Evaluación funcional salival murino mediante pilocarpina estímulo siguiente fraccionado radiación

Resumen

Presentamos un enfoque detallado para realizar la colección de saliva, incluyendo traqueotomía murino y el aislamiento de tres glándulas salivales mayores.

Resumen

Hiposalivación se observa comúnmente en la reacción autoinmune síndrome de Sjögren o siguiente lesión por radiación a las glándulas salivales mayores. En estos casos, quedan preguntas con respecto a la patogénesis de la enfermedad y las intervenciones eficaces. Una técnica optimizada que permite la evaluación funcional de las glándulas salivales es muy valiosa para la investigación terapéutica, disfunción y biología de la glándula exocrine. Aquí, presentamos un enfoque paso a paso para realizar la pilocarpina estimula la secreción de saliva, incluyendo la disección de las glándulas salivales murinas principales tres y traqueostomía. También detallamos la anatomía cabeza y cuello murina apropiada accedida durante estas técnicas. Este enfoque es escalable, permitiendo múltiples ratones ser procesados simultáneamente, mejorando así la eficiencia del flujo de trabajo. Nuestro objetivo es mejorar la reproducibilidad de estos métodos, cada uno de ellos tiene más aplicaciones en el campo. Además de la colección de saliva, discutimos métricas para cuantificar y normalización de la capacidad funcional de estos tejidos. Datos representativos se incluyen de las glándulas submaxilares con función deprimida de la glándula salival 2 semanas después de la radiación fraccionada (4 dosis de 6.85 Gy).

Introducción

Trastornos de la glándula salival incluyen síndromes de altera o deteriora la secreción hacia la superproducción (sialorrea) o insuficiente (xerostomía e hiposalivación) de saliva¹. En ambos casos, hay un interés por mejorar nuestra comprensión de la biología de la glándulas salivales hacia la meta final del desarrollo terapéutico².

Las glándulas salivales son órganos altamente radiosensibles y a menudo se dañan durante la radioterapia de cáncer cabeza y cuello, hacia la permanente boca seca (xerostomía)^3,4. Sin embargo, a diferencia de otros tejidos radiosensibles, índice de rotación de la glándula salival es relativamente baja, y el mecanismo de la pérdida de secreción es mal entendido^5,6. En este escenario de lesiones únicas, estrategias de regeneración y protección radiológica de tejido requieren evaluación funcional salival. Experimentalmente, colección de saliva murino es una herramienta especialmente valiosa en la evaluación de la respuesta de la glándula a la radiación y los agentes terapéuticos.

Aquí, presentamos un método para realizar y cuantificar la secreción de saliva estimulada con pilocarpina, un potente agonista muscarínico⁷. La pilocarpina estimula el sistema nervioso autónomo para inducir la secreción de la glándula^8,9. Para completar correctamente esta prueba, una traqueotomía se requiere para asegurarse de que el ratón mantenga una vía aérea patente durante todo el procedimiento y para reducir los riesgos de asfixia y aspiración de secreciones agrupadas en la cavidad oral¹⁰.

Este es un procedimiento terminal, culminando en la eliminación de las tres glándulas salivales mayores: parótida (PG), el submaxilar (SMG) y sublingual (SLG). Para los estudios funcionales, glándula pesos se registran y se utilizan a menudo para normalizar saliva medición^11,12,13. Esta información es particularmente importante en estudios de radiación, en la que la atrofia de la glándula es un resultado esperado^14,15

Hay variabilidad en la literatura con respecto a la secreción de saliva estimulada cómo se realiza y divulga¹⁶. Por ejemplo, dosis de pilocarpina en la literatura palmo por lo menos tres órdenes de magnitud^{17,18,19,20,21,22,23}. Aquí, presentamos un protocolo de pilocarpina optimizado de dosis alta con la intención de mejora reproducibilidad en ejecución método, así como proporcionar una plataforma modular de técnicas (traqueostomía, la recolección de saliva y disección de la glándula) que pueden ser adaptados como necesario.

Además de la demostración del Protocolo, incluimos datos funcionales representativos de flujo de la saliva a las 2 semanas después de la radiación fraccionada (4 dosis de 6.85 Gy) a la región SMG.

Protocolo

Todo en vivo los procedimientos descritos a continuación fueron aprobados por el Comité de la Universidad sobre los recursos de la Universidad de Rochester, Rochester. NUEVA YORK.

1. preparación

1. Utilizando una balanza analítica, pesan 20 mg de pilocarpina. Disolver en 2 mL de solución salina estéril en un tubo de microcentrífuga.
   Nota: Porque pilocarpina es sensible a la luz y pierde actividad con el tiempo, esta solución debe ser preparada el día de la inyección y protegida de la luz hasta que administra.
2. Utilizando una balanza analítica, pesar e identificar todos los tubos y capilares de vidrio. El número de tubos y capilares de vidrio debe coincidir con el número de ratones.

2. traqueostomía

1. Pesar ratones C57/BL6 utilizando una balanza analítica.
2. Utilizando una jeringa de 0.5 mL con aguja 29 x ½", anestesiar ratones con una solución salina estéril inyectada por vía intraperitoneal de 100 mg/kg ketamina y 10 mg/kg xilacina. Proceder al paso siguiente cuando el ratón deja de responder a los estímulos (es decir, ausencia del reflejo pedal retirada), que ocurre generalmente dentro de 5 a 10 minutos después de la inyección.
3. Después de dispensar lubricante en un aplicador con punta de algodón, suavemente aplique a los ojos y coloque el ratón en una posición supina en el escenario. El animal anestesiado debe mantenerse en la superficie caliente.
   Nota: Todas las medidas se realizan a temperatura ambiente.
4. Asegure la nariz, extremidades y cola a la etapa con cinta quirúrgica.
5. Limpiar y mojar el cuello con un algodón empapado en alcohol.
   Nota: Esto ayudará a prevenir la piel entren en incisiones posteriores.
6. Levantando la piel del cuello del midline ventral con pinzas, hacer un corte pequeño y superficial con tijeras de disección. Guía de las tijeras en la abertura y abra lentamente las hojas por vía subcutánea para separar tejidos planos.
7. Mantener la piel levantada, cuidadosamente corte a 1 cm por debajo de la boca.
8. Hacer dos incisiones laterales en los aspectos inferior y superiores del primer corte. Suavemente con unas pinzas, reflejan a la piel para permitir el acceso a las estructuras de cabeza y cuello.
9. Usando el microscopio de disección con 8 aumentos, visualizar las glándulas submaxilar (media: figura 1).
10. Con unas pinzas finas, levante suavemente las glándulas para exponer los cuatro músculos del infrahyoid (correa) que cubre la tráquea. Evitar desgarros o interrumpir la vasculatura circundante o conductos excretores.
11. Si recoger saliva de más de un ratón, repita los pasos 2.1-2.10 con cada ratón antes de continuar.
    Nota: Este procedimiento puede realizar con seguridad en hasta 5 ratones al mismo tiempo.
12. Con pequeñas tijeras de disección, quitar la porción medial de los músculos de la correa durante su estancia lo más cerca posible de la línea media. Corte solamente tanto como sea necesario visualizar la tráquea y mantener los músculos de la correa del camino durante el procedimiento. Evitar mellar cualquier buques cercanos porque si hay depleción de volumen secundaria a hemorragia significativa, pilocarpina no será eficaz en la inducción de secreción.
13. Reflejo de los músculos de la correa de la tráquea.
14. Visualizar la laringe, la tráquea y la glándula tiroides. Asegúrese de que la tráquea esté libre de tejido sobrepuesto.
15. Hacer una incisión horizontal en la tráquea inferior posterior de la tiroides usando pequeñas tijeras de disección. Asegurar la vía aérea patente y claro del líquido.

3. saliva colección

1. Retire la cinta junto a la boca y el ángulo de fase de disección hacia abajo (45°, cranially) para ayudar a flujo de la saliva.
2. Utilizando una jeringa de 0.5 mL con aguja 29 x ½", realizar la inyección intraperitoneal de 10 μl/g cuerpo peso la pilocarpina para una dosis total de 100 mg/kg.
3. Iniciar un temporizador. Si la dosis múltiples ratones, reducir tiempo moviendo rápidamente y por tener un ayudante inyecta simultáneamente los ratones restantes.
4. Con unas pinzas estándar, abrir la boca para el acceso del tubo capilar.
5. Una vez que se observa una gota de saliva en la boca, coloque el extremo proximal del tubo capilar en el líquido, con el extremo distal se coloca en un tubo colector colocado debajo de la etapa de disección (ambos tubos previamente pesados).
   Nota: En los ratones hembra C57/BL6 6-10 semanas de edad, bruta salivación ocurre dentro de 2 minutos de la inyección de pilocarpina.
6. Si saliva en la boca del edificio, pero no fluye a través del tubo, reintentar el paso anterior. Asegúrese de que el tubo no esté directamente contra una superficie mucosa, que puede obstruir la entrada.
7. Recoger saliva para un total de 12 minutos después del estímulo la pilocarpina. Asegúrese de que el estoma permanece claro.
   Nota: Aumento del volumen tidal y secreciones (salivales, urinarias, fecales) son normales durante este tiempo.
8. Si los ratones han presionado función de saliva (ej., debido a lesión o intervención), transferir el líquido restante de la boca en el tubo de la colección mediante una micropipeta de P200. Si recogida de varios ratones, asegúrese de que los consejos han cambiado.
9. Registrar el peso de saliva recogida más tubos 12 min después de la inyección de pilocarpina.

4. glándula disección

1. Eutanasia a ratones por CO₂ eutanasia (como se describe en las pautas de AVMA de eutanasia de los animales: edición 2013) seguido de toracotomía, teniendo cuidado de preservar las estructuras de la cabeza y el cuello. Por esta razón, evitar la dislocación cervical como método de eutanasia.
2. Coloque el ratón en una posición supina en el escenario. Vuelva a colocar las glándulas en el sitio original sobre la tráquea (figura 1).
3. Utilizando un microscopio de disección bajo 8 aumentos, visualizar las glándulas principales: el PG, SMG y SLG. Para distinguir las glándulas durante la disección, identificar que el PG es difusa, lateral a la SMG y SLG.
   Nota: Si el PG de disección, esto debe hacerse en primer lugar porque es el menos definido y más probable ser rasgado.
4. Agarre la cola de la PG con pinzas, tirando lejos de las estructuras subyacentes y suavemente aplique tensión antes de cortar la cabeza de la PG con tijeras de disección.
5. Incumplimiento la cápsula que rodea el metralletas con unas pinzas. Separe suavemente el SMG de izquierda y derecho.
6. Libre de la cara dorsal de la SMG del tejido nonglandular adherido con unas pinzas.
7. Retire el SMG del cuello tenso del conducto de Wharton con pinzas y corte el tubo con tijeras de disección.
8. Separe suavemente el SLG de SMG con unas pinzas.
   Nota: La SLG es en el aspecto superolateral del SMG.
9. Con una balanza analítica, registre pesos SMG.

Resultados

Cuando realizar pilocarpina dosis altas estimula la colección de saliva, es importante mantener la vía aérea para prevenir la aspiración o asfixia de las secreciones en la cavidad bucal. Un esquema de la traqueotomía se proporciona (figura 1). Tras la incisión traqueal, el estoma debe permanecer claro de tejido y fluidos.

Para mejorar la acción capilar durante la recogida de saliva, ratones d...

Discusión

Presentamos un método de varios pasos para evaluar la función de la glándula salival, que puede ser aplicada para el estudio de lesiones de la glándula y terapéutica. Nuestro procedimiento consiste en traqueostomía, la recolección de saliva y disección de la glándula, que tiene aplicaciones experimentales que soporten un estudio integrado de la biología de la glándula salival. Por ejemplo, traqueotomía murino se ha utilizado para la gestión general de la vía aérea durante procedimientos de obstrucción de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pilocarpine hydrochloride	Sigma Aldrich	P6503	Pilocarpine
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-9	Spring Scissors for Tracheostomy
Sterile Saline Solution	Medline	RDI30296H	Saline
Dumont #7 Forceps	Fine Science Tools	11274-20	Curved Forceps
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	Straight Forceps
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12	Blunt Forceps
Fine Scissors- Tungsten Carbide	Fine Science Tools	14568-09	Dissection Scissors
Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes	Fisher Scientific	22362566	Capillary tubes
Lubricant Eye Ointment	Refresh	N/A	Refresh Lacri-Lube
Goat polyclonal anti-Nkcc1	Santa Cruz Biotech	SC-21545	Nkcc1 Antibody
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI
GraphPad Prism	GraphPad	ver6.0	Statistical Software
Cotton tipped applicator	Medline	MDS202000	Applicator for eye ointment
0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2"	BD	7629	Syringe for intraperitoneal injection