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摘要

我们提出了一个详细的方法来执行唾液收集, 包括小鼠气管切开和隔离三大涎腺。

摘要

Hyposalivation 通常观察到 Sjögren 综合征的自身免疫反应或继放射损伤的主要涎腺。在这些情况下, 有关疾病发病机制和有效干预的问题仍然存在。一种优化的技术, 允许对涎腺的功能性评估是非常宝贵的研究外分泌腺生物学, 功能障碍和治疗。在这里, 我们提出一步一步的方法来执行的匹凡刺激唾液分泌, 包括气管切开和解剖三大鼠涎腺。我们还详细介绍了适当的小鼠头部和颈部解剖学在这些技术的访问。这种方法是可伸缩的, 允许多个鼠标同时处理, 从而提高了工作流的效率。我们的目的是提高这些方法的重现性, 每一个都有进一步的应用领域内。除了唾液收集, 我们还讨论了量化和规范化这些组织的功能能力的指标。有代表性的数据包括从颌下腺功能下降2周后, 分光辐射 (4 剂量 6.85)。

引言

涎腺疾病包括失调或分泌障碍的症状, 导致生产过剩 (sialorrhea) 或减产 (口干症和 hyposalivation) 的唾液1。在这两种情况下, 都有兴趣提高我们对涎腺生物学的认识, 迈向治疗发展的最终目标2。

涎腺是高度敏感器官, 并且经常被损坏在头颈癌放疗期间, 导致永久干嘴 (口干症)3, 4.与其他敏感组织不同, 涎腺的更替率相对较低, 分泌性损失的机制不太了解5,6。在这种独特的损伤设置, 组织再生和防护策略需要唾液功能评估。实验中, 小鼠唾液收集是评估辐射和治疗药物的腺体反应的一个特别有价值的工具。

在这里, 我们提出了一个方法, 以执行和量化刺激唾液分泌使用的匹毒蕈, 一个强有力的7激动剂。匹凡刺激自主神经系统诱发腺体分泌8,9。为了适当地完成这项试验, 需要进行气管切开, 以确保老鼠在整个过程中保持一个专利气道, 并减少口腔内的分泌物窒息和吸入的风险10。

这是一个终端程序, 最终清除三大涎腺: 腮腺 (PG), 颌下腺 (SMG) 和舌下 (SLG)。在功能性研究中, 腺体重量被记录下来, 通常用来规范化唾液测量11,12,13。这些数据在辐射研究中尤为重要, 其中腺体萎缩是预期结果14,15

在文献中有可变性的关于如何刺激唾液分泌被执行和报告的16。例如, 在文学范围内的匹比剂量至少三级17,18,19,20,21,22,23。在这里, 我们提出了一个优化的高剂量匹凡协议, 目的是提高方法执行的重现性, 以及提供一个模块化的技术平台 (气管切开, 唾液收集和腺体解剖), 可以适应需要。

除了协议演示外, 我们还包括有代表性的2周内唾液流动的功能数据 (4 剂量 6.85) 到 SMG 地区。

研究方案

下文概述的所有体内程序均经罗切斯特罗切斯特大学动物资源大学委员会批准。纽约。

1. 准备

  1. 使用分析天平, 重20毫克的匹。将其溶于2毫升的无菌盐水中, 离心管。
    注意: 由于匹属轻敏感, 并且随着时间的推移而失去活动, 这个解决方案应该在注射之日准备好, 并在被管理之前保护光线。
  2. 使用分析平衡, 权衡和识别所有收集管和玻璃毛细血管。收集管和玻璃毛细血管的数量应与小鼠数量相匹配。

2. 气管切开术

  1. 用分析天平称 C57/BL6 小鼠。
  2. 使用0.5 毫升注射器与 29G x ½ "针, 麻醉小鼠与腹腔注射无菌盐水溶液100毫克/千克氯胺酮和10毫克/千克甲苯噻嗪。当鼠标不再响应刺激 (即没有踏板退出反射) 时, 继续执行以下步骤, 通常在注射后5到10分钟内发生。
  3. 在用棉签涂抹润滑剂后, 轻轻地涂抹在眼睛上, 把鼠标放在舞台上的仰卧位置。麻醉动物必须保持在温暖的表面上。
    注意: 所有步骤都在室温下执行。
  4. 用手术胶带把鼻子、四肢和尾巴固定在舞台上。
  5. 用酒精擦干净和湿脖子。
    注意: 这将有助于防止毛皮进入随后的切口。
  6. 用镊子提高腹中线颈部皮肤, 用解剖剪刀做一个小而浅的切口。引导剪刀进入开口, 慢慢地打开皮下的刀片, 分开组织平面。
  7. 保持皮肤抬起, 小心地切到1厘米以下的嘴。
  8. 在第一切口的下等和上级方面做两个侧向切口。使用镊子, 轻轻地反射离开皮肤, 使进入头部和颈部结构。
  9. 使用解剖显微镜在8X 放大, 可视化颌下腺 (中线:图 1)。
  10. 使用细钳, 轻轻地抬起腺体, 以暴露四舌骨下 (带) 肌肉在气管上方。避免撕裂或扰乱周围的血管或排泄管道。
  11. 如果从多个鼠标收集唾液, 请在继续之前对每只鼠标重复步骤 2.1-2.10。
    注: 本程序可同时安全执行多达5只鼠标。
  12. 用小解剖剪刀, 移除带肌内侧部分, 同时尽量靠近中线。在手术过程中, 尽量减少气管的可视性, 保持带肌。避免偷任何附近的船只, 因为如果有严重出血继发量耗尽, 在诱导分泌物时, 匹比不会有效。
  13. 从气管中反射出带肌。
  14. 可视化喉、气管和甲状腺。确保气管的上部组织不明显。
  15. 用小解剖剪刀在气管的下/后向甲状腺进行水平切口。确保气道是专利的, 并清除液体。

3. 唾液收集

  1. 将胶带移近口部和角部解剖阶段向下 (45°, cranially), 以协助唾液流动。
  2. 使用0.5 毫升注射器与 29G x ½ "针, 执行腹腔注射10µL/克体重的匹凡总剂量100毫克/千克。
  3. 开始计时器。如果多剂量的老鼠, 通过快速移动和由助手同时注射其余的老鼠缩短提前时间。
  4. 使用标准钳, 打开口管进入毛细管。
  5. 一旦唾液中的一颗珠子被观察到, 将毛细管的近端放到液体中, 远端端放到位于解剖阶段以下的收集管 (两管预称重)。
    注: 在 C57/BL6 雌性小鼠 6-10 周的年龄, 总流涎发生在2分钟的匹比注射。
  6. 如果唾液是在口中生成的, 而不是流过管子, 重试上一步。确保管不直接放置在粘膜表面, 这会阻碍入口。
  7. 收集唾液, 总共12分钟后, 匹凡刺激。确保气孔保持清晰。
    注: 在这段时间内, 增加的潮汐量和分泌物 (唾液、泌尿、粪便) 是正常的。
  8. 如果老鼠有压抑的唾液功能 (g., 由于伤害或干预), 使用 P200 微将剩余的液体从口腔转移到收集管。如果从多个鼠标收集, 请确保提示被更改。
  9. 记录12分钟后收集唾液加管的重量。

4. 腺体解剖

  1. 弄死小鼠由 CO2安乐死 (如 AVMA 指南为动物安乐死: 2013 编辑) 然后切开, 注意保存头和脖子的结构。因此, 避免颈椎脱位是安乐死的一种方法。
  2. 将鼠标放在舞台上的仰卧位置。将原始站点中的腺体重新定位到气管 (图 1)。
  3. 使用解剖显微镜在8X 放大, 可视化主要腺体: PG, SMG 和 SLG。为了区分解剖过程中的腺体, 确定 PG 是弥漫的, 躺在与 SMG 和 SLG 侧。
    注: 如果解剖 PG, 这应该首先做, 因为它是最不明确的, 最有可能被撕裂。
  4. 用镊子抓住 pg 的尾部, 将其从底层结构中拉出, 在用解剖剪刀切开 pg 头前轻轻地施加张力。
  5. 用镊子将 SMGs 周围的胶囊破坏。轻轻地分开左, 右的 SMG。
  6. 用镊子从粘附的 nonglandular 组织中释放 SMG 的背侧。
  7. 用镊子把沃顿商学院的导管拉紧, 用解剖剪刀切开导管, 从颈部取出 SMG。
  8. 用镊子轻轻地将 SLG 与 SMG 分开。
    注: SLG 在 SMG 的 superolateral 方面。
  9. 使用分析天平记录 SMG 重量。

结果

当执行高剂量的匹比刺激唾液收集, 重要的是保持呼吸道, 以防止吸入或窒息的分泌物在口腔。提供了气管切开的示意图 (图 1)。气管切开后, 气孔必须保持清晰的组织和液体。

为了加强唾液收集过程中的毛细血管作用, 应将小鼠的头部置于45°角度向下定位。这些步骤可以在 > 1 鼠标上执行, 但不建议一次?...

讨论

本文提出一种评价涎腺功能的多步法方法, 可用于研究腺损伤和治疗。我们的程序包括气管切开, 唾液收集和腺体解剖, 每个实验应用都能支持涎腺生物学的综合研究。例如, 小鼠气管切开术在阻塞口腔的过程中被用于一般的气道管理。

正确的解剖和气管切开是需要的, 以刺激唾液分泌100毫克/千克。另一种方法是, 减少的匹比, 可以避免对气管切开的需要, 因此用于纵向评估唾液...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

该出版物中报告的研究得到国家牙科和颅面研究研究所 (NIDCR) 和国立卫生研究院全国癌症研究所 (R56 DE025098、UG3 DE027695 和 F30 CA206296) 的支持。内容完全是作者的责任, 不一定代表国家卫生研究院的官方意见。这项工作也得到了 NSF DMR 1206219 和 IADR 口腔护理奖 (2016) 创新的支持。

我们要感谢 Eri 圆山博士和安德鲁 Hollomon 为他们提供的唾液收集帮助。我们要感谢培伦翁协助进行腺体解剖。我们要感谢马修·格尔斯在图准备方面的协助。我们要感谢伊莲 Smolock 博士和艾米莉. 吴对这篇手稿的批判性阅读。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Pilocarpine hydrochlorideSigma AldrichP6503Pilocarpine
Student Vannas Spring ScissorsFine Science Tools91500-9Spring Scissors for Tracheostomy
Sterile Saline SolutionMedlineRDI30296HSaline
Dumont #7 ForcepsFine Science Tools11274-20Curved Forceps
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-10Straight Forceps
Standard Pattern ForcepsFine Science Tools11000-12Blunt Forceps
Fine Scissors- Tungsten CarbideFine Science Tools14568-09Dissection Scissors
Microhematocrit Heparinized Capillary TubesFisher Scientific22362566Capillary tubes
Lubricant Eye OintmentRefreshN/ARefresh Lacri-Lube
Goat polyclonal anti-Nkcc1Santa Cruz BiotechSC-21545Nkcc1 Antibody
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306DAPI
GraphPad PrismGraphPadver6.0Statistical Software
Cotton tipped applicatorMedlineMDS202000Applicator for eye ointment
0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2"BD7629Syringe for intraperitoneal injection

参考文献

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