JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه الدراسة إجراء التحقق من صحة والأمثل للعزلة والثقافة البشرية الخلايا اللحمية الرحم لإجراء الفحص في المختبر ديسيدواليزيشن. علاوة على ذلك، توفر هذه الدراسة طريقة مفصلة لضربة قاضية كفاءة جين معين باستخدام سيرناس في الخلايا اللحمية الرحم البشرية.

Abstract

التفريق بين الخلايا البشرية stromal بطانة الرحم (هيسك) من ظهور مثل تنتجها الخلايا الليفية في أوروبية الافرازية تحول اللازمة لغرس الجنين في بطانة الرحم رحم الأم. تم إنشاء ديسيدواليزيشن غير لائق أنه سبب الجذري لعدم زرع وإجهاض الأجنة المبكرة اللاحقة. ولذلك، فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء ديسيدواليزيشن مفيد لتحسين معدل الولادات الناجحة. كثيرا ما تحد في فيفو على أساس دراسات ديسيدواليزيشن الاصطناعية بسبب المعضلات الأخلاقية المرتبطة بالبحوث البشرية، فضلا عن مضاعفات متعدية الجنسيات في نماذج حيوانية. كنتيجة لذلك، غالباً ما تستخدم فحوصات في المختبر من خلال زراعة الخلايا الأولية لاستكشاف تحوير ديسيدواليزيشن عن طريق الهرمونات. وتوفر هذه الدراسة بروتوكولا مفصلاً لعزل هيس واللاحقة ديسيدواليزيشن الاصطناعية عن طريق مكملات الهرمونات إلى وسيلة تثقيف. علاوة على ذلك، توفر هذه الدراسة أسلوب مصممة تصميماً جيدا لضربة قاضية الجينات أي اهتمام باستخدام ترانسفيكشنز siRNA على أساس المادة الدهنية. ويسمح هذا البروتوكول الأمثل لنقاء الثقافة فضلا عن المحصول المنتج، مما يؤدي إلى تعظيم القدرة على استخدام هذا النموذج كوسيلة موثوق بها فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء ديسيدواليزيشن، والتقدير الكمي اللاحقة وكلاء يفرز من الخلايا اللحمية الرحم ديسيدواليزيد.

Introduction

بين مرحلتي البلوغ وانقطاع الطمث، النساء في سن الإنجاب الخضوع لدورات شهرية لهرمون ينظم انتشار بطانة الرحم، والتمايز، وذرف اللاحقة في التحضير للحمل في عملية تعرف باسم الحيض1 ،2. هذه التعديلات المادية من بطانة الرحم البشرية ضرورية لغرس الجنين السليم داخل جدار الرحم1. تعديلات لبطانة الرحم، بما في ذلك التكيفات المورفولوجية والبيوكيميائية على حد سواء، هي وساطة طوال الدورة الشهرية عن طريق المبيض هرمونات الستيرويد الإستروجين والبروجسترون (P4)3،،من45. ضمن المرحلة التكاثري (أو الحبيبي)، مستويات الإستروجين بريوفولاتوري زيادة، الشروع في سماكة بطانة الرحم. بعد الإباضة، يعزز المرحلة الافرازية (أو اللواتي) ارتفاع كبير في تركيزات P4، الذي يحفز تحويل المورفولوجية للخلايا اللحمية الرحم (ESC) من ظهور مثل تنتجها الخلايا الليفية تقريب، الخلايا الظهارية مثل ديسيدوال في عملية تعرف باسم ديسيدواليزيشن،من46. تم إنشاء ديسيدواليزيشن غير لائق أنه سبب الجذري لعدم زرع واللاحقة المبكر الأجنة إجهاض4،،من78. ولذلك، فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء ديسيدواليزيشن مفيد للتشخيص والعلاج لفقدان الحمل المبكر.

حاليا، تستخدم عدة منهجيات لاستكشاف آثار ديسيدواليزيشن الكامنة في الخلايا اللحمية في بطانة الرحم. في فيفو، الرحم الماوس يمكن أن يتسبب مصطنع ديسيدواليزيشن عن طريق تحفيز الميكانيكية (أيخدش) أو النفط الحقن في رحم hormonally معبي9. متميزة من البشر، يعزز هذا التحفيز الاصطناعية التفريق بين التجويف الرحم بتوفير مظهر وجود الكيسة، خطوة ما مطلوب لبدء ديسيدواليزيشن في القوارض10،11. تبعاً لذلك، بسبب مضاعفات متعدية المرتبطة بنماذج حيوانية والمعضلات الأخلاقية المحيطة في فيفو على أساس الدراسات في البشر، أكثر بنجاح يتم دراسة نماذج ديسيدواليزيشن على أساس في المختبر.

في هذه الدراسة، يتم تجنيد المواضيع من خلال وضع إعلانات في كل الصحف المحلية الإنكليزية والإسبانية. تعرض المواضيع المحددة كمرشحين مناسبين لهذه الدراسة الاجتماع مع منسق البحوث، التي تناقش فيها الكشف كامل عن المخاطر المحتملة. عند التأكد فهم كامل للمخاطر المحتملة التي ينطوي عليها، هو تحقيق موافقة المواضيع في الأشكال الكتابية والشفوية على حد سواء. موافقة هذا الموضوع يتضمن الإذن (1) يخضع تخزين بالفصاده (2) طويلة الأجل على الأنسجة لأغراض البحث في المستقبل و (3) الموافقة على إنشاء ثقافات الأولية من عينات الأنسجة التي تم جمعها. وعقب موافقة، تعطي المواضيع نموذج لإكمال في أي الهوية المسموح بها من العرق/الإثنية و/أو الحق لاوقع. من المقرر زيارة لاحقة لتحقيق خزعة بطانة الرحم استناداً إلى دورة الطمث في هذا الموضوع. المتطوعين المعينين لهذه الدراسة تعكس التركيبة السكانية الإثنية والعرقية من منطقة العاصمة سانت لويس وموثقة من قبل تعداد عام 2012 ولا ينطوي على مشاركة أي مجموعة من السكان الضعيفة بما في ذلك النساء الحوامل والأجنة والأجنة، الأطفال دون سن 18 سنة من العمر، أو غيرهم من الفئات الضعيفة. وتشمل شروط الأهلية للمشاركة في جمع عينة خزعة (1) يجري تتراوح أعمارهم ما بين 18-45 سنة (2) وجود دورات الحيض العادية (25-32 يوما) (3) وجود لا الحمل الحالي أو استخدام وسائل منع الحمل الهرمونية/داخل الرحم الجهاز لمدة 30 يوما قبل التسجيل (4) وجود لا عدوى مهبلية الحالية أو الأمراض التي تنتقل بالاتصال الجنسي (5) وجود لا علاجات المضادات الحيوية الحالية، و (6) وجود لا اختبار بابانيكولاو الشاذ الحالي.

ضمن هذه الدراسة، مثقف وفعل مصطنع للخضوع ديسيدواليزيشن في المختبر عن طريق مكملات الهرمونات (استراديول (E2)، بروجستيرون (الآلام والكروب الذهنية)، ودوري الادينوسين الخلايا البشرية stromal بطانة الرحم (هيس) الأدينوزين (مخيم)) إلى المتوسط. في هذا الأسلوب، يتم تبديل درجة ديسيدواليزيشن تستند على العدد الإجمالي لأيام علاج الهرموني. بالتزامن مع إعادة ترتيب سيتوسكيليتال، يستحث مكملات هرمونية التعديلات البيوكيميائية التي تجربة decidual الخلايا الافرازية مثل الصفات2،4. التعبير عن الجينات السمة المميزة، مثل البرولاكتين (PRL) والبروتين مثل الأنسولين عامل النمو 1 (IGFBP1)، يمكن أن تستخدم لتأكيد وتقدير درجة هيس ديسيدواليزيشن5،12، 13 , 14-الأهم من ذلك، يتضح أيضا استمرارية هذا البروتوكول القيام بضربه قاضية الجينات المحددة.

Protocol

تحققت جميع خزعات بطانة الرحم البشرية التي تم جمعها لهذا الدراسة من جامعة واشنطن في سانت لويس، قسم طب التوليد وأمراض النساء استخدام المجلس الاستعراض المؤسسي (IRB) وافق نموذج موافقة خطية.

1-إعداد

  1. إعداد 500 مل 1 × موازنة الملح الحل (حبس هانك) بإضافة البنسلين يو/مليلتر 100 و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين بزجاجة تحتوي على وسائط الإعلام (المشار إليها أيضا حبس + المتوسطة).
  2. إعداد 500 مل من "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو: "مزيج المغذيات" F-12 (DMEM/F12) مع الفينول الحمراء ولام الجلوتامين وحمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك 15 ملم 4 (حبيس) بإضافة 1% حل مضاد حيوي فطري (النهائي تركيز هو البنسلين يو/مليلتر 100 و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين 0.25 ميكروغرام/مل فونجيزوني) إلى وسائل الإعلام التي تحتوي على زجاجة (المشار إليها "وسائل الإعلام العزلة هيس" كذلك).
  3. إعداد 500 مل من DMEM/F12 مع الفينول الحمراء ولام الجلوتامين 15 ملم حبيس بإضافة 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والعاشر 1 غ2HCO31% البنسلين (10,000 U/mL) وستربتوميسين (10,000 ميكروغرام/مل) (بكتيريا القلم) لوسائل الإعلام التي تحتوي على زجاجة (زيادة المشار إليه كوسائط هيس).
  4. إعداد 500 مل من "المصل خفض المتوسطة" مع لام الجلوتامين وبيكربونات الصوديوم 2.4 غرام/لتر، وحبيس مع 2% "الفحم جردت الجنيني البقري المصل" (كسفبس)، و 1% "بكتيريا القلم" لوسائل الإعلام التي تحتوي على زجاجة (المشار إليها "وسائل الإعلام ديسيدواليزيشن" كذلك).
  5. إعداد 500 مل من الفينول الحمراء مجاناً DMEM/F12 بإضافة 2% الفحم جردت المصل البقري الجنينية (كسفبس) في وسائل الإعلام التي تحتوي على زجاجة (المشار إليها "تغيير وسائل الإعلام" كذلك).
  6. إعداد 10 نانومتر استراديول (E2) و 1 ميكرومتر بروجستيرون (الآلام والكروب الذهنية) 50 ميكرون دوري الادينوسين الأدينوزين (معسكر) في أنبوب مخروطي البوليبروبيلين 15 مل، وإضافة إلى 2 مل كل قاسمة جيدا لوسائل الإعلام ديسيدواليزيشن معدّة مسبقاً في المختبر التحليل ديسيدواليزيشن (المشار إليها أيضا كوسائط EPC).
  7. إعداد 50 مل من تجميد وسائل الإعلام مع 90% FBS و 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) في أنبوب 50 مل المخروطية البوليبروبيلين (المشار إليها أيضا كتجميد وسائل الإعلام).
  8. قبل تزن 25 ملغ من كولاجيناز و 5 ملغ من الدناز أنا في أنبوب 50 مل البوليبروبيلين المخروطية ومخزن في-20 درجة مئوية.

2-اقتناء خزعة بطانة الرحم البشرية

  1. الحصول على عينات خزعة بطانة الرحم البشرية التي تم جمعها في المرحلة التكاثري (يوم 9-12 يوما) لدورة الطمث من عيادة وافق مجلس الهجرة واللاجئين في حبس.
  2. تغسل العينات خزعة مع 1 مل من بريوارميد 37 درجة مئوية حبس + المتوسطة وهزه برفق لإزالة الدم الزائد والأغشية المخاطية.

3-عزل الخلايا البشرية Stromal بطانة الرحم (هيس)

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء العزلة في بيئة معقمة تحت سلامة بيولوجية مجلس الوزراء.

  1. نقل الخزعة مع الملقط المعقم في أنبوب 50 مل الطرد مركزي البوليبروبيلين مخروطية التي تحتوي على 10 مل حبس جديدة.
  2. الطرد المركزي الخزعة في درجة حرارة الغرفة في 500 غ س ل 90 ثانية.
    1. إذا تصدعات بيليه الخلية، تدور إعادة الخزعة في 2,000 غ س ل 90 ثانية.
  3. قم بإزالة الوسائط باستخدام بيبيت 1 مل ويغسل مع 10 مل من 37 درجة مئوية بريوارميد هيس العزلة الإعلامية متبوعاً بالطرد المركزي في غ س 500 90 ثانية.
  4. قم بإزالة الوسائط باستخدام بيبيت 1 مل، وإضافة قوة 3 مل هيس العزلة وسائط جديدة لإزاحة الخزعة.
  5. صب الخزعة في طبق بتري يحتوي على 5 مل من "هيس العزلة الإعلامية".
  6. فرم الخزعة في كقطع صغيرة قدر الإمكان استخدام الملقط #5 والمقص غرزة مستقيمة غرامة لمدة 20 دقيقة.
  7. إعداد الدناز أنا والأنزيمات كولاجيناز بإضافة 10 مل من "الإعلام العزلة هيسك" الدناز موزون مسبقاً (0.5 ملغ/مل) وكولاجيناز (2.5 ملغ/مل). مزيج مع بيبيت.
  8. ماصة قطع عينات الأنسجة باستخدام بيبيت 1 مل في أنبوب 50 مل البوليبروبيلين مخروطية الشكل جديد. يغسل مع 7 مل من "هيس العزلة الإعلامية" وإضافة إلى الأنبوب البولي بروبلين للحصول على نموذج كامل.
  9. أجهزة الطرد المركزي العينة في درجة حرارة الغرفة في 800 x ز للحد الأدنى 2 إزالة بلطف المادة طافية ماصة.
  10. تصفية الدناز أنا والحل كولاجيناز خلال 0.2 ميكرون تصفية المرفقة بحقنه 10 مل مباشرة على بيليه.
  11. دوامة 10 s ريسوسبيند بيليه.
  12. خلاصة في حمام الماء 37 درجة مئوية ل 1.5 ح، فورتيكسينج ل 10 s دقة كل 10 دقائق، حتى يهضم الأنسجة.
  13. مرشح العينة من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر مكدسة فوق أنبوب 50 مل البوليبروبيلين مخروطية لإزالة الحطام الأنسجة والخلايا الظهارية.
    ملاحظة: الخلايا اللحمية في الأنبوب البولي بروبلين المخروطية 50 مل.
  14. الطرد المركزي على أنبوب 50 مل البوليبروبيلين المخروطية في 800 غ س ل 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة المادة طافية مع ماصة 1 مل بلطف.
  15. ريسوسبيند بيليه في 10 مل من "هيس العزلة الإعلامية".
  16. الطرد المركزي في 800 غ س ل 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نضح المادة طافية، ومن ثم ريسوسبيند الخلايا في 6 مل من "وسائط الإعلام هيس" وماصة الأمامية والعكسية لمزيج.
  17. طبقة ببطء في 3 مل من كثافة وسائل الإعلام التدرج في الخلايا ريسوسبينديد لفصل خلايا الدم المتبقي من الخلايا اللحمية، مع الحرص على عدم خلط الطبقات.
  18. الطرد المركزي الأنبوب البولي بروبلين 15 مل في 400 غ س لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  19. جمع 5 مل من المادة طافية في أنبوب 50 مل البوليبروبيلين جديدة وإضافة 5 مل هيس وسائل الإعلام إضافية ريسوسبيند الخلايا.
  20. الطرد المركزي في غ 800 x 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، متبوعاً بإزالة المادة طافية وإضافة 6 مل هيس وسائط الإعلام. دوامة العينة 10 s ومزيج من بيبيتينج إلى الأمام وعكس 5 مرات.
  21. الكوة 10 ميليلتر من تعليق إعادة الخلايا إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل لعدد الخلايا.
  22. إضافة 10 ميليلتر من 0.4% تريبان الأزرق وصمة عار للخلية قاسمة وخلط مع بيبيت. تحميل 10 ميليلتر من قاسمة وعد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
  23. لوحة خلايا قارورة مناسبة تعتمد على عدد الخلايا الإجمالي في 15 مل هيس وسائط الإعلام.
    1. إذا كان العدد الإجمالي للخلايا أقل من 1 مليون، لوحة كافة الخلايا في قارورة 25 سم مع 6 مل من "الإعلام هيس". إذا كان العدد الإجمالي لخلايا أكثر من 1 مليون، لوحة كافة الخلايا في قارورة 75 سم مع 15 مل من "الإعلام هيس".
  24. ثقافة الخلايا في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة أدناها 6 (ح) ضمان التصاق الخلايا السليمة وتغيير وسائل الإعلام إلى "وسائل الإعلام هيس".
  25. الثقافة هيس معزولة في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 3-5 أيام حتى تشكل الخلايا أحادي الطبقة كونفلوينسي 80-90 ٪ في قارورة مطلي تحقيق.
  26. تغيير "الوسائط هيس" كل يومين.
    1. وسائط هيس الحارة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة.
    2. نضح وسائل الإعلام من قارورة وإضافة جديدة "هيس الوسائط" إلى قارورة (حجم العمل: مل 8 أو 16 مل في قارورة 25 سم أو 75 سم على التوالي).
    3. ضع قارورة العودة إلى الحاضنة2 CO 5% عند 37 درجة مئوية حتى يتحقق كونفلوينسي 80-90%.
  27. حالما تصبح هيس روافد 80-90 ٪، نقل الخلايا من 25 سم إلى 75 سم قارورة أو من قارورة 75 سم واحد إلى ثلاثة قوارير 75 سم.
    ملاحظة: يمكن تجميد هيس وتخزينها للاستخدام في وقت لاحق في هذا الوقت للتجارب المستقبلية.

4-تجميد والغاء هيسكس

  1. نضح وسائل الإعلام من قارورة 75 سم وإضافة 2 مل يدتا التربسين.
  2. احتضان في 5% CO2 حاضنة لمدة 2-3 دقيقة عند 37 درجة مئوية حتى إزاحة الخلايا من قارورة.
  3. إضافة مل 7 "وسائط هيس" ومزيج جيد من قبل بيبيتينج إلى الأمام وعكس.
  4. الطرد المركزي في 800 غ س ل 2.5 دقيقة ونضح المادة طافية.
  5. قم بتسمية أنابيب التجميد مع خط الخلية وتاريخ ورقم مرور.
  6. إعادة تعليق بيليه الخلية في 5 مل من تجميد وسائل الإعلام.
  7. الكوة 1 مل من هيس إعادة مع وقف التنفيذ لكل الأنابيب الأنبوبة ونقل إلى الثلاجة-80 درجة مئوية.
  8. نقل أنابيب للنتروجين السائل في غضون 24 ساعة.
    ملاحظة: إذا كان التخطيط لإذابة الخلايا في المستقبل القريب، تخزين الخلايا المجمدة في-80 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
  9. لذوبان الجليد في هيسكس يسخن "هيس وسائل الإعلام" لمدة 20 دقيقة.
  10. إضافة 8 مل من مسخن "هيس الوسائط" إلى قارورة 25 سم.
  11. استرداد أنبوب التجميد من خزان النتروجين السائل أو-80 درجة مئوية وتغرق الأنبوب في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة لإذابة الجليد في الخلايا.
  12. نقل هيسك المذابة قارورة 25 سم مع "وسائط الإعلام هيسك" واحتضان في 5% CO2 حاضنة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  13. وفي اليوم التالي تغيير "الوسائط هيس" والانتظار لمدة 2-3 أيام حتى تصبح المتلاقية هيس ونقل الخلايا إلى قارورة 75 سم كما هو مفصل أدناه في البروتوكول 5.
    1. وسائط هيس الحارة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة.
    2. نضح وسائل الإعلام من قارورة وإضافة جديدة "هيس الوسائط" إلى قارورة (حجم العمل: مل 8 أو 16 مل في قارورة 25 سم أو 75 سم على التوالي).
    3. ضع قارورة العودة إلى الحاضنة2 CO 5% عند 37 درجة مئوية حتى يتحقق كونفلوينسي 80-90%.

5-استزراع الخلايا اللحمية الرحم البشرية (هيس)

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء كولتورينج في بيئة معقمة تحت سلامة بيولوجية مجلس الوزراء.

  1. الحرارة قبل "هيس وسائط الإعلام" على 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 20-30 دقيقة.
  2. نضح وسائل الإعلام من قارورة وإضافة 0.25% حمض الإيثيلين التربسين (يدتا) (1 مل لقارورة 25 سم أو 2 مل لقارورة 75 سم).
  3. احتضان في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقيقة حتى إزاحة الخلايا.
  4. اضغط برفق الجدران قارورة لإزاحة الخلايا المتبقية. إضافة مل 7 "وسائط هيس" ومزيج جيد من قبل بيبيتينج إلى الأمام وعكس.
  5. بيبيت الخليط خلية في أنبوب 50 مل البوليبروبيلين المخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ز ل 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. نضح المادة طافية وإعادة تعليق بيليه الخلية في "وسائط الإعلام هيسك".
    1. إضافة 15 مل لقارورة 25 سم أو 45 مل لقارورة 75 سم (15 مل في كل).
  7. أضف تعليق خلية 5 مل أو 15 مل لكل قارورة 25 سم أو 75 سم على التوالي.
  8. الثقافة هيس معزولة في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 3-5 أيام حتى تشكل الخلايا أحادي الطبقة كونفلوينسي 80-90 ٪ في قارورة مطلي تحقيق.
  9. تغيير "الوسائط هيس" كل يومين.
    1. وسائط هيس الحارة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة.
    2. نضح وسائل الإعلام من قارورة وإضافة جديدة "هيس الوسائط" إلى قارورة (حجم العمل: مل 8 أو 16 مل في قارورة 25 سم أو 75 سم على التوالي).
    3. ضع قارورة العودة إلى الحاضنة2 CO 5% عند 37 درجة مئوية حتى يتحقق كونفلوينسي 80-90%.

6-طلاء الخلية (هيس) Stromal بطانة الرحم البشرية و siRNA تعداء

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء تعداء في بيئة معقمة تحت سلامة بيولوجية مجلس الوزراء.

  1. نضح "الوسائط هيس" من قارورة 75 سم وإضافة 2 مل من محلول يدتا التربسين 0.25%.
  2. احتضان في حاضنة 5%2 CO في 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقيقة حتى إزاحة الخلايا.
  3. حالما يتم فكها الخلايا من قارورة، إضافة 7 مل من "الإعلام هيس" وتخلط بلطف من بيبيتينج إلى الأمام وعكس 5 مرات.
  4. بيبيت الخليط خلية في أنبوب 50 مل البوليبروبيلين المخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ز ل 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نضح المادة طافية وإعادة تعليق بيليه الخلية في 10 مل من "الإعلام هيس".
    ملاحظة: إذا كان الطلاء الخلايا من قارورة واحدة أو أكثر، ببساطة زيادة حجم "الوسائط هيس".
  5. حساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
    1. الكوة 10 ميليلتر من الخلايا إعادة معلقة في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
    2. إضافة 10 ميليلتر من 0.4% تريبان الأزرق وصمة عار للخلية الكوة ومزيج من بيبيتينج إلى الأمام، وعكس.
  6. لوحة 0.8 x 105 خلايا كل بئر في لوحات 6-جيدا. وبعد يومين، ينبغي أن تكون الخلايا روافد 60-70% تعداء الأمثل.
  7. لكل عينة تعداء siRNA، إعداد مجمعات استخدام siRNA (60 نانوموليس) لكاشف تعداء.
  8. تمييع 5 ميليلتر من تعداء الكاشف في 150 ميليلتر المصل انخفاض حرية وسائط الإعلام واحتضان لمدة 5 دقائق.
  9. تمييع نانوموليس 60 من siRNA في 100 ميليلتر المصل انخفاض حرية وسائط الإعلام واحتضان لمدة 5 دقائق.
  10. بعد 5 دقائق، الجمع بين siRNA المخفف مع الحل كاشف تعداء المخفف وتخلط بلطف من بيبيتينج إلى الأمام وعكس 5 مرات.
    ملاحظة: إذا ترانسفيكتينج siRNA واحد أو أكثر في آبار متعددة، وإعداد مزيج الرئيسي في 10 مل أنابيب البوليستيرين.
  11. تبني مجمعات كاشف تعداء siRNA لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  12. خلال هذه الحضانة، أضف 1 مل من "تغيير وسائل الإعلام" لكل بئر.
  13. وبعد 5 دقائق من الحضانة، الطرد المركزي أنابيب في 500 غ س ل 2 دقيقة جمع الحل وإضافة 250 ميليلتر من مجمعات كاشف تعداء siRNA لكل منها أيضا يحتوي على خلايا ووسائل الإعلام.
  14. مزيج من الهز برفق واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة ح 5.
  15. بعد ح 5، تغيير وسائل الإعلام إلى "وسائل الإعلام هيس".
  16. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة لمدة يومين استعدادا للانزيم ديسيدواليزيشن في المختبر .

7. في المختبر بالانزيم ديسيدواليزيشن

ملاحظة: يتم إجراء هذا الفحص في بيئة معقمة تحت سلامة بيولوجية مجلس الوزراء.

  1. تعد وسائل الإعلام EPC قبل بدء العلاج ديسيدواليزيشن في المختبر كما هو موضح في كامدن et al. 3 (انظر 1.6).
  2. نضح وسائط الإعلام من وظيفة-48 ساعة خط هيس transfected المحتضنة من الخطوة 6.16.
  3. إضافة 2 مل EPC وسائط الإعلام في كل بئر.
    ملاحظة: كعنصر تحكم، إجازة مجموعة واحدة من الخلايا غير المعالجة مع وسائل الإعلام EPC. بدلاً من ذلك، إضافة 2 مل هيس وسائل الإعلام لمراقبة الآبار.
  4. احتضان الخلايا في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 6 أيام.
    1. تغيير الوسائط EPC كل 48 ساعة.
      1. الحارة وتحضير الوسائط EPC في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة.
      2. نضح وسائل الإعلام من البئر وإضافة جديدة "ل EPC الوسائط".
      3. ضع اللوحة العودة إلى الحاضنة2 CO 5% عند 37 درجة مئوية.
  5. بعد اليوم السادس، تحليل مدى ديسيدواليزيشن الخلايا اللحمية عن طريق أليسا وبكر qRT (كما هو موضح أدناه).

8-التحقق ديسيدواليزيشن في المختبر استخدام الكمية PCR الوقت الحقيقي (قرة-PCR)

ملاحظة: اكتمال qRT-بكر كما سبق ذكره في كوماجاني وآخرون10.

  1. عزل الجيش الملكي النيبالي إجمالي من هيس استخدام البروتوكول من مجموعة مواد عزل الحمض النووي الريبي متاحة تجارياً.
    1. تحليل كمية الحمض النووي الريبي والنقاء (260&/A280) استخدام نانودروب أو منهجية مماثلة كما هو موضح في غارسيا-إلياس وآخرون15.
  2. توليف كدنا من 1 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي من خلال بروتوكول مجموعة نسخ عكسي متوفرة تجارياً.
  3. تشغيل رد فعل بكر قرة كما هو موضح في بروتوكول مجموعة بكر qRT متاحة تجارياً.
    1. القيام برد فعل باستخدام مزيج ماجستير PCR "الوقت الحقيقي" المتاحة تجارياً ويَسْبِر الجينات محددة جنبا إلى جنب مع ضوابط النظام الداخلي (18sو PRLو IGFBP1).

9-التحقق ديسيدواليزيشن في المختبر استخدام أليسا

  1. قياس مستويات البرولاكتين يفرز من وسائط زراعة الأنسجة الاستفادة من مجموعة "أليسا البرولاكتين" متاحة تجارياً.

10-التحقق ديسيدواليزيشن في المختبر استخدام صبغة فالويدين.

  1. إدراج كوفيرسليبس العقيمة في كل من 12 لوحة جيدا جيدا.
  2. كرر الخطوات 6، 1-6، 5.
  3. لوحة 0.8 x 105 خلايا كل من 12 لوحة جيدا جيدا.
  4. احتضان الخلايا في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة يومين.
  5. نضح وسائط الإعلام.
  6. كرر الخطوات من 7.3-7.4.
  7. إصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد 4% (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  8. نضح الحل التثبيت ويغسل 3 مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  9. إضافة 0.1% الفاعل غير الأيونية ثالثي-أوكتيل غليكول البولي إثيلين فينيل خماسي البروم ثنائي الفينيل في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في الخلايا الثابتة لزيادة النفاذية.
  10. أغسل 3 مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  11. إضافة 100 ميليلتر لحل فالويدين كل ساترة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة.
    1. إعداد تمييع 1: 100 في برنامج تلفزيوني من استخدام حل أسهم فالويدين في وحدة واحدة كل 5 ميليلتر.
  12. أغسل 3 مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  13. تحميل الشرائح مع تصاعد المتوسطة التي تحتوي على 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI).
  14. مراقبة الخلايا استخدام مجهر [كنفوكل].

النتائج

ديسيدواليزيشن في الثقافة هيس

بعد عزلة، الخلايا اللحمية الرحم البشرية المستزرعة إلى تشكيل أحادي الطبقة مع كونفلوينسي 80-90% والتي يسببها ديسيدواليزيشن في المختبر بالتعامل مع 10 نانومتر E2، 1 ميكرومتر الآلام والكروب الذهنية، وم...

Discussion

دورة الطمث الإنجابية الإناث تتميز بارتفاع مستويات البروجسترون طوال الحيض، مما يحفز ديسيدواليزيشن من المفتاح ESC في الخلايا الافرازية جولة, طلائي مثل3،8. الشروع في ديسيدواليزيشن من الأنواع التابعة. في البشر، ويحدث ديسيدواليزيشن تلقائياً عند ارتفاع تركيز ال?...

Disclosures

هذا العمل هو مدعومة بتمويل من الوطنية معاهد للصحة (المعاهد الوطنية للصحة)/المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) منحة (R00 HD080742) وبدء العمل في "كلية الطب بجامعة واشنطن" الأموال إلى ر. ك. نود أن نشكر "عيادة الخصوبة جامعة واشنطن" لتقديم عينات خزعة بطانة الرحم.

Acknowledgements

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Opti-MEM I (1X) Reduced Serum MediumGibco31985-070For decidualization media
DMEM / F12 (1:1) (1X)Gibco11330-032
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061For cell count
PureLink RNA Mini KitInvitrogen12183018AFor RNA Isolation/Purification
TaqMan 2X Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
High Capacity cDNA Reverse Transcription KitApplied Biosystems4374967
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous ControlLife Technologies4319413EFor qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay Prolactin ProbeApplied Biosystems4331182For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 ProbeApplied Biosystems4331182For qPCR internal control
Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainterAbcamab176753
Human Prolactin ELISA KitInvitrogenEHIAPRL
16% ParaformaldehydeAlfa Aesar30525-89-4Fixative
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen13778150Transfection Reagent
ProLong Gold antifade reagent with DAPIInvitrogenP36935For mounting
0.25% Trypsin-EDTA (1X)Gibco25200-056
Penicillin StreptomycinGibco15140-122
Charcoal Stripped Fetal Bovine SerumSigmaF6765-500ML
Sodium Bicarbonate (7.5%)Gibco25080-094
Ficoll-Paque PLUS ReagentFisher Scientific45001749
Collagenase from Clostridium histolyticumSigmaC0130-1G
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigmaDN25-100MG
Medroxyprogesterone 17-acetateSigmaM1629-1GFor EPC Media
EstradiolSigmaE1024-1GFor EPC Media
cAMPSigmaA6885-100MGFor EPC Media
Fine straight stitch scissorsFine Science Tools15396-00
TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 ProbeApplied Biosystems4351372
Fetal Bovine Serum, heat inactivatedGibco10-082-147
Antibiotic-antimycoticThermo Scientific15240062
Hank’s Balanced Salt Solution Corning21-021-cv
50 mL conical polypropylene Falcon tubeCorning352098
Dumont #5/45 ForcepsFine Science Tools11251-35
100 x 15 mm Glass Petri dishVWR75845-546
40 micron cell strainerMidsci229481
Isotemp 215 Water bathFisher ScientificFS-215
LSE Centrifuge Corning6755
Human NCOA2 siRNA DharmaconL-020159-00Gene specific qPCR probe
Steri-cycle i160 CO2 Incubator Thermo Scientific51030301
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000For RNA quantification
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific50146771
75 cm Canted Neck Cell Culture flaskCorning430641U
6 well Non-Pyrogenic Cell Culture PlateCorning3506
Pipet Controller UltraCorning4099
PhotoshopAdobe19.0.1.334
25 cm Canted Neck Cell Culture flaskCorning7200876
Triton X-100SigmaX100-1L
15 mL conical polypropylene Falcon tubeCorning352099
10 mL SyringeBD302995
1300 Series A2 Biological Safety HoodThermo Scientific1377
accuspin Micro17 centrifugeFisher Scientific13100675
7500 Fast real time PCR systemApplied Biosystems3052632
EVOS FL Immunofluorescence MicroscopeLife Technologies01414-155G-291
Leica Inverted Light MicroscopeLeicaDMi1
IllrustratorAdobe22.0.1.253
Excel SpreadsheetsMicrosoft2016
Deckglaser 18 mm cover glassesNeuVitroGG-18
Reichert Bright-Line HemacytometerSigmaZ359629-1EA
2-mercaptoethanolFisher BioreagentsBP176-100For RNA lysis buffer
1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic VialCorning430658For freezing HESC cells 
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)SigmaD2650-100mLFor freezing media

References

  1. Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
  2. Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
  3. Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
  4. Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
  5. Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
  6. Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
  7. Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
  8. Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
  9. Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
  10. Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
  11. Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
  12. Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
  13. Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
  14. Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
  15. Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
  16. Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
  17. Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

139 siRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved