Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم نهجاً مفصلاً لأداء مجموعة اللعاب، بما في ذلك القصبة الهوائية مورين وعزل الغدد اللعابية الرئيسية الثلاثة.

Abstract

ويلاحظ هيبوساليفاتيون عادة في رد فعل المناعة الذاتية سيورغن لمرض أو الإصابة الإشعاع التالية الغدد اللعابية الرئيسية. وفي هذه الحالات، تظل الأسئلة المتعلقة بمنشأ المرض والتدخلات الفعالة. أسلوب أمثل الذي يتيح تقييم وظيفي في الغدد اللعابية لا تقدر بثمن للتحقيق في البيولوجيا إفرازات الغدة والخلل الوظيفي، والمداواة. نقدم هنا، اتباع نهج خطوة بخطوة لأداء pilocarpine وحفز إفراز اللعاب، بما في ذلك القصبة الهوائية وتشريح الغدد اللعابية مورين الرئيسية الثلاثة. ونحن أيضا بالتفصيل تشريح الرأس والعنق مورين المناسبة الوصول إليها من خلال هذه التقنيات. وهذا النهج للتحجيم، مما يسمح للفئران متعددة بحيث تتم معالجتها في وقت واحد، وبالتالي تحسين كفاءة سير العمل. أننا نهدف إلى تحسين إمكانية تكرار نتائج هذه الطرق، كل منها على زيادة التطبيقات في هذا المجال. بالإضافة إلى جمع اللعاب، ونحن نناقش المقاييس للتحديد الكمي وتطبيع القدرة الوظيفية لهذه الأنسجة. ترفق بيانات تمثيلية من الغدد اللهاة مع وظيفة الغدة اللعابية الاكتئاب 2 أسابيع بعد الإشعاع هورمونات (4 جرعات غراي 6.85).

Introduction

وتشمل اضطرابات الغدة اللعابية المتلازمات dysregulated أو إعاقة إفراز مما يؤدي إلى الإفراط في الإنتاج (سيالورهيا) أو قصور الإنتاج (جفاف الفم وهيبوساليفيشن) من اللعاب1. وفي كلتا الحالتين، هناك مصلحة في تحسين فهمنا للبيولوجيا الغدة اللعابية نحو الهدف النهائي للتنمية العلاجية2.

الغدد اللعابية هي أجهزة راديوسينسيتيفي عالية، وغالباً ما تلف أثناء الأشعة سرطان الرأس والرقبة، مما يؤدي إلى جفاف الفم الدائم (جفاف الفم)3،4. خلافا لغيرها من الأنسجة راديوسينسيتيفي، بيد الغدة اللعابية معدل دوران منخفض نسبيا، وهو إليه فقدان الافرازية غير مفهومة5،6. في هذا الإعداد إصابة فريدة من نوعها، تتطلب استراتيجيات التجديد وتصاحبها الأنسجة اللعابية التقييم الوظيفي. تجريبيا، جمع اللعاب مورين أداة قيمة للغاية في تقييم استجابة الغدة للإشعاع والعوامل العلاجية.

نقدم هنا، أسلوب أداء وتحديد كمية إفراز اللعاب حفز استخدام pilocarpine، مؤثر المسكارينيه قوية7. بيلوكاربيني يحفز الجهاز العصبي اللاإرادي للحث على إفراز الغدة،من89. لإكمال هذا الاختبار على نحو ملائم، مطلوب القصبة الهوائية ضمان احتفاظ الماوس مجرى الهواء براءات الاختراع طوال فترة الإجراءات، والحد من مخاطر الاختناق وتطلع من إفرازات المجمعة في تجويف الفم10.

هذا إجراء المحطة طرفية، التي توجت بإزالة الغدد اللعابية الرئيسية الثلاثة: النكفية (PG) واللهاة (SMG)، وتحت اللسان (SLG). للدراسات الفنية، وتسجل الأوزان الغدة وغالباً ما تستخدم لتطبيع اللعاب قياس11،،من1213. بيانات هذا مهم بشكل خاص في دراسات الإشعاع، ضمور الغدة فيه نتيجة المتوقعة14،15

هناك تقلب في الأدب فيما يتعلق بكيفية حفز إفراز اللعاب تتم وذكرت16. على سبيل المثال، بيلوكاربيني جرعات داخل الأدب تمتد على الأقل ثلاثة أوامر من حجم17،18،19،20،21،،من2223. نقدم هنا، بروتوكولا pilocarpine جرعة عالية أمثل بقصد تحسين إمكانية تكرار نتائج في أسلوب التنفيذ، فضلا عن توفير منصة معيارية للتقنيات (القصبة الهوائية وجمع اللعاب وتشريح الغدة) التي يمكن تكييفها حسب هناك حاجة.

بالإضافة إلى بروتوكول المظاهرة، نقوم بتضمين بيانات وظيفية تمثيلية من تدفق اللعاب في 2 أسابيع بعد الإشعاع هورمونات (4 جرعات غراي 6.85) إلى منطقة SMG.

Protocol

كافة في فيفو الإجراءات المبينة أدناه بموافقة "اللجنة الجامعة" على "الموارد الحيوانية" في جامعة روتشستر، روتشستر. NY.

1-إعداد

  1. استخدام رصيد التحليلي، تزن 20 ملغ بيلوكاربيني. حله في 2 مل من المحلول الملحي المعقم في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
    ملاحظة: نظراً لأن بيلوكاربيني هي حساسة للضوء، ويفقد النشاط مع مرور الوقت، هذا الحل ينبغي على استعداد اليوم للحقن، ومحمية من الضوء حتى تدار.
  2. استخدام رصيد التحليلي، وزن وتحديد جميع أنابيب جمع والزجاج الشعيرات الدموية. يجب أن يطابق عدد الشعيرات الزجاجية وأنابيب جمع عدد الفئران.

2-القصبة الهوائية

  1. وزن فئران C57/BL6 استخدام رصيد التحليلي.
  2. استخدام المحاقن 0.5 مل مع 29 x ½ "إبرة، تخدير الفئران مع إينترابيريتونيلي حقن المحلول الملحي عقيمة من 100 مغ/كغ xylazine الكيتامين و 10 مغ/كغ. للانتقال إلى الخطوة التالية عند الماوس لم يعد يستجيب للمحفزات (أي غياب منعكس سحب دواسة)، الذي يحدث عادة في غضون 5 إلى 10 دقيقة بعد الحقن.
  3. بعد الاستغناء عن مواد التشحيم على قضيب القطن ذات الرؤوس، تنطبق على عيون بلطف وضع الماوس في موقف ضعيف في المرحلة. يجب أن يبقى هذا الحيوان أنيسثيتيزيد على السطح الدافئة.
    ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في درجة حرارة الغرفة.
  4. تأمين الآنف وأطرافه، والذيل إلى مرحلة استخدام الشريط الجراحي.
  5. نظيفة ورطبة الرقبة مع مسح الكحول.
    ملاحظة: وهذا سيساعد على منع الفراء من دخول شقوق اللاحقة.
  6. رفع الجلد العنق خط الوسط البطني مع الملقط، جعل قطع صغيرة وسطحية باستخدام مقص تشريح. دليل المقص في فتح وفتح شفرات تحت الجلد لفصل الطائرات الأنسجة ببطء.
  7. الحفاظ على الجلد التي أثيرت، قص بعناية إلى 1 سم تحت الفم.
  8. جعل شقوق جانبية اثنين في جوانب أقل شأنا ومتفوقة أول خطوة من نوعها. برفق باستخدام الملقط، تعكس بعيداً الجلد لتمكين الوصول إلى هياكل الرأس والرقبة.
  9. استخدام مجهر تشريح في 8 X التكبير، تصور في الغدد اللهاة (خط الوسط: الشكل 1).
  10. استخدام الملقط غرامة، أرفع برفق في الغدد لفضح العضلات إينفراهيويد (حزام) أربعة تغمر القصبة الهوائية. تجنب تمزيق أو إفساد المفرج المحيطة أو القنوات مطرح.
  11. إذا كان جمع اللعاب من الماوس واحد أو أكثر، كرر الخطوات 2.1-2.10 مع كل الماوس قبل المتابعة.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ هذا الإجراء يكون بأمان على ما يصل إلى 5 الفئران في نفس الوقت.
  12. مع مقص تشريح الصغيرة، إزالة الجزء الآنسي من عضلات حزام أثناء الإقامة بالقرب من خط الوسط قدر الإمكان. قص إلا قدر الضرورة تصور القصبة الهوائية وإبقاء عضلات حزام من الطريق أثناء الإجراء. تجنب نيكينج أي السفن القريبة لأنه إذا لم يكن هناك نضوب وحدة التخزين الثانوي إلى نزيف كبير، بيلوكاربيني لن تكون فعالة في حفز إفراز.
  13. وتعكس عضلات حزام بعيداً عن القصبة الهوائية.
  14. تصور الحنجرة، القصبة الهوائية، والغدة الدرقية. ضمان واضح تغمر أنسجة القصبة الهوائية.
  15. إجراء شق أفقي في القصبة الهوائية أدنى/الخلفي للغدة الدرقية باستخدام مقص تشريح الصغيرة. تأكد من مجرى الهواء البراءات وواضح من السوائل.

3-اللعاب جمع

  1. قم بإزالة الشريط قرب مرحلة تشريح الفم وزاوية الهبوط (45°، cranially) للمساعدة في تدفق اللعاب.
  2. استخدام المحاقن 0.5 مل مع 29 x ½ "إبرة، إجراء حقن داخل 10 ميليلتر/ز الجسم الوزن pilocarpine لمجموع جرعة مقدارها 100 مغ/كغ.
  3. بدء تشغيل جهاز ضبط وقت. إذا كانت الجرعات الفئران متعددة، خفض المهلة الزمنية التي تتحرك بسرعة، وخلال وجود مساعد في نفس الوقت حقن الفئران المتبقية.
  4. استخدام الملقط القياسية، فتح الفم للوصول إلى الأنبوبة الشعرية.
  5. مرة واحدة ويلاحظ حبة لعاب في الفم، وضع نهاية الأنبوب الشعرية الدانية في السائل، مع نهاية القاصي وضعها في أنبوب جمع المتمركزة أدناه مرحلة تشريح (أنابيب كل وزنه مسبقاً).
    ملاحظة: في فئران C57/BL6 الإناث 6-10 أسابيع عمر، اللعاب الإجمالي يحدث داخل 2 دقيقة لحقن بيلوكاربيني.
  6. إذا كان بناء في الفم اللعاب، ولكن لا تتدفق من خلال الأنبوب، ريتيمبت الخطوة السابقة. التأكد من أنه لم يتم وضع الأنبوب مباشرة ضد سطح مخاطية، التي يمكن أن تعيق المدخل.
  7. جمع اللعاب لما مجموعة 12 دقيقة بعد التحفيز بيلوكاربيني. ضمان بقاء ستوما واضحة.
    ملاحظة: زيادة في حجم المد وافرازات (اللعابية والبول والبراز) طبيعية خلال هذا الوقت.
  8. إذا كانت الفئران قد الاكتئاب وظيفة اللعاب (مثلاً.، بسبب الإصابات أو التدخل)، نقل السوائل المتبقية من الفم إلى أنبوب جمع استخدام ميكروبيبيتي P200. إذا جمع من الفئران متعددة، تأكد من أن يتم تغيير نصائح.
  9. تسجيل الوزن تجمع اللعاب بالإضافة إلى أنابيب 12 دقيقة بعد الحقن بيلوكاربيني.

4. تشريح الغدة

  1. Euthanize الفئران بالقتل الرحيم2 CO (كما هو موضح في المبادئ "التوجيهية وبرايتون" "القتل الرحيم للحيوانات": طبعة عام 2013) تليها thoracotomy، مع الحرص على الحفاظ على الهياكل للرأس والرقبة. ولهذا السبب، تجنب التفكك عنق الرحم كأسلوب للقتل الرحيم.
  2. ضع الماوس في موقف ضعيف في المرحلة. تغيير موضع الغدد في الموقع الأصلي من خلال القصبة الهوائية (الشكل 1).
  3. استخدام مجهر تشريح تحت 8 X التكبير، تصور في الغدد الرئيسية: PG و SMG SLG. التمييز بين الغدد خلال التشريح، تحديد أن فريق البرمجة منتشر، الكذب الأفقي إلى SMG و SLG.
    ملاحظة: إذا كان تشريح في PG، ينبغي أن يتم هذا أولاً لأنها محددة بالاقل والأكثر احتمالاً أن تكون ممزقة.
  4. فهم ذيل الغرام بالملقط، سحبه بعيداً عن الهياكل الأساسية، وتطبيق بلطف التوتر قبل قطع رأس PG مع تشريح المقص.
  5. خرق الكبسولة المحيطة جيه استخدام الملقط. فصل SMG اليسرى واليمنى بلطف.
  6. مجاناً الجانب الظهرية من SMG من الأنسجة نونجلاندولار التقيد بها باستخدام الملقط.
  7. إزالة إس أم جي من الرقبة بالرسم لاصق في وارتون مشدود مع الملقط وقطع القناة مع تشريح المقص.
  8. بلطف منفصلاً في SLG SMG استخدام الملقط.
    ملاحظة: SLG في الجانب سوبيرولاتيرال من إس أم جي.
  9. باستخدام رصيد تحليلية، تسجيل الأوزان إس أم جي.

النتائج

عند أداء pilocarpine جرعة عالية حفزت جمع اللعاب، من المهم الحفاظ على مجرى الهواء لمنع تطلع أو الاختناق من إفرازات في تجويف الفم. ويرد تخطيطي للقصبة الهوائية (الشكل 1). عقب شق القصبة الهوائية، يجب أن تظل ستوما واضحة من الأنسجة والسوائل.

Discussion

نحن نقدم طريقة متعددة الخطوات لتقييم وظيفة الغدة اللعابية، والتي يمكن تطبيقها على دراسة إصابة الغدة والمداواة. ويشمل الإجراء لدينا القصبة الهوائية وجمع اللعاب وتشريح الغدة، كل منها له التطبيقات التجريبية التي يمكن أن تدعم إجراء دراسة متكاملة للبيولوجيا الغدة اللعابية. على سبيل المثال، ...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

البحث عنها في هذا المنشور أيده "المعهد الوطني للأسنان" والجمجمة البحوث (NIDCR) ومعهد السرطان الوطني (NCI) من "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة عدد R56 DE025098 و UG3 DE027695 و F30 CA206296. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة". كما أيد هذا العمل 1206219 هيئة الهجرة واللاجئين في جبهة الخلاص الوطني والابتكار IADR في "منح الرعاية عن طريق الفم" (2016).

ونود أن نشكر الدكتور Eri ماروياما وأندرو هولومون لمساعدتها مع جمع اللعاب. نود أن نشكر "ونغ" Lun بي لمساعدته مع تشريح الغدة. نود أن نشكر اينغلس ماثيو لمساعدته في إعداد الشكل. ونود أن نشكر الدكتور الين سمولوك واميلي وو لقراءة نقدية لهذه المخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Pilocarpine hydrochlorideSigma AldrichP6503Pilocarpine
Student Vannas Spring ScissorsFine Science Tools91500-9Spring Scissors for Tracheostomy
Sterile Saline SolutionMedlineRDI30296HSaline
Dumont #7 ForcepsFine Science Tools11274-20Curved Forceps
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-10Straight Forceps
Standard Pattern ForcepsFine Science Tools11000-12Blunt Forceps
Fine Scissors- Tungsten CarbideFine Science Tools14568-09Dissection Scissors
Microhematocrit Heparinized Capillary TubesFisher Scientific22362566Capillary tubes
Lubricant Eye OintmentRefreshN/ARefresh Lacri-Lube
Goat polyclonal anti-Nkcc1Santa Cruz BiotechSC-21545Nkcc1 Antibody
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306DAPI
GraphPad PrismGraphPadver6.0Statistical Software
Cotton tipped applicatorMedlineMDS202000Applicator for eye ointment
0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2"BD7629Syringe for intraperitoneal injection

References

  1. Bradley, P., O'Hara, J. Diseases of the salivary glands. Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).
  2. Fox, P. C. Salivary enhancement therapies. Caries Research. 38 (3), 241-246 (2004).
  3. Konings, A. W. T., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
  4. Burlage, F. R., Coppes, R. P., Meertens, H., Stokman, M. A., Vissink, A. Parotid and submandibular/sublingual salivary flow during high dose radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. 61 (3), 271-274 (2001).
  5. Aure, M. H., Konieczny, S. F., Ovitt, C. E. Salivary gland homeostasis is maintained through acinar cell self-duplication. Developmental Cell. 33 (2), 231-237 (2015).
  6. Aure, M. H., Arany, S., Ovitt, C. E. Salivary Glands: Stem Cells, Self-duplication, or Both?. Journal of Dental Research. 94 (11), 1502-1507 (2015).
  7. Ono, K., et al. Distinct effects of cevimeline and pilocarpine on salivary mechanisms, cardiovascular response and thirst sensation in rats. Archives of Oral Biology. 57 (4), 421-428 (2012).
  8. Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neuroscience. 133 (1), 3-18 (2007).
  9. Nezu, A., Morita, T., Tojyo, Y., Nagai, T., Tanimura, A. Partial agonistic effects of pilocarpine on Ca(2+) responses and salivary secretion in the submandibular glands of live animals. Experimental Physiology. 100 (6), 640-651 (2015).
  10. Urita, Y., et al. Rebamipide and mosapride enhance pilocarpine-induced salivation. North American Journal of Medical Sciences. 1 (3), 121-124 (2009).
  11. Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
  12. Kondo, Y., et al. Functional differences in the acinar cells of the murine major salivary glands. Journal of Dental Research. 94 (5), 715-721 (2015).
  13. Evans, R. L., et al. Severe impairment of salivation in Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1)-deficient mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 26720-26726 (2000).
  14. Delanian, S., Lefaix, J. L. The radiation-induced fibroatrophic process: therapeutic perspective via the antioxidant pathway. Radiotherapy and Oncology. 73 (2), 119-131 (2004).
  15. Guchelaar, H. J., Vermes, A., Meerwaldt, J. H. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, clinical course and supportive treatment. Support Care Cancer. 5 (4), 281-288 (1997).
  16. Lin, A. L., et al. Measuring short-term γ-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Archives of Oral Biology. 46 (11), 1085-1089 (2001).
  17. Montenegro, M. F., et al. Profound differences between humans and rodents in the ability to concentrate salivary nitrate: Implications for translational research. Redox biology. 10, 206-210 (2016).
  18. Choi, J. S., Park, I. S., Kim, S. K., Lim, J. Y., Kim, Y. M. Morphometric and Functional Changes of Salivary Gland Dysfunction After Radioactive Iodine Ablation in a Murine Model. Thyroid. 23 (11), 1445-1451 (2013).
  19. Imamura, T. K., et al. Inhibition of pilocarpine-induced saliva secretion by adrenergic agonists in ICR mice. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 39 (12), 1038-1043 (2012).
  20. Ma, T., et al. Defective Secretion of Saliva in Transgenic Mice Lacking Aquaporin-5 Water Channels. Journal of Biological Chemistry. 274 (29), 20071-20074 (1999).
  21. Parkes, M. W., Parks, J. C. Supersensitivity of salivation in response to pilocarpine after withdrawal of chronically administered hyoscine in the mouse. British Journal of Pharmacology. 46 (2), 315-323 (1972).
  22. Nishiyama, T., et al. Up-Regulated PAR-2-Mediated Salivary Secretion in Mice Deficient in Muscarinic Acetylcholine Receptor Subtypes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 320 (2), 516 (2007).
  23. Yang, B., Song, Y., Zhao, D., Verkman, A. S. Phenotype analysis of aquaporin-8 null mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 288 (5), C1161-C1170 (2005).
  24. Kamiya, M., et al. X-Ray-Induced Damage to the Submandibular Salivary Glands in Mice: An Analysis of Strain-Specific Responses. BioResearch Open Access. 4 (1), 307-318 (2015).
  25. Patel, R. M., Varma, S., Suragimath, G., Zope, S. Estimation and Comparison of Salivary Calcium, Phosphorous, Alkaline Phosphatase and pH Levels in Periodontal Health and Disease: A Cross-sectional Biochemical Study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 10 (7), ZC58-ZC61 (2016).
  26. Droebner, K., Sandner, P. Modification of the salivary secretion assay in F508del mice--the murine equivalent of the human sweat test. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 630-637 (2013).
  27. Lamy, E., et al. Changes in mouse whole saliva soluble proteome induced by tannin-enriched diet. Proteome Science. 8 (1), 65 (2010).
  28. Mahomed, F. Recent advances in mucin immunohistochemistry in salivary gland tumors and head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 47 (9), 797-803 (2011).
  29. Kohlgraf, K. G., et al. Quantitation of SPLUNC1 in saliva with an xMAP particle-based antibody capture and detection immunoassay. Archives of Oral Biology. 57 (2), 197-204 (2012).
  30. Maimets, M., Bron, R., de Haan, G., van Os, R., Coppes, R. P. Similar ex vivo expansion and post-irradiation regenerative potential of juvenile and aged salivary gland stem cells. Radiotherapy and Oncology. , (2015).
  31. Lombaert, I. M., et al. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. PLoS One. 3 (4), e2063 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved