JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Это исследование представляет проверяемое и оптимизированы процедуры для изоляции и культуры стромальных клеток человека эндометрия проводить в пробирке decidualization assay. Кроме того это исследование предоставляет подробный метод эффективно нокдаун конкретных генов, используя малые интерферирующие РНК в клетках стромы человека эндометрия.

Аннотация

Дифференциация эндометрия стромальных клеток человека (Госкомсанэпиднадзором) от фибробластоподобных появление в секреторную decidua является преобразования, необходимые для имплантации эмбриона в слизистую оболочку матки в материнской утробе. Неправильное decidualization был создан как причины для имплантации неудачи и последующих раннего эмбриона выкидыша. Таким образом понимание молекулярных механизмов лежащих в основе decidualization выгодно повышение показателя успешных родов. В естественных условиях на основе исследования искусственных decidualization часто ограничения вследствие этических дилемм, связанных с исследований человеческого, а также поступательное осложнения в течение животных моделей. В результате в пробирке анализов через культуры главной ячейки часто используются для изучения модуляции decidualization через гормоны. Это исследование содержит подробный протокол для изоляции Госкомсанэпиднадзором и последующие искусственные decidualization через добавок гормонов в среде культивирования. Кроме того это исследование предоставляет хорошо продуманных метод нокдаун любой ген интереса, используя transfections на основе липидов siRNA. Этот протокол позволяет оптимизацию культуры чистоты, а также выход продукта, тем самым максимального способность использовать эту модель как надежный способ понять молекулярные механизмы, лежащих в основе decidualization и последующее количественная оценка выделяется агенты decidualized стромальные клетки эндометрия.

Введение

На этапах менструации и менопаузы женщин репродуктивного возраста проходят месячные циклы гормона регулируется эндометрия распространения, дифференциация и последующих пролить в рамках подготовки к беременности в процессе, известном как менструация1 ,2. Такие физические изменения человеческого эндометрия являются необходимыми для надлежащего эмбриона имплантации в матки стены1. Изменения эндометрия, включая биохимические и морфологические адаптации, опосредованного на протяжении менструального цикла через яичников стероидных гормонов эстрогена и прогестерона (P4)3,4,5. В течение этапа пролиферативной (или фолликулярной) preovulatory эстроген уровнях увеличения, инициирование утолщение эндометрия. После овуляции фазы секреторной (или лютеиновой) способствует значительное увеличение концентрации P4, вызывая морфологических трансформации эндометрия стромальных клеток (ESC) от фибробластоподобных внешний вид к округлые, децидуальной клетки эпителия как в процессе, известном как decidualization4,6. Неправильное decidualization был создан как причины для отказа имплантации и последующих раннего эмбриона выкидыш4,7,8. Таким образом понимание молекулярных механизмов лежащих в основе decidualization выгодно для диагностики и лечения ранних потери беременности.

В настоящее время несколько методов используются для изучения базовых эффектов decidualization на стромальные клетки эндометрия. В естественных условиях, мыши матки может быть искусственно вызываемые для decidualization через механической стимуляции (т.е., царапин) или масло инъекций в гормонально загрунтовать матки9. Отличаются от людей, это синтетический стимуляции способствует дифференциация матки люмен, обеспечивая появление бластоциста присутствия, шаг, который требуется для инициирования decidualization грызунов10,11. Соответственно, поступательные осложнения, связанные с Животные модели и этические дилеммы, окружающих в естественных условиях на основе исследования на людях, decidualization на основе модели наиболее успешно изучал в пробирке.

В этом исследовании предметы набираются через размещение рекламы в обоих местных газетах английский и испанский. Предметы, которые определены в качестве подходящих кандидатов для этого исследования привлекаются встретиться с координатором исследований, в котором обсуждаются полное раскрытие потенциальных рисков. После подтверждения полного понимания потенциальных рисков достигается согласие испытуемых в письменной и устной формах. Предметом согласия включает разрешение (1) проходят кровопускания (2) длительного хранения их тканей для будущих исследований и (3) согласиться на создание первичных культур от ткани собранных образцов. После согласия темы даны формы для завершения в которых разрешается самоидентификации расы/этнической принадлежности и/или право неразглашения. Последующий визит планируется достичь биопсию эндометрия, основанный на субъекта менструального цикла. Добровольцев, набираемых для этого исследования отражают этнические и расовые демография в Сент-Луисе митрополит регионе как документально подтверждено 2012 переписи и не с участием любых уязвимых групп населения, в том числе беременные женщины, плод, эмбрионы, Дети до 18 лет возраста, или других уязвимых групп. Требования для участия в коллекции биопсии образца включают (1) людей в возрасте от 18-45 лет (2), имеющих регулярный менструальный цикл (25-32 дней), (3) не имея текущий беременности или использование гормональных/внутриматочные контрацептивы за 30 дней до подачи заявок (4) без текущего вагинальной инфекции и венерических заболеваний (5) не текущего лечения антибиотиками, и (6) имея не текущей пап.

В рамках этого исследования культурный и искусственно вызванного пройти в пробирке decidualization через добавок гормонов (эстрадиола (Е2), медроксипрогестерона ацетат (МПа) и циклической аденозин стромальные клетки человека эндометрия (Госкомсанэпиднадзором) монофосфат (лагерь)) в среде. В этом методе степень decidualization изменяется основанный на общее количество дней гормонального лечения. В сочетании с цитоскелета перегруппировки гормональных добавок индуцирует биохимической адаптации, в которых децидуальной клетки опыт секреторной подобных качеств2,4. Экспрессии генов, отличительной чертой, как Пролактин (ПРЛ) и белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста 1 (IGFBP1), могут быть использованы для подтверждения и количественно оценить степень Госкомсанэпиднадзором decidualization5,12, 13 , 14. Важно отметить, что также продемонстрировал жизнеспособность этого протокола для проведения конкретных нокдаун гена.

протокол

Все биопсии человеческой эндометрия, собранные для этого исследования были достигнуты от Университет Вашингтона в Сент-Луисе, Кафедра акушерства и гинекологии с помощью институционального обзора Совет (IRB) утвердил форму письменного согласия.

1. Подготовка

  1. Подготовка 500 мл 1 x Хэнка сбалансированный соли раствора (HBSS) путем добавления СМИ содержащие бутылки (далее упоминается как HBSS + средний) 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл.
  2. Подготовка 500 мл Дульбекко изменения среды орла: питательной смеси F-12 (DMEM/F12) с 15 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES), добавляя 1% раствор антибиотика противогрибковое (конечная концентрация фенола красного и L-глютамина Это 100 ед/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл Fungizone) к средствам массовой информации, содержащие бутылка (далее упоминается как Госкомсанэпиднадзором изоляции СМИ).
  3. Подготовка 500 мл DMEM/F12 с фенола красного, L-глютамин и 15 мм HEPES, добавляя 10% плода Bovine сыворотки (ФБС), 1 x Na2HCO3и 1% пенициллин (10000 ед/мл) и стрептомицин (10 000 мкг/мл) (стрептококк перо) СМИ содержащие бутылки (далее Ссылка на как Госкомсанэпиднадзором СМИ).
  4. Подготовка 500 мл с 2% снижение средних сыворотки с L-глютамином, бикарбонат натрия 2,4 г/Л и HEPES уголь раздели плода Bovine сыворотки (csFBS) и 1% перо стрептококк в средствах массовой информации, содержащие бутылка (далее упоминается как Decidualization СМИ).
  5. Подготовка 500 мл фенола Красного свободной среде DMEM/F12, добавив 2% угля раздели плода бычьим сывороточным (csFBS) в средствах массовой информации, содержащие бутылка (далее упоминается как изменения СМИ).
  6. Подготовка 10 Нм эстрадиола (Е2), медроксипрогестерона ацетат 1 мкм (МПа) и 50 мкм циклический аденозинмонофосфат (лагерь) в 15 мл полипропиленовые Конические трубки и добавить по 2 мл в хорошо Алиготе ранее подготовленные decidualization СМИ в пробирке decidualization проба (далее упоминается как EPC СМИ).
  7. Подготовка 50 мл замораживания средств массовой информации с 90% FBS и 10% диметилсульфоксида (ДМСО) в 50 мл полипропиленовые Конические трубки (далее упоминается как замораживание средств массовой информации).
  8. Предварительно весят 25 мг коллагеназы и 5 мг DNase I в 50 мл конические полипропиленовые трубы и хранить при температуре от-20 ° C.

2. человека эндометрия биопсии приобретение

  1. Получение человека эндометрия биопсии образцов, собранных в пролиферативной стадии (день 9 - 12 день) менструального цикла из клиники IRB утвержденных в HBSS.
  2. Вымойте биопсии образцы с 1 мл раствора подогретую 37 ° C HBSS + среднего и осторожно встряхнуть, чтобы удалить избыток крови и слизи.

3. изоляция клетки стромы эндометрия человека (Госкомсанэпиднадзором)

Примечание: Эта процедура изоляции производится в стерильных условиях под биологической безопасности кабинета.

  1. Перевести биопсии стерилизовать пинцетом в 50 мл конические полипропиленовые пластиковых пробирок, содержащие 10 мл свежего HBSS.
  2. Центрифуга для биопсии при комнатной температуре на 500 g x 90 s.
    1. Если ячейка Пелле разрывов, повторно спина биопсию в 2000 g x 90 s.
  3. Удалите носитель с помощью пипетки 1 мл и мыть с 10 мл 37 ° C подогретую Госкомсанэпиднадзором изоляции СМИ после центрифугирования в g 500 x 90 s.
  4. Удалите носитель с помощью пипетки 1 мл и энергично добавить 3 мл свежего Госкомсанэпиднадзором изоляции СМИ выбить биопсии.
  5. Декант биопсии в чашку Петри, содержащие 5 мл Госкомсанэпиднадзором изоляции средств массовой информации.
  6. Фарш биопсии в как маленькие кусочки, как можно с помощью тонкой прямой стежок ножницы и #5 щипцы для около 20 минут.
  7. Подготовить DNase I и коллагеназы ферментов, добавив 10 мл Госкомсанэпиднадзором изоляции СМИ предварительно взвешенный DNase I (0.5 мг/мл) и коллагеназы (2,5 мг/мл). Смешать с пипетки.
  8. Пипетка вырезать образцы тканей с помощью пипетки 1 мл в новой 50 мл конические полипропиленовой трубки. Вымойте с 7 мл Госкомсанэпиднадзором изоляции средств массовой информации и добавить в полипропиленовые трубы приобрести полный пример.
  9. Центрифуга образца при комнатной температуре на 800 x g на 2 мин осторожно удалить супернатант, пипетки.
  10. Фильтр DNase I и коллагеназы решения через 0,2 мкм фильтром придает шприц 10 мл непосредственно на пеллетах.
  11. Вортекс для 10 s Ресуспензируйте Пелле.
  12. Дайджест в водяной бане 37 ° C для 1,5 ч, vortexing для 10 s тщательно каждые 10 мин, пока ткань переваривается.
  13. Образец фильтра через стрейнер клеток 40 мкм, укладываются над 50 мл конические полипропиленовой трубки удалить эпителиальных клеток и тканей мусора.
    Примечание: Стромальные клетки находятся в 50 мл конические полипропиленовые трубы.
  14. Центрифуга конические полипропиленовые Тюбик 50 мл на 800 x g за 2,5 мин при комнатной температуре. Осторожно удалите супернатант с Пипетка 1 мл.
  15. Ресуспензируйте гранулы в 10 мл Госкомсанэпиднадзором изоляции средств массовой информации.
  16. Центрифуга на 800 x g за 2,5 мин при комнатной температуре. Аспирационная супернатанта и затем Ресуспензируйте клетки в 6 мл Госкомсанэпиднадзором СМИ и пипетки прямого и обратного смешивать.
  17. Медленно слой на 3 мл градиента плотности СМИ ресуспензированы клеток, чтобы отделить остальные клетки крови от стромальных клеток, соблюдая осторожность, чтобы не смешивать слои.
  18. Центрифуга 15 мл полипропиленовые трубы на 400 x г за 30 мин при комнатной температуре.
  19. Собирать 5 мл супернатант в новой 50 мл трубки из полипропилена и добавить дополнительные 5 мл Госкомсанэпиднадзором СМИ Ресуспензируйте клетки.
  20. Центрифуга на 800 x g за 2,5 мин при комнатной температуре, затем удаления супернатанта и дополнение 6 мл Госкомсанэпиднадзором средств массовой информации. Вихревой образца для 10 s и микс от закупорить прямого и обратного 5 раз.
  21. Аликвота 10 мкл вновь приостановлено клеток в 1,5 мл microcentrifuge трубку для клеток.
  22. 10 мкл 0,4% Трипановый синий краситель ячейки Алиготе и смешать с пипетки. Загрузить 10 мкл Алиготе и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева.
  23. Пластина клетки в соответствующие колбу зависит количество ячейке в 15 мл Госкомсанэпиднадзором СМИ.
    1. Если общее количество клеток менее 1 миллиона человек, плиты все ячейки в колбу 25-см с 6 мл Госкомсанэпиднадзором средств массовой информации. Если общее количество клеток более чем 1 миллион, плиты все клетки в колбе 75 см с 15 мл Госкомсанэпиднадзором средств массовой информации.
  24. Культура клетки в инкубаторе2 CO 5% при 37 ° C не менее 6 ч для обеспечения надлежащего клеточной адгезии и изменить СМИ Госкомсанэпиднадзором СМИ.
  25. Культуры изолированных Госкомсанэпиднадзором в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C в течение 3-5 дней до тех пор, пока клетки формируют монослоя, достижение 80-90% confluency в покрытием колбы.
  26. Изменить Госкомсанэпиднадзором СМИ каждые два дня.
    1. Теплый Госкомсанэпиднадзором СМИ в ванну воды 37 ° C 15-20 мин.
    2. Аспирационная СМИ от колбу и добавить свежие Госкомсанэпиднадзором СМИ в колбу (Рабочий объём: 8 мл или 16 мл флакон 25-см или 75-см соответственно).
    3. Колба место обратно в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C, пока не будет достигнуто confluency 80-90%.
  27. После того как Госкомсанэпиднадзором стали 80-90% притока, передавать клетки от 25-см до 75 см колбу или один флакон 75 см три колбы 75см.
    Примечание: Госкомсанэпиднадзором можно замороженные и сохранены для последующего использования в настоящее время для будущих экспериментов.

4. Замораживание и размораживание ЭСК

  1. Аспирационная СМИ от 75-cm колбу и добавить 2 мл трипсина-ЭДТА.
  2. Инкубируйте в 5% CO2 инкубатора для 2-3 мин при 37 ° C, до тех пор, пока клетки выбить из колбы.
  3. Добавление 7 мл Госкомсанэпиднадзором СМИ и перемешать хорошо, закупорить вперед и назад.
  4. Центрифуга на 800 x g за 2,5 мин и удалить супернатант.
  5. Метка, замораживания труб с клеточной линии, Дата и номер прохода.
  6. Вновь приостановите Пелле клеток в 5 мл замораживания средств массовой информации.
  7. Аликвота 1 мл вновь приостановлено Госкомсанэпиднадзором для каждой трубки и передачи трубы до-80 ° C морозильник.
  8. Передавать трубки жидкий азот в течение 24 часов.
    Примечание: Если вы планируете оттепель клетки в ближайшем будущем, храните замороженные клетки в-80 ° C на один месяц.
  9. Для размораживания ЭСК Разогрейте Госкомсанэпиднадзором СМИ за 20 мин.
  10. Добавьте 8 мл разогретой Госкомсанэпиднадзором СМИ в колбу 25-см.
  11. Получение замораживания труб из бака жидким азотом или -80 ° C и Погрузите трубку в водяной бане 37 ° C для 1-2 мин разморозить клетки.
  12. Передача талой Госкомсанэпиднадзором колбу 25-см с Госкомсанэпиднадзором СМИ и инкубировать в 5% CO2 инкубатора на ночь при 37 ° C.
  13. Следующий день, измените Госкомсанэпиднадзором СМИ и ждать 2-3 дня до тех пор, пока Госкомсанэпиднадзором стать вырожденная и передать 75см колба как описано ниже в протокол 5 клеток.
    1. Теплый Госкомсанэпиднадзором СМИ в ванну воды 37 ° C 15-20 мин.
    2. Аспирационная СМИ от колбу и добавить свежие Госкомсанэпиднадзором СМИ в колбу (Рабочий объём: 8 мл или 16 мл флакон 25-см или 75-см соответственно).
    3. Колба место обратно в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C, пока не будет достигнуто confluency 80-90%.

5. Культивирование клеток стромы эндометрия человека (Госкомсанэпиднадзором)

Примечание: Эта процедура Culturing производится в стерильных условиях под биологической безопасности кабинета.

  1. Подогрейте Госкомсанэпиднадзором СМИ при 37 ° C на водяной бане 20-30 мин.
  2. Аспирационная СМИ от колбу и добавить 0,25% трипсина Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (1 мл флакон 25-см или 2 мл флакон 75 см).
  3. Инкубируйте в инкубаторе2 CO 5% при 37 ° C на 2-3 мин до тех пор, пока клетки выбить.
  4. Аккуратно нажмите колбу стены, чтобы выбить оставшиеся ячейки. Добавление 7 мл Госкомсанэпиднадзором СМИ и перемешать хорошо, закупорить вперед и назад.
  5. Накапайте в ячейку смесь в 50 мл конические полипропиленовые трубы и центрифуги на 800 x g за 2,5 мин при комнатной температуре.
  6. Аспирационная супернатант и вновь приостановить Пелле клеток в Госкомсанэпиднадзором СМИ.
    1. Добавьте 15 мл флакон 25-см или 45 мл флакон 75 см (15 мл).
  7. Добавьте 5 мл или 15 мл суспензии клеток в каждой колбу 25-см или 75-см соответственно.
  8. Культуры изолированных Госкомсанэпиднадзором в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C в течение 3-5 дней до тех пор, пока клетки формируют монослоя, достижение 80-90% confluency в покрытием колбы.
  9. Изменить Госкомсанэпиднадзором СМИ каждые два дня.
    1. Теплый Госкомсанэпиднадзором СМИ в ванну воды 37 ° C 15-20 мин.
    2. Аспирационная СМИ от колбу и добавить свежие Госкомсанэпиднадзором СМИ в колбу (Рабочий объём: 8 мл или 16 мл флакон 25-см или 75-см соответственно).
    3. Колба место обратно в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C, пока не будет достигнуто confluency 80-90%.

6. человека эндометрия стромальные клетки (Госкомсанэпиднадзором) покрытия и siRNA Transfection

Примечание: Эта процедура трансфекции производится в стерильных условиях под биологической безопасности кабинета.

  1. Аспирационная Госкомсанэпиднадзором СМИ от 75-cm колбу и добавить 2 мл 0,25% раствора трипсина ЭДТА.
  2. Инкубируйте в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C на 2-3 мин до тех пор, пока клетки выбить.
  3. После того, как клетки выбили из колбы, добавить 7 мл Госкомсанэпиднадзором СМИ и смешайте нежно закупорить вперед и обратного 5 раз.
  4. Накапайте в ячейку смесь в 50 мл конические полипропиленовые трубы и центрифуги на 800 x g за 2,5 мин при комнатной температуре. Аспирационная супернатант и вновь приостановить Пелле клеток в 10 мл Госкомсанэпиднадзором средств массовой информации.
    Примечание: Если покрытие клетки от более чем одной колбе, просто увеличьте объем Госкомсанэпиднадзором СМИ.
  5. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева.
    1. Аликвота 10 мкл вновь приостановлено клеток в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
    2. 10 мкл 0,4% Трипановый синий краситель ячейку аликвота и mix закупорить вперед и обратного.
  6. Плиты 0,8 x 105 клеток на скважину в 6-ну пластины. После двух дней клетки должны быть 60-70% притока для оптимального transfection.
  7. Для каждого образца трансфекции siRNA Подготовьте комплексы, с помощью малых интерферирующих РНК (60 наномоль) к трансфекции реагента.
  8. Разбавить 5 мкл Реагента трансфекции в 150 мкл сокращение сыворотке свободных средств массовой информации и инкубировать в течение 5 мин.
  9. Разбавляют 60 наномоль интерферирующей РНК в 100 мкл сокращение сыворотке свободных средств массовой информации и инкубировать в течение 5 мин.
  10. После 5 минут объединить разреженных siRNA с разбавленным трансфекции реагент решения и смешайте нежно закупорить вперед и обратного 5 раз.
    Примечание: Если transfecting одного или более малых интерферирующих РНК в нескольких скважин, подготовьте мастер смесь в 10 мл полистирола трубы.
  11. Инкубируйте малых интерферирующих РНК трансфекции реагент комплексы для 5 мин при комнатной температуре.
  12. Во время этой инкубации добавьте 1 mL изменения средств массовой информации в каждой скважине.
  13. После 5 минут инкубации центрифуга трубы на 500 x g для 2 минут для сбора раствора и 250 мкл малых интерферирующих РНК трансфекции реагент комплексов каждому хорошо содержащие клетки и СМИ.
  14. Смешайте нежно покачиваясь и инкубации клеток при 37° C в 5% CO2 инкубатора для 5 h.
  15. После 5 h измените СМИ Госкомсанэпиднадзором СМИ.
  16. Проинкубируйте 2 дней в рамках подготовки в пробирке decidualization assay клетки при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора.

7. в пробирке Decidualization Assay

Примечание: Этот assay производится в стерильных условиях под биологической безопасности кабинета.

  1. Подготовка EPC СМИ до начала лечения decidualization в пробирке , как описано в Камден et al. 3 (см. 1.6).
  2. Аспирационная СМИ от пост-48 часа, что transfected линии Госкомсанэпиднадзором инкубировали с шагом 6.16.
  3. Добавьте 2 мл в каждую лунку EPC СМИ.
    Примечание: как элемент управления, отпуск, один набор клеток лечить с EPC СМИ. Вместо этого добавьте 2 мл Госкомсанэпиднадзором СМИ управления скважин.
  4. Инкубируйте клетки в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C в течение 6 дней.
    1. Измените EPC СМИ каждые 48 часов.
      1. Теплый и подготовить EPC СМИ в ванну воды 37 ° C 15-20 мин.
      2. Аспирационная СМИ из колодца и добавить свежие EPC СМИ.
      3. Поместите пластины обратно в 5% CO2 инкубатора 37 ° c.
  5. После шестой день Проанализируйте степень decidualization стромальные клетки через ИФА и ПЦР qRT (как описано ниже).

8. Проверка In Vitro Decidualization использованием количественного PCR реального времени (qRT-PCR)

Примечание: qRT-PCR будет завершена, как описано в Kommagani et al10.

  1. Изолируйте всего РНК с Госкомсанэпиднадзором, используя протокол от коммерчески доступных комплект изоляции РНК.
    1. Анализ количества РНК и чистоты (260/a280) с помощью NanoDrop или аналогичной методологии как описано в Гарсия-Элиас et al15.
  2. Синтез cDNA от 1 мкг всего РНК через протокол комплект коммерчески доступных обратной транскрипции.
  3. Запустите qRT ПЦР-реакции, как описано в протоколе комплект коммерчески доступных qRT-PCR.
    1. Выполните использование коммерчески доступных Mix PCR Master реального времени реакции и гена конкретных зонды наряду с внутренней системы контроля (18s, ПРЛи IGFBP1).

9. Проверка Decidualization In Vitro , используя ELISA

  1. Количественно секретируемые уровни пролактина носителя культуры ткани, использование коммерчески доступных комплект пролактина ELISA.

10. Проверка Decidualization In Vitro , используя Фаллоидин пятнать.

  1. Вставьте стерильную coverslips в каждой скважине 12 хорошо плиты.
  2. Повторите шаги 6.1-6.5.
  3. Плиты 0,8 x 105 клеток на колодец 12 хорошо плиты.
  4. Инкубируйте клетки в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C в течение 2 дней.
  5. Аспирационная средств массовой информации.
  6. Повторите шаги 7.3-7.4.
  7. Исправьте ячейки в параформальдегида 4% (PFA) в фосфатный буфер (PBS) при комнатной температуре за 30 мин.
  8. Аспирационная решение фиксации и мыть 3 раза с 1 мл PBS на 5 мин.
  9. Добавьте 0,1% неионные ПАВ полиэтиленгликоль трет октиловый фенил эфира в PBS для 5 мин на фиксированные ячейки для увеличения проницаемости.
  10. Вымойте 3 раза с 1 мл PBS на 5 мин.
  11. 100 мкл раствора Фаллоидин на coverslip и инкубации при комнатной температуре 90 мин.
    1. Подготовьте разбавления 1: 100 в PBS с помощью Фаллоидин Стоковый раствор в 1 единицу в 5 мкл.
  12. Вымойте 3 раза с 1 мл PBS на 5 мин.
  13. Смонтируйте слайды с монтажа носитель, содержащий 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
  14. Наблюдать за использованием конфокального микроскопа клетки.

Результаты

Decidualization в культуре Госкомсанэпиднадзором

После изоляции, эндометрия стромальные клетки человека были культивировали формирование монослоя с confluency 80-90% и индуцированных лечения с 10 Нм E2, 1 мкм МПа и 50 мкм лагерь в пробирке...

Обсуждение

Женского репродуктивного менструального цикла характеризуется ростом уровня прогестерона течение лютеиновой фазы, тем самым вызывая decidualization ESC в круглых, эпителиальные как секреторные клетки3,8. Начало decidualization является зависимых видов. В организме чел...

Раскрытие информации

Эта работа поддерживается финансирование от национальных институтов здравоохранения (НИЗ) / Национальный институт здоровья детей и развития человека (NICHD) Грант (R00 HD080742) и ввод в эксплуатацию Вашингтона школы медицины университета средств на р.к. Мы хотели бы поблагодарить клинике рождаемости университета Вашингтона для предоставления образцы биопсии эндометрия.

Благодарности

Авторы не имеют ничего сообщать.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Opti-MEM I (1X) Reduced Serum MediumGibco31985-070For decidualization media
DMEM / F12 (1:1) (1X)Gibco11330-032
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061For cell count
PureLink RNA Mini KitInvitrogen12183018AFor RNA Isolation/Purification
TaqMan 2X Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
High Capacity cDNA Reverse Transcription KitApplied Biosystems4374967
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous ControlLife Technologies4319413EFor qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay Prolactin ProbeApplied Biosystems4331182For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 ProbeApplied Biosystems4331182For qPCR internal control
Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainterAbcamab176753
Human Prolactin ELISA KitInvitrogenEHIAPRL
16% ParaformaldehydeAlfa Aesar30525-89-4Fixative
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen13778150Transfection Reagent
ProLong Gold antifade reagent with DAPIInvitrogenP36935For mounting
0.25% Trypsin-EDTA (1X)Gibco25200-056
Penicillin StreptomycinGibco15140-122
Charcoal Stripped Fetal Bovine SerumSigmaF6765-500ML
Sodium Bicarbonate (7.5%)Gibco25080-094
Ficoll-Paque PLUS ReagentFisher Scientific45001749
Collagenase from Clostridium histolyticumSigmaC0130-1G
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigmaDN25-100MG
Medroxyprogesterone 17-acetateSigmaM1629-1GFor EPC Media
EstradiolSigmaE1024-1GFor EPC Media
cAMPSigmaA6885-100MGFor EPC Media
Fine straight stitch scissorsFine Science Tools15396-00
TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 ProbeApplied Biosystems4351372
Fetal Bovine Serum, heat inactivatedGibco10-082-147
Antibiotic-antimycoticThermo Scientific15240062
Hank’s Balanced Salt Solution Corning21-021-cv
50 mL conical polypropylene Falcon tubeCorning352098
Dumont #5/45 ForcepsFine Science Tools11251-35
100 x 15 mm Glass Petri dishVWR75845-546
40 micron cell strainerMidsci229481
Isotemp 215 Water bathFisher ScientificFS-215
LSE Centrifuge Corning6755
Human NCOA2 siRNA DharmaconL-020159-00Gene specific qPCR probe
Steri-cycle i160 CO2 Incubator Thermo Scientific51030301
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000For RNA quantification
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific50146771
75 cm Canted Neck Cell Culture flaskCorning430641U
6 well Non-Pyrogenic Cell Culture PlateCorning3506
Pipet Controller UltraCorning4099
PhotoshopAdobe19.0.1.334
25 cm Canted Neck Cell Culture flaskCorning7200876
Triton X-100SigmaX100-1L
15 mL conical polypropylene Falcon tubeCorning352099
10 mL SyringeBD302995
1300 Series A2 Biological Safety HoodThermo Scientific1377
accuspin Micro17 centrifugeFisher Scientific13100675
7500 Fast real time PCR systemApplied Biosystems3052632
EVOS FL Immunofluorescence MicroscopeLife Technologies01414-155G-291
Leica Inverted Light MicroscopeLeicaDMi1
IllrustratorAdobe22.0.1.253
Excel SpreadsheetsMicrosoft2016
Deckglaser 18 mm cover glassesNeuVitroGG-18
Reichert Bright-Line HemacytometerSigmaZ359629-1EA
2-mercaptoethanolFisher BioreagentsBP176-100For RNA lysis buffer
1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic VialCorning430658For freezing HESC cells 
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)SigmaD2650-100mLFor freezing media

Ссылки

  1. Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
  2. Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
  3. Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
  4. Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
  5. Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
  6. Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
  7. Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
  8. Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
  9. Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
  10. Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
  11. Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
  12. Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
  13. Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
  14. Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
  15. Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
  16. Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
  17. Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

139siRNA transfection decidualization

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены