي وحجته لهم مع وسائل الإعلام الغير عادية (FCS 10 ٪، 1 ٪ بينستريب، الجنتاميسين 10 ملغ/مل) ح 2 في 37 درجة مئوية. سحب المتوسطة والبذور 1 × 10⁵ الكيراتينيه حراكه في 100 ميليلتر EGM على رأس جل الجلد بعناية.
2. احتضان يعيد بناء ل 1.5 ح في 37 درجة مئوية للسماح للخلايا الكيراتينيه على التمسك بحجرة عن طريق الجلد.
   ملاحظة: خلال هذه الفترة الحضانة، سوف تبدأ المواد الهلامية ليتقلص بسبب الانكماش الناجم عن تنتجها الخلايا الليفية، وهكذا، جزئيا على الأقل فصل من الجدران إدراج.
3. تغطية مكافئات الجلد مع حوالي 800 ميليلتر EGM وعناية إزالة الجل المتبقي من الجدار إدراج مع تلميحه صغيرة ماصة (أبيض). الثقافة الجلد مكافئات غارقة في اجتماع فريق الخبراء لمدة 7 أيام في حاضنة خلية على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂، وتغيير في المتوسط كل يوم.
   ملاحظة: أثناء هذا الوقت مكافئات الجلد سوف تتقلص إلى حد كبير.

9. يعيد زراعة الهواء السائل من الجلد كامل أورجانوتيبيك

1. في يوم 8، إدراج نقل كل بئر فردية من لوحة 6-جيدا. فقط إضافة 1.2-1.4 مل متوسطة مم لكل بئر، حيث أن إعادة البناء البشرة تم توفيره مع متوسطة من أسفل البئر ولكن لا يغطي مع المتوسطة.
   ملاحظة: زراعة في واجهة الهواء السائل يسمح التكوين الطبقي لجزء البشرة وإنشاء كامل طبقة كورنيفيد (الطبقة القرنية).
2. خلال الأيام القادمة 10-17، تغيير في المتوسط كما ورد في القسم 9.1 كل يوم. وخلال هذه الفترة، إضافة المخدرات أو المنبهات الأخرى حسب الحاجة إلى المتوسط. بعناية إزالة إعادة البناء الجلد الكامل من إدراج غشاء microporous استخدام الملقط منحنى لمزيد من التحليل، مثلالتحليل المناعي (الشكل 1).

10-توليد نماذج سرطان الجلد أورجانوتيبيك الجلد كروي

1. لدمج الماغنيسيوم الميلانوما في المقصورة عن طريق الجلد ليعيد بناء البشرة الكامل أورجانوتيبيك، بعناية شطف الماغنيسيوم (بعد الخطوة 6، 4) قبالة غطاء الشنق إسقاط خلية الثقافة الطبق مع برنامج تلفزيوني. جمع 10-20 الماغنيسيوم/إدراج في صحن ثقافة معقمة غير لاصقة خلية. بعناية إزالة برنامج تلفزيوني المفرطة مع ماصة باستور.
2. نضح الماغنيسيوم في أصغر حجم ممكن لاجتماع فريق الخبراء. عند هذه النقطة مراعاة والعد الماغنيسيوم بالعين المجردة، دون أي مزيد من التكبير الجهاز. أن الماغنيسيوم 10-20 كل الجلد النموذجي/هلام، كما ورد في خطوة 10.1.
3. نقلها إلى وحدة التخزين المطلوبة من GNL التي تحتوي على الخلايا الليفية (خلال الخطوة 7، 3)، وخلط مع نوع الكولاجين أنا. من هذه الخطوة على المضي قدما كما هو موضح في المقاطع 7.3-9.1.
   ملاحظة: الماغنيسيوم الورم تصبح مرئية في جل الجلدية كالبقع البيضاء (الشكل 2)

النتائج

نجاح العلاج من سرطان الجلد ورم خبيث يمكن أن يتأثر عبر الحديث بين الخلايا السرطانية، وكذلك بين الورم والخلايا المضيفة عدم تحويلها. والغرض من وضع نماذج أورجانوتيبيك للسرطان في المختبر هو توفير نظم مناسبة الاختبار السريري أن الخص منظمة ثلاثية الأبعاد والتعقيد من سرطان الجلد البشري المجراة في. يسمح هذا دراسة الأثر العلاجي على الورم داخل بيئة أورجانوتيبيك والآثار السلبية على الأنسجة الأساسية المحيطة بالتوازي.

وضع نماذج أورجانوتيبيك أفضل على الجلد، نوعية الخلايا الأولية بالغة الأهمية. أنها مفيدة لاستخدام الأحداث الرئيسية الليفية والخلايا الكيراتينيه، لأنهم عادة أقل تختلف بالمقارنة مع خلايا الجلد الأولية الكبار. الأحداث الجلد خلايا يمكن أما أن تكون معزولة من القلفة الأحداث كما هو موضح في المقاطع البروتوكول 1-5، لكن يمكن أيضا شراؤها من الشركات كالخلايا الليفية الأولية قبل الولادة والخلايا الكيراتينيه. في حالة شراء، من الضروري أن خلايا النظام من الجهات المانحة المختلفة لتجنب النتائج الخاصة بالجهات المانحة، مثلاً، لحساسية المخدرات. يتم عرض على البروتوكول كله كنظام في الشكل 3.

ويتطلب مراقبة الجودة 3D كامل الجلد معادلات التحليل المناعي. ويمكن الحصول على انطباع أولى الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ من البارافين تضمين المقاطع (3 ميكرومتر). تحليل مفصل لنوعية البشرة التمايز وتشكيل الصفيحة القاعدية بين الأدمة والبشرة يتطلب التحليل المناعي باستخدام أجسام مضادة محددة ضد علامة التكوين الطبقي البشرة. يسمح هذا التمييز بين خلايا غير متمايزة، التكاثري عالية تقع بالقرب من الغشاء القاعدي وعالية متباينة والكيراتينيه خلايا في الطبقة القرنية من خلال تشكيل طبقات البشرة المتميزة بين . كما هو موضح تلطيخ المناعي النسيجي (الشكل 4)، يمكن تحقيق تمايز الخلايا الكيراتينيه في جميع أنحاء البشرة مماثلة للجلد الطبيعي: أساسا الخلايا غير متمايزة من طبقات البشرة السفلي (الطبقة باسل و أنواع الطبقات) وصمة عار إيجابية بالنسبة الكراتين 14، بينما الخلايا أكثر تمايزاً من الطبقات القاعدية أعلاه (الطبقة الحبيبية و الطبقة القرنية) وصمة عار إيجابية بالنسبة الكراتين 10 وإينفولوكرين. وبناء على ذلك، تلطيخ filaggrin يمكن فقط ملاحظة في متباينة جداً من خلايا الطبقة القرنية. الأهم من ذلك، وتلطيخ laminin 5 يكشف أن قد تم إنشاؤها الصفيحة القاعدية لفسيولوجيا الاتصال البشرة مقصورة الجلد لإعادة البناء الجلد الاصطناعي. وهذا يثبت أن تم إنشاؤها المكروية أورجانوتيبيك اتصال المضيف خلايا سرطان الجلد أو الماغنيسيوم للتحليل الفسيولوجي وباثوفيسيولوجيك.

غرض فحص المخدرات سرطان الجلد، خلايا سرطان الجلد واحد يمكن أيضا إدماج الأدمة الجلد كامل معادلات للسماح حيثياته الميلانوما عش تشكيل^18،19. ولذلك، جنبا إلى جنب مع الخلايا الليفية الأولية بنسبة 5:1، تثفيل معا في 200 غ س لمدة 5 دقائق وحراكه في GNL قبل الاختلاط مع الكولاجين خلايا سرطان الجلد. كنتيجة لذلك، ستشكل الاعشاش خلية سرطان الجلد تلقائياً في المقصورة عن طريق الجلد. ووفقا لخبرتنا، المرحلة فقط خلايا النمو المنتشر أعشاش النموذج المناسب، مقارنة بخلايا سرطان الجلد RGP أو VGP¹⁵. العيب الرئيسي لهذه الأنواع من النماذج هي حقيقة أن عدد وحجم أعشاش الميلانوما شكلت لا يمكن التنبؤ بها، وقد تختلف بين الجلد الفردية يعيد، مستقلة عن أي علاج. على سبيل المثال، قد كسب 1,000 الخلايا المصنفة في المقصورة الجلد 10 أعشاش تتألف من خلايا 100 أو 100 أعشاش المكونة من 10 خلايا كل (الشكل 5). هذه المتغيرات البيولوجية الحالية مع أوجه القصور ثلاثة: أولاً، عدد وحجم أعشاش الميلانوما شكلت لا يمكن التنبؤ بها؛ وثانيا، الانبثاث في فيفو تكون عادة أكبر من الاعشاش الميلانوما ويحمل تنوع داخل الأورام أكثر تعقيداً؛ وثالثاً، سبب محدودة-عمر نماذج عش الورم، العلاج يتم البدء في وقت مبكر، وبالتالي بدلاً من ذلك يحول دون نمو الورم بدلاً من التسبب في الانحدار القائمة الورم أعشاش.

للتغلب على هذه القيود أورجانوتيبيك الميلانوما كروي الجلد نماذج يمكن أن تتولد. بإسقاط الخلايا في شنقاً لمدة 14 يوما²⁰تثقيف الميلانوما المنتشر 250، تتولد الماغنيسيوم تكاثر تتألف من سرطان الجلد قابلة للحياة فاسكولاريزيد خلايا عرض هيكل اتفاق نهائي قطرها حوالي 500 ميكرومتر محاكاة ورم العقد، ورم خبيث الجزئي، أو بين الشعرية الصغرى المناطق الأورام الصلبة^،من²¹إلى²². وبصفة عامة، أي خط خلية سرطان الجلد مناسبة لتوليد الماغنيسيوم عبر الشنق إسقاط الأسلوب؛ ومع ذلك، الخلايا المستمدة من أكثر تقدما شكل مراحل الورم المنتشر الماغنيسيوم أكثر صلابة مقارنة بخطوط الخلايا المستمدة من أوائل مراحل التقدم، مثلاً، RGP.

لبعض الخلايا، فمن المفيد لتشكيل كروي السليم لتعزيز لزوجة الشنق إسقاط الثقافة المتوسطة. يمكن تحقيق ذلك بإضافة 10-50% الميثيل-السليلوز إلى متوسط الثقافة. الميثيل السليلوز الأسهم الحل، اﻷوتوكﻻف ز 1.2 الميثيل السليلوز جنبا إلى جنب مع شريط إثارة مغناطيسية في زجاجة زجاج 100 مل. إضافة 100 مل المتوسطة مسخن (60 درجة مئوية) وآثاره 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وآخر 1-2 ح في 4 درجات مئوية. الطرد المركزي حل الأسهم ح 2 في 5,000 س ز وتخزين المادة اللزجة طافية في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

التحقق من صحة السليم نماذج كروي الميلانوما الجلد الكامل شرط بحقيقة أن عدد محدد من سرطان الجلد الماغنيسيوم يمكن-على الأقل إحصائيا-تدمج تنتجها الخلايا الليفية الجلد/الكولاجين أنا سقالة في اليوم الأول لبناء نموذج الجلد، مما يتيح لهم لتطوير التعاون خلال تمايز البشرة لأيام 25-27. يمكن تحليل عائد الماغنيسيوم مباشرة بعد البذر، نظراً لظهور الماغنيسيوم جل البقع البيضاء داخل شفافية عن طريق الجلد ويمكن أن ينظر إليها دون أي جهاز التكبير (الشكل 2). كنتيجة لذلك، يتم إنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد جلد أن المرافئ الميلانوما ناضجة الماغنيسيوم، الذي كان مثقف في المختبر لما مجموعة 42 يوما تقريبا، عرض أعلى مستوى من الأورام داخل الخلية التمايز¹⁵.

ح & ه تلطيخ نموذج كروي الميلانوما الجلد يكشف عن المظهر النسيجي والتوزيع الخلوية لسرطان الجلد الماغنيسيوم تكون مشابهة جداً لواحد من سرطان الجلد البشري غير vascularized الجلد الانبثاث في فيفو¹⁵ (رقم 6 ). الفئات السكانية الفرعية اثنين من خلايا سرطان الجلد يمكن تمييزها الواضح في ظل هذه الظروف: يتدنى المتكاثرة طرفية ويتدنى مركزية تتكون أساسا من تقلصت، أبوبتوتيك أو نخرية الخلايا، وتشكيل ما يسمى "نخرية" مركز. إيمونوهيستوتشيميكالي تعيش وتنتشر الفئات السكانية الفرعية يمكن الكشف عن استخدام الأجسام المضادة ضد انتشار العلامة كي-67، بينما يمكن تصور خلايا مركز نخرية TUNEL تلطيخ¹⁵. هناك ما يبرر هذا التوزيع خاصة للفئات السكانية الفرعية خلية ورم بحجم كروي (إيه فايف زيرو زيرو ميكرومتر)، الناتجة عن نقص العناصر الغذائية والأكسجين في الجزء المركزي حيث تتراكم النفايات تقويضي. يتبع البروتوكول شريطة هنا سوف تسمح لتوليد أورجانوتيبيك موثوقة واستنساخه تضمين نموذج الإنسان الكامل-سمك الجلد مع الماغنيسيوم الميلانوما البشرية التي تحاكي الإنسان الميلانوما الجلد ورم خبيث. فحص السموم، تطبيقات لهذا النموذج تشمل اختبار المخدرات، تؤثر مركبات التجميل أو العلاج على ثمرة سرطان الجلد، والعلاج بالليزر.

الشكل 1 : زراعة أورجانوتيبيك 3D الجلد يعيد بناء المغمورة بالمتوسطة وفي واجهة الهواء السائل- في يوم 0 الكيراتينيه الأولية هي المصنفة على رأس المقصورة الجلد تتكون من الخلايا الليفية الأولية جزءا لا يتجزأ في نوع الكولاجين أنا المصفوفة. يعيد بناء البشرة 3D البقاء المزروعة المغمورة مع اجتماع فريق الخبراء لمدة 7 أيام، فصل من الجدار إدراج، وتبدأ في التقلص. في يوم 8 إدراج نقل إلى 6-الآبار والمزروعة في واجهة الهواء السائل للسماح للطبقات البشرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : تظهر الميلانوما الماغنيسيوم جزءا لا يتجزأ في المقصورة الجلدية كالبقع البيضاء- وفي حين يمكن إضافة إعداد المقصورة الجلد من الجلد 3D إعادة البناء، عدد محدد من الماغنيسيوم سرطان الجلد إلى نوع الكولاجين تنتجها الخلايا الليفية أنا مزيج. بمجرد انقشاع الجل عن طريق الجلد، تصبح مرئية كالبقع البيضاء الماغنيسيوم سرطان الجلد.

الشكل 3 : مخطط لبناء نموذج الجلد أورجانوتيبيك 3D- إزالة الأنسجة الدهنية من العينة الجلد وقطع إلى أجزاء أصغر. الحضانة مع الحل ديسباسي بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية يسهل انفصال البشرة عن الأدمة. الليفية الأولية المعزولة والكيراتينيه ينبغي زراعتها بشكل منفصل واستخدامها بين سن 4-6 و 3-4، على التوالي. بعد ذلك، يمكن المضي في توليد نموذج ثلاثي الأبعاد من الجلد كما هو موضح في البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 : إظهار أورجانوتيبيك 3D الجلد يعيد بناء على مستوى تمايز مشابهة لجلد الإنسان العادي. البارافين المقاطع من مكافئات الجلد (A) جلد الإنسان مقارنة بالعادي (ب) كانت الملون للتعبير عن كراتين 14 (أحمر: λ_تحويله 554 نانومتر؛ λ_م 568 nm) و involucrin 10، (الأخضر: λ_ت 490 نانومتر؛ λ_م 525 نانومتر )، filaggrin (الأخضر: λ_ت 490 نانومتر؛ λ_م 525 نانومتر)، و laminin 5 (الأخضر: λ_ت 490 نانومتر؛ λ_م 525 نانومتر)، وتحليلها مع مجهر الأسفار [كنفوكل]. كانت تصور نواة الخلية تلطيخ DAPI (الأزرق: λ_ت 340 نانومتر؛ λ_م 488 نانومتر). الفحص المناعي للكامل 3D-سمك الجلد مكافئات كشفت السليم البشرة الطبقية تشكيل طبقات متميزة للبشرة كما رأينا في جلد الإنسان العادي. بينما الملون الخلايا من طبقات البشرة أقل إيجابية بالنسبة الكراتين 14، ميزت الأكثر خلايا من الطبقة القاعدية أعلاه تبين الكيراتين 10 وتلطيخ إينفولوكرين. وأعرب خلايا متباينة جداً قريبة من الطبقة القرنية filaggrin. تلوين Laminin 5 يظهر أن يتم إنشاؤها الصفيحة القاعدية لفسيولوجيا الاتصال البشرة مقصورة جلدي (لوحة أدنى). وقد أخذت هذا الرقم من فورسمان et al. ¹⁵ مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5 : لا يمكن التنبؤ بعدد وحجم أعشاش الميلانوما شكلت عفويا. تشكيل عش الميلانوما حيثياته في المقصورة الجلد من الجلد كامل مكافئات يمكن أن يتحقق عن طريق خلط عدد محدد من سرطان الجلد الخلايا مع الخلايا الليفية الأولية لتضمين كل أنواع الخلايا في نوع الكولاجين أنا المصفوفة. يمكن فقط تحليل عدد وحجم أعشاش الميلانوما المشكلة تلقائياً من إعادة البناء جلد 3D ناضجة بعد حوالي 21 يوما. كما هو مبين من عينتين (أ) و (ب)، قد تختلف الأرقام والأحجام أعشاش الميلانوما بين يعيد بناء البشرة الفردية. نتيجة لذلك، من الصعب التحقق من صحة هذه النماذج والتنبؤ بالأثر العلاجي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 6 : الماغنيسيوم الميلانوما دمج الجلد مكافئات إيجاز الملامح الرئيسية لورم خبيث الميلانوما الجلدية البشرية. ح & ه الملون مقاطع البارافين من الماغنيسيوم الورم مضمن إلى معادلاتها الجلد كشفت الماغنيسيوم لتقاسم الميزات الرئيسية مع الميلانوما الجلدية البشرية غير vascularized الانبثاث في فيفو. الفئات السكانية الفرعية اثنين من الخلايا بوضوح ملحوظ: يتدنى المعيشة المحيطية والمركزية يتدنى تتكون أساسا من تقلصت، أبوبتوتيك أو نخرية الخلايا، وتشكيل مركز "نخرية". هذا التوزيع للفئات السكانية الفرعية خلية الورم مكفولة بحجم كروي. وقد تم تعديل هذا الرقم من فورسمان et al. ¹⁵ مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

كروي سرطان الجلد أورجانوتيبيك الجلد نموذج عرض هنا أوامر رؤى جديدة لفهم أعمق لمداواة البينية والتفاعل المضيف الورم، وقد توفر منصة فحص متقدمة لدراسة الآليات الجزيئية للتنمية الورم و مقاومة العلاج في المستقبل.

لضمان الأفضل الفسيولوجي و في فيفو محاكاة ظروف الجلد يعيد، ونوعية الخلايا الأولية ذات أهمية قصوى. كما ذكر أعلاه، خلايا الجلد الأحداث أو قبل الولادة تظهر على أدنى درجة التمايز وهي بالتالي أفضل مناسبة لتوليد شبه كامل-سمك الجلد. مراقبة الجودة الممكنة الأولى هو مدى انكماش الجلد في اليوم الثاني بعد زرع الخلايا الكيراتينيه واكويليبراتينج الهلام ل EGM (أقسام 8.2 و 8.3 من البروتوكول). سوف يتقلص الهلام الجلد الأكثر مع أفضل نوعية من الخلايا الليفية. أيضا، قد تنال من دمج الخلايا الليفية كثيرة جداً أو قليلة جداً انكماش الجلد ومن ثم تمسك البشرة بحجرة عن طريق الجلد. وهذا بدوره سوف خرق تمايز البشرة، نظراً لأن هذه العملية تتطلب محادثة عبر واسعة النطاق بين خلايا الجلد والبشرة.

وتتوقف نوعية الخلايا الأولية أيضا حاسمة على كونفلوينسي الخلية، فضلا عن مرور الخلايا. إذا كانت الخلايا الكيراتينيه وتزرع على إيه إيت زيرو % كونفلوينسي فورا وقف تكاثر والبدء في التفريق. ولذلك من المهم للثقافة منها إلى 40-70% كونفلوينسي خلال باساجينج واستخدامها لا يتجاوز سن 3-4. الليفية أقل حساسية ولكن لا ينبغي أن تستخدم بعد مرور 4-6. يرجى أيضا ملاحظة أن جميع الخلايا الأولية وخطوط الخلايا المستخدمة لإنشاء نماذج الجلد كروي الميلانوما أورجانوتيبيك تستزرع خالية من المضادات الحيوية، وذلك خطر تلوث عالية. بيد أن إضافة المضادات الحيوية يتغير فسيولوجيا الخلايا الفردية وذلك يقلل من جودة مكافئات الجلد.

وبصفة عامة، ورم كروي تشكيل الممكن من تقريبا جميع أنواع خطوط الخلايا السرطانية وأيضا الخلايا السرطانية معزولة طازجة من المواد المريض. قد تختلف الوقت عدد و/أو زراعة الخلية الأولى للحصول على أحجام كروي الأمثل اعتماداً على نوع الخلية المستخدمة. تصل إلى حجم من 150-200 ميكرون، كافة الخلايا المدرجة في كروي يمكن لا يزال بما فيه الكفاية توفيره مع المواد الغذائية عن طريق نشر بسيطة. إظهار درجة عالية من التمايز الخلوي فقط الماغنيسيوم مع أحجام إيه فايف زيرو زيرو ميكرومتر وتمثل الميزات النموذجية ل أنسجة الورم غير فاسكولاريزيد²².

أورجانوتيبيك سرطان الجلد-كروي-الجلد-الطراز وضعت هنا مناسبة خاصة لدراسة التفاعلات المضيف الورم واختبار إطار في فيفوالمخدرات سرطان الجلد-مثل الظروف¹⁵. لا يزال، البيئة من سرطان الجلد في فيفو حتى أكثر تعقيداً، وإيواء مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا السرطانية المرتبطة، بما في ذلك الخلايا المناعية، وخلايا بطانية. منذ إضافة الخلايا المناعية الأولية المناسبة تواجه مشاكل مع هيستوكومباتيبيليتي، هذه النماذج غير قادرة على رصد النهج المناعة العلاجية على نحو كاف.

على الرغم من ذلك، الماغنيسيوم سرطان الجلد يمكن أن تتولد من المواد الطازجة معزولة المريض ومجرد إدراج إعادة البناء الجلد الكامل، قد يخدم كالمخدرات فرادى فحص منصات. حتى إدماج قطعة من ورم خبيث سرطان الجلد في الجلد يعيد بناء المتصور لاختبار تركيبات العقاقير في نهج علاجية مصممة خصيصا. بما في ذلك نموذج الميلانوما الجلد 3D أورجانوتيبيك في التجارب السريرية من المرجح أن تساعد على ضمان إلا رواية العلاجية الواعدة المفاهيم أخذ قدما في التجارب السريرية، مما يقلل من معدل الاستنزاف لعلاجات جديدة محتملة لهذا المرض وزيادة معدل نجاح العلاج في التجارب السريرية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
fetal serum albumin (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270106	add 10 % to cell culture medium
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	1X dilute in PBS
RPMI	Thermo Fisher Scientific	61870010	for cultivation of melanoma cell lines
DMEM	Thermo Fisher Scientific	41965062	for cultivation of primary fibroblasts
Dispase	Gibco life technologies	17105041	2U/ml, dissolve in PBS
Collagen type I	BD Biosciences	354249	usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml
24-well inserts Nunclon	Nunc	140629	8 µm pore size; use standing, not hanging inserts!
cell strainer	BD Falcon	352360	yellow
Gentamycine	Thermo Fisher Scientific	15750060	dissolve in PBS
Keralife keratincyte medium	Cell Systems		do not add FCS or antibiotics
Collagenase	SERVA	17454	NB4 standard grade
juvenile human keratinocytes	Cell Systems	FC-0007	alternative to own preparation from juvenile foreskin
juvenile human fibroblasts	Cell Systems	FC-0001	alternative to own preparation from juvenile foreskin
DMEM [+] 4,5 g/l Glucose, [+] L- Glutamine, [-] L- Pyruvate	Gibco life technologies	41965	mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium;          mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine	Gibco life technologies	21765-029	add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15)
EGF	Gibco life technologies	13247-051	add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium
Calcium chloride	Merck Chemicals	2381	add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium
Selenic acid	Alfa Aesar	18851	add 53 nM for the generation of EGM and MM medium
Insulin	Lilly	HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml	add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E-0135	add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
P-Ethanolamine	Sigma-Aldrich	P-0503	add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
Holo-Transferrine	Sigma-Aldrich	T-0665	add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Triiodthyronine	Sigma-Aldrich	T-6397	add 20 pM for the generation of EGM and MM medium
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-088816	add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	add 10 nM only for the generation of EGM medium
Hepes	Sigma-Aldrich	H-3784	add 15 mM for the generation of EGM and MM medium
Serine	Sigma-Aldrich	S-4311	add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
Cholinchloride	Sigma-Aldrich	C-7017	add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium
dFCS	Sigma-Aldrich	F-0392 Lot 086K0361	add 2 % for the generation of EGM and MM medium
Adenine	Sigma-Aldrich	A-9795	add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium
L-Glutamine	PromoCell	C-42209	add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium
Strontiumchloride	Sigma-Aldrich	255521	add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
anti cytokeratin 10 antibody	Dako	M7002	1:50
anti cytokeratin 14 antibody	Santa Cruz	sc-53253	1:200
anti laminin 5 antibody	Santa Cruz	sc-32794	1:50
anti filaggrin antibody	Thermo Fisher Scientific	MA5-13440	1:50
anti involucrin antibody	Acris Antibodies	AM33368PU	1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled	LifeSpan Biosciences	LS-C153907	1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled	Jackson Immuno Research	115-165-003	1:1000
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	1:100