מודל העור מלנומה Organotypic 3D ספרואיד

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת 3D organotypic מלנומה ספרואיד העור מודל recapitulates הן את הארכיטקטורה ואת multicellular המורכבות של איברים/גידול של ויוו , אבל באותו זמן מסתגלת שיטתית ניסיוני התערבות.

Abstract

שינוי ממאיר של מלנוציטים, תאי פיגמנט העור האנושי, גורם להיווצרות מלנומה, סרטן אגרסיבי ביותר עם פוטנציאל גרורתי מוגברת. לאחרונה, מונו-chemotherapies להמשיך לשפר על ידי טיפולים שילוב ספציפי מלנומה עם מעכבי קינאז יישוב. . עדיין, מלנומה גרורתית נשאר מחלה מסכנת חיים בגלל גידולים להפגין התנגדות ראשי או לפתח עמידות לטיפולים חדשניים, ובכך החזרת יכולת tumorigenic. על מנת לשפר את ההצלחה הטיפולית של מלנומה ממאירה, הקביעה של המנגנונים המולקולריים היוועצות עמידות נגד גישות הטיפול הקונבנציונלי הוא נחוץ; עם זאת, זה דורש מודלים חדשניים הסלולר במבחנה . . כאן, אנחנו מציגים במבחנה organotypic תלת מימד (3D) מלנומה ספרואיד מודל יכולים להתחזות הארכיטקטורה ויוו של מלנומה ממאירה, עשוי להצדיק תובנות חדשות אינטרה-tumoral כמו גם הגידול-פונדקאי אינטראקציות. המודל משלב מספר מוגדר של הבדיל ובוגרת מלנומה spheroids במודל לשיקום עור תלת-ממד מלא המורכב של תאי העור העיקרי. המצב הרכב ובידול הסלולר של spheroids מלנומה מוטבע הוא דומה לזה של מלנומה עורית גרורות vivo בתוך. באמצעות מודל ספרואיד מלנומה זה organotypic כמו תרופה הקרנת פלטפורמה עשויים לתמוך הזיהוי המגיבים נבחר טיפולים משולבים, בעוד חוסך את הנטל טיפול מיותר עבור הלא-המגיבים, ובכך מגדיל את היתרון של התערבויות טיפוליות.

Introduction

העור האנושי מורכב שני תאים נפרדים לשרת פונקציות שונות בהגנה על הגוף מפני השפעות סביבתיות שליליות¹. תא עורי התחתון מורכב רקמת חיבור fibro-אלסטי. הוא מורכב של סיבי קולגן ואלסטין מחוברים באופן רופף מסונתז על ידי fibroblasts, משרת פונקציה מחסום מכני. הדרמיס מופרד האפידרמיס העליון על ידי הנדן הבזליים אשר מופק כמו מטריצה חוץ-תאית בשל תקשורת מתמדת בין שני תאי העור. בניגוד הדרמיס, האפידרמיס אפיתל קשקשיים אשר מורכב בעיקר keratinocytes, יכול להיות מובחן ארבע שכבות. הרובד basale מורכב מובחן keratinocytes הבזליים אשר נובעות כל הזמן העור ובתאים stratifying דרך השלבים של הרובד קוצנית , הרובד granulosum לתוך stratum corneum כדי להגן על הגוף מפני התייבשות וזיהומים². מלנוציטים מיושרים של קרום הבסיס, ולתקשר באמצעות הרחבות דנדריטי עם keratinocytes מרובים. הם מייצרים מלנין הפיגמנט כדי להגן על רקמות העור מפני ההשפעות השליליות של קרינת UV, כמו הזדקנות העור, החיסוני, דלקת, אינדוקציה של סרטן עור שאינו מלנומה. התרומה קרינה UV הטרנספורמציה של מלנוציטים כדי מלנומה ממאירה, אולם הוא עדיין תחת הדיון³.

התפתחות מלנומה הבדיל לשלבים התקדמות הגידול שונים, המאופיינת על ידי שינויים גנטיים, מורפולוגיות, היסטולוגיים מסויימים⁴. הם מקורם גם דה נובו או של נקודת חן מולדת או נרכשת עקב מקומי עלייה של התפשטות מלנוציט גורם neoplasia שפיר. את הפציעה קודמן עשוי להמיר לתוך רקמות dysplastic מבנית ששונה המכיל תאים atypic, אשר עלולה להמשיך ממאיר בשלב הראשון, שלב הצמיחה רדיאלי (RGP). בשלב מוקדם זה התקדמות הגידול מאופיין על ידי תאים מתרבים בצורה רדיאלית בתוך האפידרמיס, מציג כמה תאים באופן מקומי פולשנית בתוך הדרמיס papillary. במהלך מלנומה שלב (VGP) עוקבות גדילה אנכי תאים הצגה כבר הפנוטיפ גרורתי ופולשני לעבור דרך הנדן הבזליים לחדור בחלק העמוק של הדרמיס, כמו גם את הרקמה התת עורית⁵. לבסוף, מלנומה גרורתית (MM) מייצג את הבמה התקדמות האגרסיביים ביותר עם תאים גרורתי מערכתית מתפשטת ברחבי מערכת הדם והלימפה לפלוש יש איברים כמו הכבד, הריאות, המוח⁶.

עד כה, אבחון מוקדם ולאחריו ניתוח נשאר עדיין הטיפול היעיל ביותר של מלנומה ממאירה. הפרוגנוזה של חולים עם גרורות רחוקות, עם זאת, עדיין גרועות במיוחד⁷, כי משטרי כימותרפיה קלאסית להתייעץ רק קצת הישרדות תועלת^8,9. עם זאת, לאחר עשרות שנים של קיפאון, התפתחויות אחרונות טיפולים ממוקדים במידה ניכרת שיפרו את סיכויי ההחלמה של מלנומה ממאירה.

Dysregulation של שני מסלולים עיקריים mitogen מופעל, את ראס-RAF-MEK-טיפשה, את PI3K-AKT-PTEN איתות המסלולים, להציג את מניעי מפתח של מלנומה התקדמות, במיוחד כאשר צורונים הפעלת נקודת מוטציות של BRAFV600 proto-oncogenes, NRAS הם מתנה¹⁰. בהתאם לכך, ההמצאה של מעכבי קינאז יישוב הבטיח תועלת טיפולית לחולים הסובלים מלנומה גרורתית. מספר רב של ניסויים קליניים שנערכו לנקודה זו לא השיגה יתרון משמעותי עבור חולים עם מלנומה גרורתית. כמעט כל התגובות הן חלקיות, עם subpopulation של חולים מציג התנגדות ראשי. יתר על כן, הרכישה של התנגדות משני המובילים שמפסיק נצפתה ברוב המכריע של חולים^11,12.

מתברר כי ניתוח של המצב מוטציה לבד אינה מספיקה כדי לפתח את האסטרטגיה הטיפולית החזק ביותר. כלי אבחון חדשים מהירה ואמינה נחוצים לתעד ולנתח באופן שיטתי את יכולת התגובה של התאים הסרטניים בודדים. הרוב המכריע של נתונים זמין כרגע על מלנומה אנושית הושגו מתרבויות תא מלנומה (2D) דו מימדי. תאים סרטניים, עם זאת, גדל ב- 3D לאפשר crosstalk המערכת בין סרטן הבדיל תא subpopulations, כמו גם בין תאים סרטניים ואת הרקמה הלא-טרנספורמציה מארח שמסביב. לכן, זה יהיה הכי טוב לשחזר את סביבת 3D שבו פותח מלנומה, כדי לשמש הקרנה פרה דגם^13,14.

Protocol

כל רקמה אנושית העבודה בוצעה באמצעות פרוטוקולי המוסדי שאושר.

1. הפרדה בין דרמיס לאפידרמיס של העור האנושי (ילדותי עורלה ברית מילה)

1. למקם את העורלה (בדרך כלל 1-2 ס מ²) לתוך תבשיל תרבות תא סטרילי ללא דבק (Ø 10 ס מ), לכסות את זה עם 10-12 מ ל תמיסת באגירה פוספט⁺ (pH 7.2 מ מ CaCl₂, 0.5 מ מ MgCl₂, PBS = PBS⁺). הסר את כל הרקמות (אדיפוז) עודף באמצעות אזמל סטרילי וחדים.
2. לחתוך את העור לחתיכות 3 מ מ x 5 מ מ, לשטוף אותם עם PBS, מעבירים לצלחת תרבות תא סטרילי ללא דבק (Ø 6 ס מ). מכסים את חתיכות רקמה עם 5-7 מ של dispase פתרון (2 U/mL ב- PBS). לאטום את המנה התרבות תאים עם סרט פרפין, תקופת דגירה של 16 h-4 מעלות צלזיוס.
3. . משכי את עוריות מן החלק עורי עם מלקחיים סטרילי שני להעביר את חתיכות רקמה גזור תא בודד ללא דבק תרבות מנות (Ø 6 ס מ), לכסות את כל אחד מהם עם PBS⁺.

2. בידוד של ראשי Keratinocytes מכל האפידרמיס

1. בזהירות להסיר את PBS⁺ המנה התרבות התא באמצעות פיפטה פסטר ולשטוף את חתיכות רקמות עוריות (סעיף 1.3) עם PBS. לחתוך את האפידרמיס לחתיכות קטנות יותר (1 מ מ²) ולאסוף אותם צינור חרוטי 50-mL. להוסיף 10 מ ל 1 x טריפסין-EDTA (טרופה עד 37 ° C), תקופת דגירה של 5 דקות באמבט מים בטמפרטורה 37 º C מערבולת המתלה רקמות כל 2 דקות.
2. לעצור את התגובה אנזימטי על-ידי הוספת סרום עגל עוברי 1 מ"ל (FCS). Resuspend התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה פלסטיק 10-mL עבור 4 דק לנסות להימנע בועות וקצף היווצרות.
3. Pipet התליה תא לתוך מסננת תא (נקבוביות בגודל 100 מיקרומטר), הממוקמת מעל צינור חרוטי מ"ל, ולשטוף 3 x 5 מ ל PBS. Centrifuge התאים ב g 200 x עבור 5 דק Resuspend בגדר תא 2-6 מ"ל תרבות בינוני המכיל 1% (v/v) gentamycin. לקבוע את מספר התא באופן ידני על ידי תאים ספירה תאים 6 x 10⁵ hemocytometer וזרע לתוך בקבוקון תרבות T75 התא.

3. טיפוח Keratinocytes ראשי

1. דגירה keratinocytes העיקרי מבודד בשלב 2.3 בחממה תא-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ בינוני תקין ללא FCS, כדי confluency 50-70%.
2. את המעבר של keratinocytes בזהירות להסיר את המדיום, הוסף 5 מ ל PBS-EDTA, דגירה התאים 10 דקות ב 37 º C. לבדוק אם התאים החלו להתנתק מן הבקבוק תרבות תחת מיקרוסקופ אור (4 X הגדלה: תאים יופיע מעוגל אך עדיין מחוברים!). אם לא, להחליף PBS הישן-EDTA PBS טריים-EDTA, מחדש תקופת דגירה של עוד 10 דקות ב 37 º C.
3. הוסף 5 מ ל 1 x טריפסין-EDTA לתאים מעוגל עדיין מכוסה 10 מ"ל PBS-EDTA ו מחדש דגירה אותם למשך 1-3 דקות ב 37 º C. לעצור את התגובה אנזימטי על-ידי הוספת 1 מ"ל FCS ולאסוף את התאים מנותקת צינור חרוטי 50-mL. Centrifuge התאים ב- g x 200 עבור 5 דקות, resuspend בגדר תקין בינונית, ואת הזרעים 6 x 10⁵ תאים לתוך בקבוקון תרבות טריים T75 התא.
   הערה: כדי ליצור organotypic העור בנייה, keratinocytes העיקרי אמור לשמש לא יאוחר מאשר ממעבר 3-4.

4. בידוד של Fibroblasts העיקרי של הדרמיס

1. לחתוך את הרקמה עורי (סעיף 1.3) לחתיכות קטנות יותר (1 מ מ²) ולהעביר אותם לתוך צינור חרוטי 50-mL. להוסיף 10 מ ל collagenase-פתרון (5 U/mL ב- PBS⁺), תקופת דגירה של 45 דקות באמבט מים בטמפרטורה 37 º c Centrifuge התערובת של חתיכות רקמות ותאים ב g x 200 במשך 5 דקות.
2. לשטוף את צניפה תא פעמיים עם 10 מ"ל DMEM המכילה גלוקוז 4.5 g/L וגלוטמין, אך ללא L-פירובט. סוף סוף resuspend את חתיכות רקמה ב 2 מ של DMEM המכיל 1% (v/v) gentamycin ו- 10% FCS. להעביר אותם לתוך בקבוקון תרבות תא T25, דגירה אותם בתוך חממה תא-CO של 37 ° C ו- 5%-₂ בלילה.
   הערה: אמצעי האחסון קטן מאפשר את fibroblasts להגר ההריסות הרקמות, מכריח אותם כדי לצרף הבקבוקון תרבות.
3. למחרת בבוקר, להוסיף עוד 6 מ ל DMEM/Gentamycin/FCS, תקופת דגירה של 2-3 ימים ב 37 ° C עד התאים הגיעו 80-90% confluency.

5. טיפוח Fibroblasts ראשי

1. המעבר של fibroblasts, להסיר את המדיום ולשטוף תאים חסיד עם PBS. הוסף 5 מ ל 1 x טריפסין-EDTA דגירה למשך 3 דקות ב 37 º C.
2. לעצור את התגובה אנזימטי על-ידי הוספת 5 מ"ל DMEM/FCS ולאסוף את התאים מנותקת צינור חרוטי 50-mL. Centrifuge התאים ב- g x 200 עבור 5 דקות, resuspend בגדר DMEM בינוני, זרע 6 x 10⁵ תאים לתוך בקבוקון תרבות טריים T75 התא.
   הערה: כדי ליצור organotypic העור בנייה, fibroblasts העיקרי אמור לשמש לא יאוחר מאשר מעבר 4-6.

6. דור של מלנומה 3D Spheroids באמצעות שיטת טיפה תלוי

1. תרבות בתאי מלנומה (למשל, 451-לו או כל קו תא מלנומה עניין) על פי כללי פרוטוקולים, באמצעות RPMI המכיל 10% FCS¹⁵.
   1. כדי להפיק מלנומה spheroids של גודל ואיכות דומים, לשטוף את תאי מלנומה PBS, הוסף 5 מ של 1 x טריפסין-EDTA ב- PBS תאים T175 תא תרבות הבקבוק ולאחר תקופת דגירה של 3-5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לנטרל את טריפסין על-ידי הוספת 5 מ"ל RPMI/10% FCS. קציר שהתאים על ידי צנטריפוגה-g 200 x עבור 5 דק להשעות מחדש בגדר תא ב RPMI/FCS-ריכוז סופי של תאים למ"ל 10,000 כפי שנקבע על ידי בבניינים של hemocytometer.
2. במקום 40 x 25 µL (= 250 תאים) של התליה תא על גבי המשטח הפנימי של המכסה לצלחת תרבות תא ללא דבק סטרילי (Ø 10 ס מ) בעזרת פיפטה מרובה אלקטרונית. עם תנועה מהירה אך חלקה, תסובב את המכסה ומניחים אותו על המנה התרבות תאים המתאימים המכיל 5 מ"ל PBS.
   1. תרבות "מחזיקה טיפה מנות" חממה תא-CO של 37 ° C ו- 5%-₂ 10-14 ימים, בהתאם לסוג התא המשמש.
      הערה: התאים משלב הצמיחה MM בדרך כלל לגדול מהר יותר, בצורה יותר חזקה spheroids הטיפה לתלייה לעומת בתאי מלנומה נגזר על RGP או VGP. להערכת בודדים, להתבונן ספרואיד צמיחה תחת משקפת או תחת מיקרוסקופ אור (4 X הגדלה). בדרך כלל, spheroids הופכים לזיהוי לאחר 48 שעות תחת משקפת או תחת מיקרוסקופ אור (4 X הגדלה). אחרי 10-14 ימים, הם גלויים ללא כל מכשיר ההגדלה.
3. 5 ימים לאחר סיכוייכם טיפה הראשונית, להוסיף 10 µL בינוני RPMI/10% FCS טריים כל טיפה. לאחר מכן, חילופי µL 10 בינוני בכל יום אחר. השימוש של מתקן אלקטרוני שימושי מאוד בשלב זה.
4. בהתאם לסוג התא, לקצור את spheroids (ראה סעיף 10 לפרטים) לאחר 10-15 ימים בהדחה בעדינות המכסה תא תרבות צלחת עם PBS. לאסוף אותם בקערה התרבות התא ללא דבק טריים.
   הערה: תקופת טיפוח-תרגול תלוי שלב הצמיחה גידול של תאי מלנומה כאשר הם נשאבו בתחילה, למשל, spheroids שמקורם תאים 451-לו לגדול כ-500 מיקרומטר בקוטר בתוך 12 ימים culturing בתיבה הנפתחת תלויה¹⁵ .

7. דור של תא עורי עור מלא Organotypic משחזר

1. ליצור מודלים העור באמצעות 24-ובכן תא נקבובי ממברנה מוסיף (הנקבוביות גודל 8 מיקרומטר) להציב לוחות 24-. טוב.
   הערה: ודא שלא לעשות שימוש תלוי אבל עומד מוסיף, כי הם ימוקמו על פלטה 6-ובכן לטיפוח אוויר נוזלי בשלב מאוחר יותר.
2. הכינו את הפתרון (GNL) ניטרול ג'ל¹⁵, כמו גם התקשורת תרבות המכונה מ"מ ו^16,צמיחה אנדותל מדיה (EGM)¹⁷. כדי למנוע קרישת דם, חנות הקולגן מסוג I (בדרך כלל מזנב החולדה, 3.5-4 מ ג/מ ל חומצה אצטית N 0.02 נקודות) על הקרח עד השימוש, כי זה מתחיל להתחבר ב- RT.
3. להשעות מחדש עונה 1 פרק 10 fibroblasts⁵ לכל הוספה ב GNL ומערבבים במהירות התליה תא עם קולגן ביחס של 1:3 באמצעי אחסון הסופי של µL 500/הוספה. מיקס על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה כדי למנוע היווצרות בועה כמו בועות עשוי לפגום באיכות העור לשחזר.
4. לאפשר את ג'לים עורי בודדים להתיישב על ידי שמירה אותם בלי בינוני ב RT למשך 30 דקות בשכונה סטרילי. לאחר מכן מכסים כל ג'ל עם DMEM המכילה גלוקוז 4.5 g/L, 1%-גלוטמין, 10% FCS, וללא L-פירובט, דגירה בין לילה ב 37 º C.

8. דור של התא באפידרמיס של עור מלא Organotypic משחזר

1. למחרת להסיר את המדיום ג'לים עורי, equilibrate אותם עם המדיה EGM (FCS 10%, 1% PenStrep, גנטמיצין 10 מ"ג/מ"ל) עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. למשוך את המדיום, בזהירות זרע keratinocytes⁵ עונה 1 פרק 10 resuspended ב 100 µL EGM על גבי הג'ל עורי.
2. דגירה של בנייה עבור 1.5 h ב 37 ° C כדי לאפשר את keratinocytes לדבוק תא עורי.
   הערה: במהלך תקופה זו דגירה, ג'לים יתחילו להתכווץ עקב התכווצות פיברובלסט-induced, לפיכך, לפחות באופן חלקי ניתוק מהקירות הוספה.
3. מכסה את העור מקבילות עם 800 µL EGM, הסר בזהירות את הג'ל שיורית מהקיר הוספה עם טיפ קטן פיפטה (לבן). תרבות של מקבילות העור שקועים EGM למשך 7 ימים חממה תא ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂, ולשנות את המדיום בכל יום אחר.
   הערה: במהלך תקופה זו העור מקבילות יתכווץ באופן משמעותי.

9. אוויר נוזלי טיפוח העור מלא Organotypic משחזר

1. יום 8, העברת כל הכנס טוב בודדים של צלחת 6-. טוב. רק להוסיף מ ל 1.2-1.4 מ מ בינוני כל טוב, כך בנייה מחדש העור מסופק עם מדיום מתחתית הבאר אך אינו מכוסה בינונית.
   הערה: את הטיפוח הממשק אוויר נוזלי מאפשר ריבוד של חלק באפידרמיס, הקמת שכבה cornified מלא (הקרנית).
2. במהלך הימים 10-17, לשנות את המדיום כאמור בסעיף 9.1 בכל יום אחר. במהלך תקופה זו, להוסיף תרופות או גירויים אחרים לפי הצורך כדי המדיום. הסר בזהירות את בנייה מחדש של העור מלא מהמכסה נקבובי ממברנה בעזרת פינצטה מעוקל לניתוח נוסף, למשל, ניתוח immunohistochemical (איור 1).

10. דור של הדגמים העור מלנומה Organotypic ספרואיד

1. כדי לשלב את spheroids מלנומה לתוך תא עורי של בנייה מחדש העור מלא organotypic, בזהירות לשטוף את spheroids (לאחר שלב 6.4) המכסה של התליה טיפה תא תרבות תבשיל עם PBS. לאסוף 10-20 spheroids/להוסיף לצלחת תרבות עקרה תא ללא דבק. הסר בזהירות PBS מוגזמת עם פיפטה פסטר.
2. מחוק לגמרי את spheroids ביותר האפשרי הקטן ביותר של אמצעי האחסון של EGM. בשלב הזה לצפות ולספור את spheroids בעין בלתי מזוינת, ללא מכשיר ההגדלה נוספות. לקחת 10-20 spheroids לכל עור דגם/ג'ל, כאמור בשלב 10.1.
3. העברתם לאמצעי האחסון הרצויה של GNL המכילה fibroblasts (במהלך שלב 7.3), מערבבים עם סוג הקולגן. מהשלב הזה על המשך כמתואר בסעיפים 7.3-9.1.
   הערה: גידול spheroids לנראה הג'ל עורי כמו כתמים לבנים (איור 2)

תוצאות

טיפול מוצלח של מלנומה גרורות שיכול להיות מושפע קרוס-השיחה בין תאים סרטניים, כמו גם בין גידול התאים המארחים שאינו משתנה. המטרה של פיתוח מודלים organotypic של סרטן במבחנה היא לספק מערכות פרה למבחן מסכם את הדברים את הארגון 3D והמורכבות של מלנומה אנושיים ויוו. דבר זה מאפשר חקר ההשפעה הטיפולית על הגידול בתוך סביבה organotypic ואת ההשפעות השליליות על הרקמה שמסביב הראשי במקביל.

כדי לפתח את הדגמים הטובים ביותר של עור organotypic, האיכות של התאים הראשי היא קריטית. זה יתרון לשימוש fibroblasts העיקרי לנוער keratinocytes, כי הם בדרך כלל פחות מובחנים בהשוואה לתאי העור העיקרי למבוגרים. לעור נעורים תאים באפשרותך להיות מבודד העורלה לנוער, כפי שמתואר בסעיפים פרוטוקול 1-5, אך ניתן גם לרכוש מחברות fibroblasts העיקרי טרום לידתית, keratinocytes. אם רכישת, יש צורך סדר התאים מתורמים שונים כדי להימנע מתוצאות תורם ספציפי, למשל, רגישות סמים. פרוטוקול כל מוצג כערכת באיור3.

בקרת איכות של תלת-ממד מלא-עור מקבילות דורש ניתוח immunohistochemical. ניתן לקבל רושם ראשוני Hematoxylin-אאוזין (H & E) צביעת פרפין משובצים קטעים (3 מיקרומטר). ניתוח מפורט של האיכות של בידול אפידרמיס ועל היווצרות הנדן הבזליים בין דרמיס לאפידרמיס דורש ניתוח immunohistochemical באמצעות נוגדנים ספציפיים נגד סמן ריבוד באפידרמיס. דבר זה מאפשר הבחנה בין מובחן, מאוד שגשוג תאים ממוקם קרוב קרום הבסיס מאוד הבדיל ואת keratinized תאים בחלק הקרנית דרך היווצרות של שכבות עוריות ברורים בין . כפי שמוצג על ידי צביעת החיסון-היסטולוגית (איור 4), התמיינות keratinocytes ברחבי האפידרמיס של יכולה להיות מושגת הדומה לעור רגיל: בעיקר את התאים מובחן מהשכבות אפידרמיס תחתון (הרובד basale , הרובד קוצנית) כתם חיובי עבור קרטין 14, בעוד תאים הבדיל יותר מן הרבדים העל הבזליים (שכבה granulosum ו הקרנית) כתם חיובי עבור קרטין 10 ו- involucrin. בהתאם לכך, filaggrin מכתים יכול רק להיות שנצפו בתאים מאוד הבדיל של הקרנית. והכי חשוב, laminin 5 צביעת מגלה כי פרופריה הבזליים נוצר להתחבר מבחינה פיזיולוגית של אפידרמיס תא עורי של בנייה מחדש עור מלאכותי. זה מוכיח כי microenvironment organotypic בתקשורת נוצר בתאי מלנומה מארח או spheroids עבור הפיזיולוגיות וניתוח pathophysiologic.

לצורך מלנומה והתרופות הקרנה, בתאי מלנומה יחיד גם ניתן לשלב לתוך הדרמיס של העור מלא מקבילות כדי לאפשר דה נובו מלנומה הקן היווצרות^18,19. לכן, בתאי מלנומה בשילוב עם ראשי fibroblasts ביחס של 5:1, centrifuged ביחד ב 200 גרם x במשך 5 דקות, resuspended, GNL לפני ערבוב עם קולגן. כתוצאה מכך, קינים תא מלנומה יהוו באופן ספונטני בתוך התא עורי. הניסיון שלנו רק תאים של הגידול גרורתי שלב קינים נאותה הטופס, בהשוואה בתאי מלנומה של RGP או VGP¹⁵. אחד החיסרון העיקרי של סוגים אלה של המודלים היא העובדה כי המספר והגודל של מלנומה קנים שנוצר לא ניתן לחזות, והם עשויים להשתנות בין בודדות העור בנייה מחדש, ללא תלות כל טיפול. לדוגמה, תאים 1,000 נזרע לתוך תא עורי עלול לקבל 10 קינים המורכב תאים 100 או 100 קנים בהיקף של 10 תאים כל (איור 5). משתנים ביולוגיים אלה מציגים שלושה ליקויים: ראשית, המספר והגודל של מלנומה קנים יצרו צפויות; שנית, גרורות ויוו בדרך כלל גדולים יותר מלנומה קינים ולהציג מגוון אינטרה-tumoral מורכבים יותר; שלישית, בשל מוגבלות תוחלת החיים של הגידול-קן מודלים, וטיפול מאותחלת מוקדם, כתוצאה מכך אלא מעכב גידול תוצר במקום לגרום רגרסיה של קנים הגידול הקיימים.

כדי להתגבר על מודלים אלה-העור ספרואיד מלנומה organotypic מגבלות ניתן להפיק. מאת culturing מלנומה גרורתית 250 תאים בתלייה ירידה של 14 ימים²⁰, spheroids reproducibly נוצרות המורכב של מלנומה קיימא תאים עם קוטר הסופי של-500 מיקרומטר מחקה ללא הצגת מבנה קומפקטי vascularized הגידול צמתים, מיקרו-גרורות, או בין-נימי מיקרו אזורים של גידולים מוצקים^21,22. באופן כללי, כל קו תא מלנומה מתאימה לדור של spheroids באמצעות התליה בשיטת; עם זאת, תאים שמקורם מתקדם יותר גידול גרורתי שלבים טופס spheroids מוצק יותר בהשוואה שורות תאים שמקורם התקדמות בשלבים המוקדמים, למשל, RGP.

עבור כמה תאים, זה יתרון על היווצרות ספרואיד הנכונה להגברת צמיגות של התליה ירידה בינונית תרבות. זו יכולה להיות מושגת על ידי התוספת של 10-50% מתיל-תאית למדיום תרבות. לפתרון מתיל-תאית מניות, החיטוי 1.2 g מתיל-תאית יחד עם פס מגנטי מערבבים בבקבוק זכוכית 100 מ. להוסיף 100 מ ל טרופה (60 ° C) בינונית ומערבבים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ו- h עוד 1-2-4 מעלות צלזיוס. Centrifuge הפתרון מניות עבור 2 h ב 5,000 x g ולאחסן את תגובת שיקוע צמיגה ב 4 ° C עד השימוש.

אימות תקינה של העור מלא מלנומה ספרואיד מודלים מסופק על ידי העובדה כי מספר מוגדר של מלנומה יכול spheroids - לפחות מבחינה סטטיסטית - ניתן לשלב פיברובלסט עורי/הקולגן אני לגרדום-יום 1 של הבנייה דגם העור, המאפשר אותם לפתח במשותף במהלך התמיינות עוריות לעוד 25-27 ימים. ניתן לנתח את התשואה של spheroids ישירות לאחר זריעה, מכיוון spheroids מופיעים כתמים לבנים בתוך שקופים עורי ג'ל, ניתן לראות ללא כל מכשיר ההגדלה (איור 2). כתוצאה מכך, דגם תלת-ממד העור נוצר נמלים מלנומה בוגרת spheroids, שהיה בתרבית במבחנה עבור סכום כולל של-42 ימים, מציג את הרמה הגבוהה ביותר של אינטרה-tumoral תא בידול¹⁵.

H & E מכתים של המודל ספרואיד העור מלנומה חושף את המראה היסטולוגית ואת חלוקת תאי מלנומה spheroids דומה מאוד, לאחת vascularized שאינם מלנומה אנושית העור גרורות ויוו¹⁵ (איור 6 ). Subpopulations שני תאי מלנומה הם ניתן להבחנה ברורה בתנאים האלה: subpopulation proliferating היקפיים, subpopulation המרכזית בעיקר המורכב מצומק, מוות או תאים עם נמק, ויוצרים את מה שנקרא "נמק" מרכז. Immunohistochemically חי, מתרבים subpopulations ניתן להבחין באמצעות נוגדנים נגד דה מרקר התפשטות KI-67, ואילו תאים של המרכז נמק, ניתן לאבחן על ידי מכתים TUNEL¹⁵. הפיזור המסוים של הגידול תא subpopulations יש הצדקה לפי גודל ספרואיד (≥500 מיקרומטר), כתוצאה מחוסר חומרים מזינים וחמצן בחלק המרכזי שבו מצטברת פסולת קטבולי. בעקבות הפרוטוקול בתנאי כאן יאפשר את הדור של organotypic לשחזור ואמין עור בעובי מלא דגם עם מוטבע spheroids מלנומה אנושית המחקים גרורות העור מלנומה אנושית. יישומים של זה הדגם כלול בדיקות סמים, הקרנת רעלים, להשפיע על חומרים קוסמטיים או לייזר בטיפול על תוצר מלנומה, וטיפול.

איור 1 : טיפוח של בנייה מחדש של העור 3D organotypic שקוע בינונית ו- הממשק אוויר נוזלי. ביום 0 keratinocytes הראשי הם נזרע על גבי תא עורי המורכב fibroblasts הראשית מוטבע לתוך סוג הקולגן אני מטריקס. בנייה מחדש של העור 3D מעובד להישאר מתחת למים עם EGM למשך 7 ימים, ניתוק מהקיר הוספה והתחל מתכווץ. ביום 8 התוספות הן הועבר 6-ולס וטיפח בכל הממשק אוויר נוזלי כדי לאפשר ריבוד באפידרמיס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : מלנומה spheroids מוטבע לתוך תא עורי מופיעים כתמים לבנים. בזמן הכנת תא עורי של בנייה מחדש העור תלת-ממד, מספר מוגדר של מלנומה spheroids ניתן להוסיף את סוג הקולגן פיברובלסט מערבבים. ברגע הג'ל עורי יש מלנומה spheroids הופכים לגלויים כמו כתמים לבנים.

איור 3 : ערכת בניית דגם organotypic תלת-ממד העור. הסרת רקמת שומן דוגמית העור וחותכים אותו לחתיכות קטנות יותר. הדגירה עם פתרון dispase בין לילה ב 4 ° C מקלה את פרידתה של האפידרמיס הדרמיס. מבודד fibroblasts העיקרי keratinocytes צריך להיות מעובד בנפרד, שימוש בין המעבר 4-6 ו- 3-4, בהתאמה. לאחר מכן, הדור של דגם תלת-ממד העור ניתן להמשיך כמפורט בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : בנייה מחדש של העור 3D organotypic הראה רמה בידול דומה לעור רגיל האנושית. שעוות פרפין קטעי עור מקבילות (א) העור האנושי בהשוואה נורמלי (B) היו מוכתמים עבור הביטוי של keratins 14 (אדום: λ nm_ex 554; λ_em 568 nm) ו- 10, involucrin (ירוק: λ_ex 490 nm; λ_em 525 nm ), filaggrin (ירוק: λ_ex 490 nm; λ_em 525 nm), ו- laminin 5 (ירוק: λ_ex 490 nm; λ_em 525 nm), וניתח עם מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. גרעין התא היו דמיינו מאת דאפי מכתים (כחול: λ_ex 340 ננומטר; λ_em 488 ננומטר). Immunohistochemical בחינת תלת-ממד המלא-עובי העור מקבילות חשף נאות עוריות ריבוד ויוצרים שכבות נפרדות של האפידרמיס, כפי שניתן לראות עור אנושי רגיל. בעוד תאים באפידרמיס בשכבות הנמוכות צבעונית חיובי עבור קרטין 14, יותר הבדיל התאים משכבת הבסיס העל-הראה קרטין 10 involucrin מכתים. תאים מאוד קרוב הקרנית בא לידי ביטוי filaggrin. Laminin 5 מכתים מראה כי פרופריה הבזליים נוצרת להתחבר מבחינה פיזיולוגית של אפידרמיס תא עורי (לוח הנמוך). איור זה נלקח Voersmann. et al. ¹⁵ בעלי הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5 : לא ניתן לחזות את המספר והגודל של מלנומה בנוי באופן ספונטני קנים. היווצרות הקן מלנומה דה נובו בתא עורי עור מלא מקבילות יכולה להיות מושגת על ידי ערבוב מספר מוגדר של מלנומה תאים עם fibroblasts הראשי כדי להטביע את שני סוגי תאים בסוג הקולגן אני מטריקס. ניתן רק לנתח את המספר והגודל של מלנומה בנוי באופן ספונטני קינים של בנייה מחדש עור תלת-ממד מבוגר לאחר כ 21 ימים. כמו שתוארו של שני מדגמים (A) ו- (B), המספרים והגדלים של מלנומה קינים עשויים להשתנות בין בנייה בודדות העור. כתוצאה מכך, זה קשה כדי לאמת את המודלים האלה וגם כדי לחזות את ההשפעה הטיפולית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6 : מלנומה spheroids משולב לתוך העור מקבילות לסכם תכונות מפתח של מלנומה עורית האנושי גרורות. H & E צבעונית פרפין מקטעים של גידול spheroids מוטבע לתוך העור מקבילות חשף spheroids לחלוק תכונות מפתח עם vascularized שאינם מלנומה עורית האנושי גרורות ויוו. Subpopulations שני תאים ניכרים בבירור: subpopulation ההיקפיים מגורים וחדר מרכזי subpopulation בעיקר המורכב מצומק, מוות או תאים עם נמק, ויוצרים את מרכז "נמק". הפיזור של הגידול תא subpopulations מובטחת על ידי גודל ספרואיד. דמות זו שונתה מ. Voersmann et al. ¹⁵ בעלי הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

Organotypic מלנומה ספרואיד עור דגם הציג כאן צווי תובנות חדשות על הבנה עמוקה יותר של אינטרה-tumoral ואינטראקציה הגידול-מארח, ואשר עשוי לספק פלטפורמה סינון מתקדם כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של התפתחות גידולים, ההתנגדות טיפול בעתיד.

כדי להבטיח את הטוב ביותר הפיזיולוגיות ויוו לחקות תנאי העור משחזר, האיכות של התאים הראשי הוא בעל חשיבות עליונה. כאמור לעיל, תאי העור קטין או טרום לידתית להראות בכיתה התמיינות הנמוכה ביותר, לכן המתאימים ביותר ליצור מקבילות מלא-עובי העור. בקרת האיכות אפשרי הראשון הוא מידת התכווצות עורי-יום 2 לאחר זריעה של keratinocytes, equilibrating את הג'ל על EGM (פרוטוקול סעיפים 8.2 ו- 8.3). ג'לים עורי יתכווץ ביותר עם האיכות הטובה ביותר של fibroblasts. כמו כן, השילוב של fibroblasts מעט מדי או יותר מדי עשוי לפגום עורי להתכווצות כתוצאה מכך הקובץ המצורף באפידרמיס תא עורי. זה בתורו תסכן את הבידול באפידרמיס, כי תהליך זה דורש מקיף צולבות לדבר בין עורי וכן תאים.

האיכות של ראשי תאים תלויה גם באופן ביקורתי את confluency תא, כמו גם המעבר של התאים. אם keratinocytes הם מגדלים כדי ≥80% confluency הם מיד להפסיק מתרבים ולהתחיל להבחין. לכן חשוב תרבות אותם כדי confluency 40-70% במהלך passaging, ולהשתמש בהם לא יאוחר מעבר 3-4. Fibroblasts פחות רגישים, אך אין להשתמש מאוחר יותר מאשר מעבר 4-6. אנא שימו לב כי כל ראשי תאים, שורות תאים המשמשת ליצירת organotypic מלנומה ספרואיד העור מודלים מתורבתים בחינם של אנטיביוטיקה, ולכן הסיכון לזיהום הוא גבוה. עם זאת, התוספת של אנטיביוטיקה משנה את הפיזיולוגיה של תאים נפרדים, ולפיכך מפחית את טיב המקבילים העור.

באופן כללי, הגידול ספרואיד היווצרות אפשרי מפני כמעט כל מיני שורות תאים סרטניים וגם מתאי הגידול מבודד טריים מן החומר המטופל. תא הראשונית מספר ו/או טיפוח הזמן להשגת גדלים ספרואיד אופטימלית עשוי להשתנות בהתאם לסוג התא המשמש. עד גודל של 150-200 מיקרומטר, כל התאים הכלולים ספרואיד יכול עדיין מספיק להנתן עם חומרים מזינים באמצעות דיפוזיה פשוטה. רק spheroids עם גדלי ≥500 מיקרומטר להראות דרגת התמיינות גבוהה ומייצגים תכונות אופייניות של רקמת הגידול הלא-vascularized²².

Organotypic מלנומה-ספרואיד-העור-המודל פותח כאן זה מתאים במיוחד ללמוד אינטראקציות הגידול-פונדקאי ועבור בדיקות תחת in vivoסמים מלנומה-כמו תנאים¹⁵. . עדיין, הסביבה של מלנומה ויוו הוא אפילו יותר מורכב, מחסה מגוון רחב של סוגי תאים סרטניים הקשורים, כולל תאים חיסוניים ותאי אנדותל. מאז התוספת של נאות תאים חיסוניים הראשי פונה בעיות histocompatibility, מודלים אלה עדיין אינם מסוגלים לעקוב כראוי אחר גישות טיפוליות-החיסון.

ובכל זאת, מלנומה spheroids יכול להיווצר מחומר מבודד טרי החולה, ברגע כלול בתוך בנייה מחדש עור מלא, עשוי לשמש סמים בודדים הקרנת פלטפורמות. גם השילוב של חתיכות של גרורות סרטן העור לתוך העור בנייה הוא מתקבל על הדעת לנסות שילובים תרופתיים בגישה טיפולית מותאמת. כולל דגם העור מלנומה organotypic התלת-ממד בבדיקת פרה סביר להבטיח כי רק המבטיחים ביותר הרומן טיפולית המושגים נלקחים קדימה ניסויים קליניים, ובכך להקטין את השחיקה של טיפולים פוטנציאליים חדשים בשביל זה המחלה, הגדלת שיעור ההצלחה הטיפולית בניסויים קליניים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
fetal serum albumin (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270106	add 10 % to cell culture medium
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	1X dilute in PBS
RPMI	Thermo Fisher Scientific	61870010	for cultivation of melanoma cell lines
DMEM	Thermo Fisher Scientific	41965062	for cultivation of primary fibroblasts
Dispase	Gibco life technologies	17105041	2U/ml, dissolve in PBS
Collagen type I	BD Biosciences	354249	usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml
24-well inserts Nunclon	Nunc	140629	8 µm pore size; use standing, not hanging inserts!
cell strainer	BD Falcon	352360	yellow
Gentamycine	Thermo Fisher Scientific	15750060	dissolve in PBS
Keralife keratincyte medium	Cell Systems		do not add FCS or antibiotics
Collagenase	SERVA	17454	NB4 standard grade
juvenile human keratinocytes	Cell Systems	FC-0007	alternative to own preparation from juvenile foreskin
juvenile human fibroblasts	Cell Systems	FC-0001	alternative to own preparation from juvenile foreskin
DMEM [+] 4,5 g/l Glucose, [+] L- Glutamine, [-] L- Pyruvate	Gibco life technologies	41965	mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium;          mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine	Gibco life technologies	21765-029	add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15)
EGF	Gibco life technologies	13247-051	add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium
Calcium chloride	Merck Chemicals	2381	add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium
Selenic acid	Alfa Aesar	18851	add 53 nM for the generation of EGM and MM medium
Insulin	Lilly	HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml	add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E-0135	add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
P-Ethanolamine	Sigma-Aldrich	P-0503	add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
Holo-Transferrine	Sigma-Aldrich	T-0665	add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Triiodthyronine	Sigma-Aldrich	T-6397	add 20 pM for the generation of EGM and MM medium
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-088816	add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	add 10 nM only for the generation of EGM medium
Hepes	Sigma-Aldrich	H-3784	add 15 mM for the generation of EGM and MM medium
Serine	Sigma-Aldrich	S-4311	add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
Cholinchloride	Sigma-Aldrich	C-7017	add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium
dFCS	Sigma-Aldrich	F-0392 Lot 086K0361	add 2 % for the generation of EGM and MM medium
Adenine	Sigma-Aldrich	A-9795	add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium
L-Glutamine	PromoCell	C-42209	add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium
Strontiumchloride	Sigma-Aldrich	255521	add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
anti cytokeratin 10 antibody	Dako	M7002	1:50
anti cytokeratin 14 antibody	Santa Cruz	sc-53253	1:200
anti laminin 5 antibody	Santa Cruz	sc-32794	1:50
anti filaggrin antibody	Thermo Fisher Scientific	MA5-13440	1:50
anti involucrin antibody	Acris Antibodies	AM33368PU	1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled	LifeSpan Biosciences	LS-C153907	1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled	Jackson Immuno Research	115-165-003	1:1000
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	1:100