Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz tükürük toplama, fare trakeostomi ve üç büyük tükürük bezleri yalıtımı da dahil olmak üzere performans detaylı bir yaklaşım sunuyoruz.

Özet

Hyposalivation otoimmün reaksiyon Sjoegren Sendromu veya aşağıdaki radyasyon hasarı büyük tükürük bezleri için yaygın olarak görülmektedir. Bu gibi durumlarda, hastalığın patogenezinde ve etkili müdahaleler ile ilgili sorular kalır. Ekzokrin bezi biyoloji, disfonksiyon ve tedavi soruşturma için çok değerli tükürük bezlerinin işlevsel değerlendirme sağlar en iyi duruma getirilmiş bir tekniktir. Burada, Pilokarpin gerçekleştirmek için adım adım bir yaklaşım mevcut uyarılmış tükürük salgısı, trakeostomi ve üç büyük fare tükürük bezlerinin diseksiyon dahil olmak üzere. Biz de bu teknikler sırasında erişilen uygun fare baş ve boyun anatomisine ayrıntı. Ölçeklenebilir, böylece iş akışı verimliliği artırmak aynı anda, işlenmek üzere birden çok fareler için izin veren bir yaklaşımdır. Bu yöntemlerin her biri daha fazla alan içinde uygulamaları olan tekrarlanabilirlik geliştirmek hedefliyoruz. Tükürük toplama ek olarak, biz miktarının ve bu dokuların fonksiyonel kapasite normalleştirme için ölçümler tartışıyorlar. Temsilcisi veri 2 hafta fraksiyonlara radyasyon (4 doz 6.85 Gy) takip depresif Tükürük bezi fonksiyonu ile çene bezlerinden dahil edilir.

Giriş

Tükürük bezi bozuklukları sendromlar dysregulated veya Engelli salgı aşırı üretimi (sialorrhea) veya tükürük1eksik (xerostomia ve hyposalivation) içerir. Her iki durumda da, terapötik geliştirme2sonu hedefi doğru Tükürük bezi biyoloji anlayışımız iyileştirilmesi bir ilgi vardır.

Tükrük bezleri son derece radiosensitive organları ve genellikle kalıcı ağız kuruluğu (xerostomia)3,4' e lider baş ve boyun kanser radyoterapi sırasında hasar. Radiosensitive diğer dokular, aksine Ancak, Tükürük bezi Ciro oranı nispeten düşüktür ve salgı kaybı kötü anlaşılan5,6mekanizmadır. Bu benzersiz yaralanma ayarında doku rejenerasyonu ve radioprotection stratejileri tükürük işlevsel değerlendirme gerektirir. Deneysel, fare tükürük toplama radyasyon ve terapötik ajanlar bezi cevaben değerlendirilmesinde özellikle değerli bir araçtır.

Burada, performans ve uyarılmış tükürük salgısı Pilokarpin, güçlü muscarinic agonist7kullanarak miktarının bir yöntem mevcut. Pilokarpin bezi salgısının8,9ikna etmek için otonom sinir sistemini uyarır. Bu test uygun şekilde tamamlamak için bir trakeostomi fareyi bir patent hava yolu yordamı boyunca tutar emin olmak için ve boğulma ve aspirasyon biriken salgıları ağız boşluğu10üzerinden riskleri azaltmak için gereklidir.

Bu üç büyük tükürük bezleri kaldırılmasına sonuçlanan bir terminal, bir uygulamadır: parotid (PG), çene (SMG) ve hapı (SLG). Fonksiyonel çalışmalar, bezi ağırlık kaydedilir ve tükürük ölçüm11,12,13normalleştirmek için sıklıkla kullanılır. Bu veriler, neyin bezi Atrofi beklenen sonucu14,15 yaşında radyasyon çalışmalarda, özellikle önemlidir

Edebiyat nasıl uyarılmış tükürük salgısı açısından değişkenlik gerçekleştirilir ve16bildirdi. Örneğin, edebiyat yayılma alanı en az üç büyüklük17,18,19,20,21,22,23içinde doz Pilokarpin. Burada, bir en iyi duruma getirilmiş yüksek doz Pilokarpin protokolü ile yöntem yürütme hem teknikleri olarak adapte edilebilir (trakeostomi, tükürük toplama ve bezi diseksiyon) modüler bir platform sağlayan geliştirilmiş tekrarlanabilirlik amacıyla mevcut ihtiyacım vardı.

İletişim kuralı gösteri ek olarak 2 hafta fraksiyonlara radyasyon (4 doz 6.85 Gy) SMG bölgesine takip tükürük akışı temsilcisi fonksiyonel verileri içerir.

Protokol

Aşağıda verilen tüm vivo içinde yordamlar hayvan kaynakları, Rochester Üniversitesi, Rochester Üniversitesi Komitesi tarafından kabul edildi. NY.

1. hazırlık

  1. Bir analitik denge kullanarak, 20 mg Pilokarpin tartın. 2 ml steril serum microcentrifuge tüp içinde çözülür.
    Not: Pilokarpin ışığa duyarlı olduğunu ve zaman içinde etkinliğini kaybeder çünkü bu çözüm enjeksiyon gününün hazırlıklı olup yönetilen kadar ışıktan korunan.
  2. Bir analitik denge kullanarak, tartmak ve tüm koleksiyon tüpler ve cam kılcal tanımlayın. Koleksiyon tüpler ve cam kılcal fareler sayısı eşleşmelidir.

2. trakeostomi

  1. C57/BL6 fareler bir analitik denge kullanarak tartın.
  2. 0.5 mL 29G x ½" iğne ile kullanarak, fareler 100 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg xylazine intraperitoneally enjekte bir steril serum fizyolojik solüsyonu ile anestezi. Fareyi artık genellikle 5-10 dk içinde enjeksiyon takip oluşur (Yani yokluğu pedal çekilme refleks), uyaranlara yanıt verdiğinde aşağıdaki adıma geçin.
  3. Pamuk uçlu aplikatör üzerinde yağ dağıtımı sonra yavaşça gözlerini uygulamak ve fare sırtüstü pozisyonda Sahne Alanı'nda yer. İmzalat hayvan sıcak yüzey üzerinde tutulmalıdır.
    Not: Oda sıcaklığında tüm adımlar gerçekleştirilir.
  4. Burun, bacaklarda ve kuyruk cerrahi bant kullanarak sahne için güvenli.
  5. Temiz ve boyun bir alkol bezle ıslak.
    Not: Bu kürk sonraki insizyon girmesini önlemeye yardımcı olur.
  6. Ventral orta hat boyun deri Forseps ile yükselterek, diseksiyon makası kullanarak bir küçük, yüzeysel kesim yapmak. Makas içine açılış kılavuz ve subkutan doku uçaklar ayırmak için bıçaklar yavaş açılıyor.
  7. Kaldırdı cilt tutulması, dikkatle ağız aşağıda 1 cm kesin.
  8. İki yanal insizyon ilk kesim düşük kaliteli ve üstün yönleri olun. Forseps kullanarak, yavaşça uzakta baş ve boyun yapılarına erişim sağlamak için cilt yansıtmak.
  9. 8 X büyütme oranında diseksiyon mikroskop kullanarak görselleştirmek submandibular bezleri (orta hat: şekil 1).
  10. İyi forseps kullanarak, bezleri Trakea örten dört infrahyoid (Askı) kasları ortaya çıkarmak için yavaşça kaldır. Yırtılma veya çevre damarlara veya boşaltım kanallarını engellemeden kaçının.
  11. Birden fazla fare tükürük toplama, adımları 2.1-2,10 her fare ile devam etmeden önce işlemini yineleyin.
    Not: Bu yordam güvenli bir şekilde en fazla 5 fareler aynı anda gerçekleştirilebilir.
  12. Küçük parçalara makasla kayış kasları medial kısmı kalırken orta hat gibi mümkün olduğunca yakın kaldırın. Sadece nefes borusu görselleştirmek ve kayış kasları yoldan işlem sırasında tutmak gerektiği kadar kesti. Önemli kanama için ikincil birim tükenmesi ise Pilokarpin salgı inducing etkili olmayacağı için herhangi bir yakın gemi nicking kaçının.
  13. Trakea uzak kayış kasları yansıtır.
  14. Larinks, trakea ve tiroid bezi görselleştirin. Trakea doku örten açık olduğundan emin olun.
  15. Yatay bir kesi borusunda inferior/arka küçük diseksiyon makası kullanarak tiroid olun. Hava yolu patent ve sıvı açık olduğundan emin olun.

3. tükürük toplama

  1. Ağız ve açı diseksiyon sahne aşağı yakınındaki bandı çıkarın (45°, cranially) tükürük akışı ile yardımcı olmak için.
  2. 0.5 mL 29G x ½" iğne ile kullanarak, 10 µL/g vücut ağırlığı Pilokarpin mayi enjeksiyon toplam doz 100 mg/kg için gerçekleştirin.
  3. Bir sayacı başlatmak. Birden çok fareler dozaj hızlı hareket ve aynı anda kalan fareler enjekte bir asistan sahip sağlama süresini azaltın.
  4. Standart forseps kullanarak, kılcal tüp erişim için ağzını aç.
  5. Tükürük bir boncuk ağızda görülmektedir kez proksimal sonuna kılcal tüp distal ucu diseksiyon sahne (önceden tartılır her iki tüpler) altında konumlandırılmış bir toplama tüp içine yerleştirilmiş olan sıvı yerleştirin.
    Not: C57/BL6 dişi farelerde 6-10 hafta-in yaş, brüt salya Pilokarpin enjeksiyon 2 dk içinde oluşur.
  6. Tükürük ağız bina ancak tüpten akan değil, önceki adımı deneyin. Tüp giriş engel doğrudan bir Mukozal yüzey karşı yerleştirilmez emin olun.
  7. Tükürük toplam 12 dk Pilokarpin stimülasyon takip toplamak. Ağzının açık kalmasını sağlamak.
    Not: Bu dönemde artan gelgit hacmi ve salgıları (tükürük, idrar, dışkı) normaldir.
  8. Fareler tükürük işlevi depresif Eğer (örn., yaralanma veya müdahale nedeniyle), kalan sıvı P200 micropipette kullanarak toplama tüp ağzından aktarmak. Birden çok fareler toplama ipuçları değiştirilir olun.
  9. Kayıt toplanan tükürük artı borular Pilokarpin enjeksiyon sonra 12 dk ağırlığı.

4. bezi diseksiyon

  1. Fareler CO2 ötenazi tarafından ötenazi (ötenazi hayvanlar için travma kurallarda açıklandığı gibi: 2013 Edition) baş ve boyun yapıları korumak için dikkat çekici Torakotomi tarafından takip. Bu nedenle, ötenazi servikal çıkık bir yöntem olarak kaçının.
  2. Fare, Sahne Alanı'nda bir sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Bezleri özgün sitedeki Trakea (şekil 1) yeniden konumlandırın.
  3. Diseksiyon mikroskop altında 8 X büyütme, kullanarak görselleştirmek büyük bezleri: PG, SMG ve SLG. Bezlerinin diseksiyon sırasında ayırt etmek için SMG ve SLG yanal yalan PG diffüz, tanımlayın.
    Not: az tanımlanmış ve parçalanmış olması büyük olasılıkla çünkü PG anatomi, önce yapılması gerekir.
  4. Forseps, temel yapılarını uzak çekerek ile PG kuyruğunun kavramak ve yavaşça gerginlik makas diseksiyon ile PG kafa kesme önce uygulayın.
  5. İhlali forseps kullanarak SMGs çevreleyen kapsül. Yavaşça sol ve sağ SMG ayırın.
  6. Forseps kullanarak yapıştırılan nonglandular dokusundan SMG dorsal yönünü ücretsiz.
  7. SMG boynundan Wharton'ın kanal gergin Forseps ile çizerek ve makas diseksiyon ile kanal kesme kaldırın.
  8. Yavaşça SLG forseps kullanarak SMG ayırın.
    Not: SMG superolateral yönü SLG var.
  9. Analitik bir denge, kayıt SMG ağırlıkları kullanarak.

Sonuçlar

Yüksek doz Pilokarpin gerçekleştirme tükürük toplama uyardığında, aspirasyon önlemek için hava yolu korumak önemli veya oral kavite içinde salgıları den boğulma. Trakeostomi şematik (şekil 1) sağlanır. Trakeal kesi, stoma doku ve sıvı açık kalmalıdır.

Kılcal eylem tükürük toplama sırasında geliştirmek için fare başlarını aşağıya doğru 45 ° açıyla yerleşti...

Tartışmalar

Biz bezi yaralanma ve tedavi uygulanan Tükürük bezi işlevi değerlendirmek için multistep bir yöntem mevcut. Bizim yordamı trakeostomi, tükürük toplama ve bezi diseksiyon, her biri bir tümleşik çalışma Tükürük bezi Biyoloji destekleyen deneysel uygulamaları sahip içerir. Örneğin, fare trakeostomi ağız boşluğu tıkayan işlemler sırasında genel hava yolu yönetimi için kullanılmıştır.

Uygun diseksiyon ve trakeal kesi Pilokarpin için gerekli teşvik tükürük s...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu yayında bildirilen araştırma diş Ulusal Enstitüsü ve Fasiyal araştırma (NIDCR) ve ulusal sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R56 DE025098, UG3 DE027695 ve F30 CA206296 altında Ulusal Kanser Enstitüsü (ncı) tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor. Bu eser de NSF DMR 1206219 ve IADR yenilik Oral bakım Ödülü (2016) tarafından desteklenmiştir.

Dr. Eri Maruyama ve Andrew Hollomon tükürük koleksiyonu ile yardım için teşekkür etmek istiyorum. Pei-Lun Weng bezi diseksiyon ile yaptığı yardım için teşekkür etmek istiyorum. Matthew Ingalls şekil hazırlık yaptığı yardım için teşekkür etmek istiyorum. Dr. Elaine Smolock ve Emily Wu bu el yazması eleştirel okuma için teşekkür etmek istiyorum.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Pilocarpine hydrochlorideSigma AldrichP6503Pilocarpine
Student Vannas Spring ScissorsFine Science Tools91500-9Spring Scissors for Tracheostomy
Sterile Saline SolutionMedlineRDI30296HSaline
Dumont #7 ForcepsFine Science Tools11274-20Curved Forceps
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-10Straight Forceps
Standard Pattern ForcepsFine Science Tools11000-12Blunt Forceps
Fine Scissors- Tungsten CarbideFine Science Tools14568-09Dissection Scissors
Microhematocrit Heparinized Capillary TubesFisher Scientific22362566Capillary tubes
Lubricant Eye OintmentRefreshN/ARefresh Lacri-Lube
Goat polyclonal anti-Nkcc1Santa Cruz BiotechSC-21545Nkcc1 Antibody
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306DAPI
GraphPad PrismGraphPadver6.0Statistical Software
Cotton tipped applicatorMedlineMDS202000Applicator for eye ointment
0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2"BD7629Syringe for intraperitoneal injection

Referanslar

  1. Bradley, P., O'Hara, J. Diseases of the salivary glands. Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).
  2. Fox, P. C. Salivary enhancement therapies. Caries Research. 38 (3), 241-246 (2004).
  3. Konings, A. W. T., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
  4. Burlage, F. R., Coppes, R. P., Meertens, H., Stokman, M. A., Vissink, A. Parotid and submandibular/sublingual salivary flow during high dose radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. 61 (3), 271-274 (2001).
  5. Aure, M. H., Konieczny, S. F., Ovitt, C. E. Salivary gland homeostasis is maintained through acinar cell self-duplication. Developmental Cell. 33 (2), 231-237 (2015).
  6. Aure, M. H., Arany, S., Ovitt, C. E. Salivary Glands: Stem Cells, Self-duplication, or Both?. Journal of Dental Research. 94 (11), 1502-1507 (2015).
  7. Ono, K., et al. Distinct effects of cevimeline and pilocarpine on salivary mechanisms, cardiovascular response and thirst sensation in rats. Archives of Oral Biology. 57 (4), 421-428 (2012).
  8. Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neuroscience. 133 (1), 3-18 (2007).
  9. Nezu, A., Morita, T., Tojyo, Y., Nagai, T., Tanimura, A. Partial agonistic effects of pilocarpine on Ca(2+) responses and salivary secretion in the submandibular glands of live animals. Experimental Physiology. 100 (6), 640-651 (2015).
  10. Urita, Y., et al. Rebamipide and mosapride enhance pilocarpine-induced salivation. North American Journal of Medical Sciences. 1 (3), 121-124 (2009).
  11. Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
  12. Kondo, Y., et al. Functional differences in the acinar cells of the murine major salivary glands. Journal of Dental Research. 94 (5), 715-721 (2015).
  13. Evans, R. L., et al. Severe impairment of salivation in Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1)-deficient mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 26720-26726 (2000).
  14. Delanian, S., Lefaix, J. L. The radiation-induced fibroatrophic process: therapeutic perspective via the antioxidant pathway. Radiotherapy and Oncology. 73 (2), 119-131 (2004).
  15. Guchelaar, H. J., Vermes, A., Meerwaldt, J. H. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, clinical course and supportive treatment. Support Care Cancer. 5 (4), 281-288 (1997).
  16. Lin, A. L., et al. Measuring short-term γ-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Archives of Oral Biology. 46 (11), 1085-1089 (2001).
  17. Montenegro, M. F., et al. Profound differences between humans and rodents in the ability to concentrate salivary nitrate: Implications for translational research. Redox biology. 10, 206-210 (2016).
  18. Choi, J. S., Park, I. S., Kim, S. K., Lim, J. Y., Kim, Y. M. Morphometric and Functional Changes of Salivary Gland Dysfunction After Radioactive Iodine Ablation in a Murine Model. Thyroid. 23 (11), 1445-1451 (2013).
  19. Imamura, T. K., et al. Inhibition of pilocarpine-induced saliva secretion by adrenergic agonists in ICR mice. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 39 (12), 1038-1043 (2012).
  20. Ma, T., et al. Defective Secretion of Saliva in Transgenic Mice Lacking Aquaporin-5 Water Channels. Journal of Biological Chemistry. 274 (29), 20071-20074 (1999).
  21. Parkes, M. W., Parks, J. C. Supersensitivity of salivation in response to pilocarpine after withdrawal of chronically administered hyoscine in the mouse. British Journal of Pharmacology. 46 (2), 315-323 (1972).
  22. Nishiyama, T., et al. Up-Regulated PAR-2-Mediated Salivary Secretion in Mice Deficient in Muscarinic Acetylcholine Receptor Subtypes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 320 (2), 516 (2007).
  23. Yang, B., Song, Y., Zhao, D., Verkman, A. S. Phenotype analysis of aquaporin-8 null mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 288 (5), C1161-C1170 (2005).
  24. Kamiya, M., et al. X-Ray-Induced Damage to the Submandibular Salivary Glands in Mice: An Analysis of Strain-Specific Responses. BioResearch Open Access. 4 (1), 307-318 (2015).
  25. Patel, R. M., Varma, S., Suragimath, G., Zope, S. Estimation and Comparison of Salivary Calcium, Phosphorous, Alkaline Phosphatase and pH Levels in Periodontal Health and Disease: A Cross-sectional Biochemical Study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 10 (7), ZC58-ZC61 (2016).
  26. Droebner, K., Sandner, P. Modification of the salivary secretion assay in F508del mice--the murine equivalent of the human sweat test. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 630-637 (2013).
  27. Lamy, E., et al. Changes in mouse whole saliva soluble proteome induced by tannin-enriched diet. Proteome Science. 8 (1), 65 (2010).
  28. Mahomed, F. Recent advances in mucin immunohistochemistry in salivary gland tumors and head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 47 (9), 797-803 (2011).
  29. Kohlgraf, K. G., et al. Quantitation of SPLUNC1 in saliva with an xMAP particle-based antibody capture and detection immunoassay. Archives of Oral Biology. 57 (2), 197-204 (2012).
  30. Maimets, M., Bron, R., de Haan, G., van Os, R., Coppes, R. P. Similar ex vivo expansion and post-irradiation regenerative potential of juvenile and aged salivary gland stem cells. Radiotherapy and Oncology. , (2015).
  31. Lombaert, I. M., et al. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. PLoS One. 3 (4), e2063 (2008).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T psorunu 135t k r ktoplamaxerostomiasialorrheaPilokarpintrakeostomienedilparotidbezi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır