Valutazione funzionale salivare murina attraverso dopo stimolazione Pilocarpina frazionato radiazione

Riepilogo

Vi presentiamo un approccio dettagliato dell'esecuzione di raccolta della saliva, compreso il tracheostomy murino ed all'isolamento di tre ghiandole salivari maggiori.

Abstract

Hyposalivation è osservata comunemente nella reazione autoimmune di sindrome di Sjögren o seguente lesione da radiazioni alla ghiandole salivarie principali. In questi casi, domande rimangono per quanto riguarda la patogenesi della malattia e interventi efficaci. Una tecnica ottimizzata che consente la valutazione funzionale delle ghiandole salivari è preziosa per indagare terapeutica, la disfunzione e la biologia della ghiandola exocrine. Qui, presentiamo un approccio passo per passo all'esecuzione di Pilocarpina ha stimolato la secrezione di saliva, compreso il tracheostomy ed la dissezione delle tre principali ghiandole salivari murine. Dettagliamo anche l'appropriato anatomia di testa e collo di murino letta durante queste tecniche. Questo approccio è scalabile, che consente più topi da elaborare simultaneamente, migliorando così l'efficienza del flusso di lavoro. Puntiamo a migliorare la riproducibilità di questi metodi, ognuno dei quali ha ulteriori applicazioni all'interno del campo. Oltre alla raccolta della saliva, discutiamo metriche per quantificare e normalizzare la capacità funzionale di questi tessuti. Dati rappresentativi sono inclusi da ghiandole sottomandibolari con funzione della ghiandola salivaria depresso 2 settimane che seguono la radiazione frazionata (4 dosi di 6.85 Gy).

Introduzione

Ghiandola salivare disturbi includono le sindromi di dysregulated o secrezione alterata che conduce alla sovrapproduzione (scialorrea) o sottoproduzione (xerostomia e hyposalivation) di saliva¹. In entrambi i casi, c'è un interesse nel migliorare la nostra comprensione della biologia della ghiandola salivaria verso l'obiettivo finale di sviluppo terapeutico².

Le ghiandole salivari sono organi altamente radiosensibili e spesso sono danneggiate durante la radioterapia cancro testa e del collo, che porta a permanente secchezza delle fauci (xerostomia)^3,4. A differenza di altri tessuti radiosensibili, tuttavia, il tasso di turnover della ghiandola salivaria è relativamente basso e il meccanismo di perdita secretiva è capita male^5,6. In questa cornice unica ferita, strategie di rigenerazione e protezione dalle radiazioni del tessuto richiedono valutazione funzionale salivare. Sperimentalmente, raccolta di saliva murino è uno strumento particolarmente valido nel valutare la risposta della ghiandola alla radiazione sia agenti terapeutici.

Qui, presentiamo un metodo per l'esecuzione e quantificare la secrezione di saliva stimolata utilizzando pilocarpina, un potente agonista muscarinico⁷. Pilocarpina stimola il sistema nervoso autonomo per indurre la secrezione della ghiandola^8,9. Per completare questo test in modo appropriato, un tracheostomy è necessario per garantire che il mouse mantiene pervietà durante tutta la procedura e di ridurre i rischi di soffocamento e di aspirazione dalle secrezioni riunite nella cavità orale¹⁰.

Si tratta di una procedura di terminale, che si conclude con la rimozione delle ghiandole salivarie principali tre: parotide (PG), la sottomandibolare (SMG) e sublingual (SLG). Per gli studi funzionali, ghiandola pesi vengono registrati e sono spesso utilizzati per normalizzare saliva misura^11,12,13. Questi dati sono particolarmente importanti negli studi di radiazione, in cui l'atrofia della ghiandola è un risultato atteso^14,15

Non c'è variabilità nella letteratura per quanto riguarda la secrezione di saliva come stimolata viene eseguita e segnalato¹⁶. Ad esempio, dosi di Pilocarpina all'interno della letteratura span almeno tre ordini di grandezza^{17,18,19,20,21,22,23}. Qui, presentiamo un protocollo di Pilocarpina ottimizzato ad alte dosi con l'intento di una migliore riproducibilità in esecuzione del metodo, come pure fornendo una piattaforma modulare di tecniche (tracheostomia, raccolta di saliva e la dissezione della ghiandola) che può essere adattato come necessari.

Oltre alla dimostrazione di protocollo, includiamo dati rappresentativi funzionali del flusso della saliva a 2 settimane che seguono radioterapia frazionata (4 dosi di 6.85 Gy) nella regione di SMG.

Protocollo

Tutte le procedure in vivo descritte di seguito sono state approvate dal Comitato Università sulle risorse animali presso l'Università di Rochester, Rochester. NY.

1. preparazione

1. Utilizzando una bilancia analitica, pesano 20 mg di pilocarpina. Scioglierli in 2 mL di soluzione fisiologica sterile in una microcentrifuga.
   Nota: Poiché Pilocarpina è sensibile alla luce e perde l'attività nel corso del tempo, questa soluzione dovrebbe essere preparata il giorno dell'iniezione e al riparo dalla luce fino a quando somministrato.
2. Utilizzando una bilancia analitica, pesare e identificare tutte le provette per il prelievo e tubi capillari in vetro. Il numero di provette per la raccolta e tubi capillari in vetro deve corrispondere al numero di topi.

2. tracheostomia

1. Pesare topi C57/BL6 utilizzando una bilancia analitica.
2. Usando una siringa da 0,5 mL con ago 29 x ½", anestetizzare i topi con una soluzione salina sterile intraperitonealmente iniettato di 100 mg/kg ketamina e 10 mg/kg xylazina. Procedere con il passaggio seguente quando il mouse non risponde agli stimoli (cioè assenza del riflesso del pedale ritiro), che generalmente si verifica entro 5-10 min dopo l'iniezione.
3. Dopo l'erogazione di lubrificante su un applicatore con punta di cotone, applicare agli occhi delicatamente e posizionare il mouse in una posizione supina sul palco. L'animale anestetizzato deve essere mantenuto sulla superficie calda.
   Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente.
4. Fissare il naso, gli arti e la coda alla fase utilizzando nastro chirurgico.
5. Pulire e bagnare il collo con un batuffolo imbevuto di alcool.
   Nota: Questo vi aiuterà a impedire l'ingresso di incisioni successive di pelliccia.
6. Sollevare la pelle del collo del midline ventrale con il forcipe, fare un piccolo taglio superficiale usando le forbici per dissezione. Guida le forbici nell'apertura e aprire lentamente le lame per via sottocutanea per separare aerei del tessuto.
7. Mantenendo la pelle sollevata, accuratamente tagliato a 1 cm sotto la bocca.
8. Fare due incisioni laterali inferiori e superiori gli aspetti del primo taglio. Usando il forcipe, delicatamente riflettere via la pelle per consentire l'accesso alle strutture del collo e della testa.
9. Uso del microscopio per dissezione a ingrandimento X 8, visualizzare le ghiandole sottomandibolari (linea mediana: Figura 1).
10. Utilizzando una pinzetta, sollevare delicatamente le ghiandole per esporre quattro muscoli sottoioidei (cinghia) che ricopre la trachea. Evitare strappi o danneggiarne il vasculature circostante o dotti escretori.
11. Se raccolta saliva da più di un mouse, ripetere i passaggi 2.1-2.10 con ogni mouse prima di continuare.
    Nota: Questa procedura può essere effettuata sicuro su fino a 5 topi simultaneamente.
12. Con piccole forbici per dissezione, rimuovere la parte mediale dei muscoli della cinghia durante il vostro soggiorno più vicino alla linea mediana come possibile. Tagliare solo quanto necessario visualizzare trachea e muscoli della cinghia di mezzo durante la procedura. Evitare di intaccare le navi nelle vicinanze perché se c'è secondaria all'emorragia significativa deplezione di volume, Pilocarpina non sarà efficace a indurre la secrezione.
13. Riflettere i muscoli della cinghia dalla trachea.
14. Visualizzare la laringe, la trachea e la ghiandola tiroide. Assicurarsi che la trachea sia chiara del tessuto sovrastante.
15. Fare un'incisione orizzontale nella trachea inferiore/posteriore alla tiroide utilizzando piccole forbici per dissezione. Assicurarsi che le vie respiratorie siano brevetto e chiaro del fluido.

3. saliva Collection

1. Rimuovere il nastro vicino a bocca e l'angolo verso il basso la fase di dissezione (45°, cranialmente) per assistere con flusso della saliva.
2. Usando una siringa da 0,5 mL con ago 29 x ½", eseguire l'iniezione intraperitoneale di Pilocarpina peso di 10 µ l/g corpo per una dose totale di 100 mg/kg.
3. Avviare un timer. Se il dosaggio più mouse, riduzione del lead time spostando rapidamente e di avere un assistente iniettare contemporaneamente i topi restanti.
4. Utilizzando standard forcipe, aprire la bocca per l'accesso a tubo capillare.
5. Una volta una perlina di saliva è osservata in bocca, è possibile inserire l'estremità prossimale del tubo capillare nel fluido, con l'estremità distale inserito in un tubo di raccolta posizionato sotto il palcoscenico per dissezione (entrambi i tubi pre-pesati).
   Nota: Nei topi femmina C57/BL6 6-10 settimane di età, salivazione lordo si verifica entro 2 minuti di iniezione di pilocarpina.
6. Se la saliva è costruzione in bocca, ma non che scorre attraverso il tubo, tentare nuovamente il passaggio precedente. Assicurarsi che il tubo non è posizionato direttamente contro una superficie mucosa, che possa ostruire l'ingresso.
7. Raccogliere saliva per un totale di 12 min dopo stimolazione con pilocarpina. Assicurarsi che lo stoma rimane chiaro.
   Nota: Aumento del volume tidal e secrezioni (salivari, urinarie e fecale) sono normali in questo periodo.
8. Se i topi hanno depresso la funzione della saliva (ad es., a causa di infortunio o intervento), trasferire il liquido rimanente dalla bocca al tubo di raccolta mediante una micropipetta P200. Se raccogliendo da più mouse, assicurarsi che suggerimenti sono modificati.
9. Registrare il peso della saliva raccolta più tubi 12 min dopo l'iniezione di pilocarpina.

4. ghiandola dissezione

1. Eutanasia di topi di CO₂ eutanasia (come descritto nelle linee guida AVMA per l'eutanasia degli animali: edizione 2013) seguita dal thoracotomy, avendo cura di preservare le strutture della testa e del collo. Per questo motivo, evitare di dislocazione cervicale come metodo di eutanasia.
2. Posizionare il mouse in una posizione supina sul palco. Riposizionare le ghiandole nel sito originale sulla trachea (Figura 1).
3. Usando un microscopio per dissezione sotto ingrandimento 8x, visualizzare le principali ghiandole: il PG e la SMG SLG. Per distinguere le ghiandole durante la dissezione, identificare che il PG è diffuso, che si trova laterale alla SMG e SLG.
   Nota: Se il PG di dissezione, questo dovrebbe essere fatto prima perché è il meno definito e più probabilità di essere strappato.
4. Afferrare la coda del PG con la pinzetta, distanziando strutture sottostanti e applicare una leggera tensione prima di tagliare la testa del PG con forbici di dissezione.
5. Violazione la capsula che circonda il SMGs usando il forcipe. Separare delicatamente la SMG destro e sinistro.
6. Gratis la funzione dorsale del SMG dal tessuto nonglandular aderito usando il forcipe.
7. Rimuovere la SMG dal collo disegno dotto di Wharton teso con il forcipe e tagliando il condotto con forbici di dissezione.
8. Separare delicatamente la SLG da SMG usando il forcipe.
   Nota: La SLG è nella funzione superolateral del SMG.
9. Con una bilancia analitica, registrare pesi SMG.

Risultati

Quando eseguire Pilocarpina dose elevata stimolato raccolta della saliva, è importante mantenere le vie respiratorie per impedire l'aspirazione o soffocamento dalle secrezioni nella cavità orale. Lo schema del tracheostomy è fornito (Figura 1). A seguito di incisione tracheale, lo stoma deve rimanere chiaro dei tessuti e dei fluidi.

Per migliorare l'azione capillare durante la raccolta della sali...

Discussione

Presentiamo un metodo multistep per valutare la funzione della ghiandola salivaria, che può essere applicata a studiare terapeutica e lesioni della ghiandola. La nostra procedura prevede tracheostomia, raccolta di saliva e la dissezione della ghiandola, ognuno dei quali ha applicazioni sperimentali che possono supportare uno studio integrato di biologia della ghiandola salivaria. Ad esempio, tracheostomy murino è stato utilizzato per la gestione generale delle vie aeree durante le procedure che ostruisce la cavità ora...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pilocarpine hydrochloride	Sigma Aldrich	P6503	Pilocarpine
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-9	Spring Scissors for Tracheostomy
Sterile Saline Solution	Medline	RDI30296H	Saline
Dumont #7 Forceps	Fine Science Tools	11274-20	Curved Forceps
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	Straight Forceps
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12	Blunt Forceps
Fine Scissors- Tungsten Carbide	Fine Science Tools	14568-09	Dissection Scissors
Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes	Fisher Scientific	22362566	Capillary tubes
Lubricant Eye Ointment	Refresh	N/A	Refresh Lacri-Lube
Goat polyclonal anti-Nkcc1	Santa Cruz Biotech	SC-21545	Nkcc1 Antibody
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI
GraphPad Prism	GraphPad	ver6.0	Statistical Software
Cotton tipped applicator	Medline	MDS202000	Applicator for eye ointment
0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2"	BD	7629	Syringe for intraperitoneal injection