Isolement de cellules du stroma endométriales humains pour In Vitro décidualisation

Résumé

Cette étude présente une procédure validée et optimisée pour l’isolement et la culture de cellules stromales endométriales humaines pour mener l’essai in vitro décidualisation avec. En outre, cette étude fournit une méthode détaillée pour efficacement défiant un gène spécifique à l’aide de siARN dans les cellules du stroma endométriales humains.

Résumé

La différenciation des cellules stromales endomètre humaines (CSEh) de fibroblastes-comme l’aspect en decidua sécrétoire est une transformation nécessaire pour l’implantation de l’embryon dans la muqueuse utérine de l’utérus maternel. Décidualisation incorrecte a été établie comme une cause de racine d’échec d’implantation et ultérieures déni d’embryon précoce. Comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la décidualisation est donc avantageux d’améliorer le taux de naissances avec succès. In vivo études de décidualisation artificielle limitent souvent due à des dilemmes éthiques associées à la recherche humaine, ainsi que des complications translationnelles dans des modèles animaux. Ainsi, des essais in vitro par culture de cellules primaires servent souvent pour explorer la modulation de décidualisation via les hormones. Cette étude fournit un protocole détaillé pour l’isolement des CSEh et ultérieure décidualisation artificielle par l’intermédiaire de la supplémentation d’hormones dans le milieu de culture. En outre, cette étude fournit une méthode bien conçue pour knockdown aucun gène d’intérêt en utilisant la base de lipides siARN transfections. Ce protocole permet l’optimisation de la pureté de la culture mais aussi de rendement produit, maximisant ainsi la possibilité d’utiliser ce modèle comme une méthode fiable pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents décidualisation et la quantification ultérieure des agents sécrétés par les cellules du stroma endométriales decidualized.

Introduction

Entre les étapes de la puberté et la ménopause, les femmes en âge de procréer subissent des cycles mensuels de prolifération endométriale hormone réglementés, différenciation et excrétion ultérieure en vue de la grossesse dans un processus appelé menstruation^{1 ,2}. Ces modifications physiques de l’endomètre humain sont nécessaires pour l’implantation de l’embryon appropriée dans la paroi utérine¹. Modifications de l’endomètre, y compris les adaptations morphologiques et biochimiques, sont effectuent tout au long du cycle menstruel par l’intermédiaire des hormones stéroïdes ovariens oestrogène et la progestérone (P4)^3,4,5. Dans la phase proliférative (ou folliculaire), œstrogène préovulatoire niveaux augmentation, initiant l’épaississement de l’endomètre. Après l’ovulation, la phase sécrétoire (ou lutéale) favorise une augmentation significative des concentrations de P4, induisant la transformation morphologique des cellules du stroma endométriales (ESC) de fibroblastes-comme l’aspect des arrondis, les cellules épithéliales déciduale dans un processus appelé décidualisation^4,6. Décidualisation incorrecte a été établie comme des causes profondes pour échec d’implantation et ultérieures début embryon fausse couche^4,7,8. Par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la décidualisation est avantageuse pour le diagnostic et le traitement de la perte précoce de la grossesse.

Actuellement, plusieurs méthodes sont utilisées pour examiner les effets sous-jacents de décidualisation sur les cellules du stroma endométriales. In vivo, l’utérus de souris peut être induite artificiellement pour décidualisation via une stimulation mécanique (c.-à-d., grattage) ou injection dans un utérus hormonalement apprêtée⁹d’huile. Distincte de l’homme, cette stimulation synthétique favorise la différenciation de la lumière utérine en offrant l’apparence de la présence de blastocyste, une étape qui est requise pour l’ouverture de décidualisation rongeurs^10,11. En conséquence, en raison de complications translationnelles associées à des modèles animaux et les dilemmes éthiques qui entourent en vivo basé des études chez l’homme, modèles de décidualisation basée sont étudiés avec plus de succès in vitro.

Dans cette étude, les sujets sont recrutés par le placement de publicités dans les deux journaux locaux en anglais et en espagnol. Sujets identifiés comme des candidats appropriés pour cette étude sont présentées rencontrer le coordonnateur de la recherche, dans lequel une divulgation complète des risques potentiels sont discutés. Lors de la confirmation d’une compréhension complète des risques potentiels, le consentement des sujets est atteint sous forme écrite et verbale. Consentement du sujet inclut la permission de (1) subissent une phlébotomie (2) durablement de leurs tissus à des fins de recherches futures et (3) d’accord pour la création de cultures primaires d’après des échantillons de tissus prélevés. Après consentement, les sujets reçoivent un formulaire à remplir dans lequel auto-identification permise d’ethnie et/ou le droit de non-divulgation. Une visite ultérieure est prévue pour atteindre la biopsie de l’endomètre basée sur le cycle menstruel du sujet. Volontaires recrutés pour cette étude reflètent les deux la démographie ethnique et raciale de la région métropolitaine de Saint-Louis, répertoriés par le recensement 2012 et n’impliquant pas la participation d’une population vulnérable, y compris les femmes enceintes, les fœtus, les embryons, enfants de moins de 18 ans d’âge, ou d’autres groupes vulnérables. Conditions d’admissibilité à la participation à la collecte d’échantillons de biopsie incluent (1) être âgés de 18 à 45 ans (2) ayant des cycles menstruels réguliers (25 à 32 jours) (3) n’ayant aucun grossesse actuelle ou l’utilisation de contraceptifs hormonaux/intra-utérine périphérique pendant 30 jours précédant l’inscription (4) n’ayant aucun courante infection vaginale ou les maladies sexuellement transmissibles (5) vu aucun traitements antibiotiques actuels et (6) n’ayant aucun courant frottis de Pap.

Dans cette étude, les cellules stromales endométriales humaines (CSEh) sont cultivées et artificiellement induits in vitro la décidualisation par lorsqu’il s’agit d’hormones (estradiol (E2), l’acétate de médroxyprogestérone (MPA) et adénosine cyclique de subir monophosphate cyclique (AMPc)) au milieu. Dans cette méthode, le degré de décidualisation est modifié basée sur le nombre total de jours de traitement hormonal. Parallèlement à la réorganisation du cytosquelette, la supplémentation hormonale induit des adaptations biochimiques dans lequel les cellules déciduale expérience sécrétoire qualités^2,4. L’expression des gènes de hallmark, tels que la prolactine (PRL) et la protéine de liaison d’insuline-like growth factor 1 (IGFBP1), peut être utilisée pour confirmer et quantifier le degré de CSEh décidualisation^{5,12, 13 , 14}. ce qui est important, la viabilité de ce protocole pour mener de précipitation spécifique de gène est également démontrée.

Protocole

Toutes les biopsies de l’endomètre humain recueillies pour cette étude ont été obtenus de l’Université de Washington à St. Louis, Département d’obstétrique et gynécologie à l’aide de l’Institutional Review Board (IRB) a approuvé le formulaire de consentement.

1. préparation

1. Préparer 500 mL de 1 x de Hank Balanced Salt Solution (HBSS) en ajoutant 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine à la bouteille contenant de médias (plus référencée comme HBSS + support).
2. Préparer 500 mL de milieu d’Eagle modifié de Dulbecco : mélange de nutriments F-12 (DMEM/F12), avec le rouge de phénol, L-glutamine et l’acide-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 15 mM 4 (HEPES) en ajoutant 1 % solution antibiotique-antimycosiques (la concentration finale est 100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine et 0,25 µg/mL Fungizone) aux médias contenant bouteille (plus référencée comme les milieux d’isolement CSEh).
3. Préparer 500 mL de DMEM/F12 avec rouge de phénol, de L-glutamine et 15 mM HEPES en ajoutant 10 % sérum bovin fœtal (SVF), 1 x Na₂HCO₃et 1 % la pénicilline (10 000 U/mL) et à la streptomycine (10 000 µg/mL) (Pen Strep) aux médias contenant bouteille (plus référencé en tant que média de CSEh).
4. Préparer 500 mL de milieu de sérum réduit avec la L-Glutamine, 2,4 g/L de bicarbonate de sodium et HEPES avec 2 % charbon dépouillé sérum de veau fœtal (csFBS) et 1 % Pen Strep aux médias contenant bouteille (encore appelé décidualisation Media).
5. Préparer 500 mL de phénol rouge gratuit DMEM/F12 en ajoutant 2 % de charbon de bois dépouillé de sérum de veau fœtal (csFBS) dans les médias contenant bouteille (plus référencée comme médias de changement).
6. Préparer 10 nM estradiol (E2), acétate de médroxyprogestérone 1 µM (MPA) et 50 µM adénosine monophosphate cyclique (AMPc) dans un tube conique polypropylène 15 mL et ajouter à une 2 mL par puits aliquote de médias de décidualisation préalablement préparée pour in vitro dosage de décidualisation (plus référencé comme support de la CBE).
7. Préparer 50 mL de gel médias avec 90 % de SVF et 10 % de diméthyl sulfoxide (DMSO) dans un tube conique polypropylène de 50 mL (plus référencé comme support de congélation).
8. Les peser 25 mg de collagénase et 5 mg de DNase I dans un tube en polypropylène 50 mL conique et conserver à-20 ° C.

2. Acquisition de biopsie de l’endomètre humain

1. Obtenir des échantillons de biopsie de l’endomètre humain recueillis lors de la phase proliférative (jour 9 - 12 jours) du cycle menstruel de la clinique de la CISR a approuvé à HBSS.
2. Laver des biopsies avec 1 mL de préchauffée à 37 ° C HBSS + moyennes et secouez légèrement pour enlever l’excès sanguin et de la muqueuse.

3. isolement de cellules stromales endométriales humaines (CSEh)

Remarque : Cette procédure d’isolement est réalisée dans un environnement stérile sous une hotte de sécurité biologique.

1. Transférer la biopsie avec une pince stérilisée dans un tube à centrifuger conique de polypropylène 50 mL contenant 10 mL HBSS fraîches.
2. Centrifuger la biopsie à la température ambiante à 500 g pendant 90 s.
   1. Si les ruptures de culot cellulaire, re-spin la biopsie à 2 000 x g pendant 90 s.
3. Retirez le support à l’aide d’une pipette de 1 mL et lavage avec 10 mL de 37 ° C préchauffé les milieux d’isolement de CSEh suivies par centrifugation à 500 g pendant 90 s.
4. Retirez le support à l’aide d’une pipette de 1 mL et vigoureusement ajouter 3 mL de frais milieux d’isolement de CSEh pour déloger la biopsie.
5. Décanter la biopsie dans une boîte de Pétri contenant 5 mL de milieux d’isolement de CSEh.
6. Émincer la biopsie en tant que petits morceaux possible à l’aide de #5 pinces et ciseaux fine point droit pendant environ 20 minutes.
7. Préparer la DNase I et enzymes collagénase en ajoutant 10 mL de milieux d’isolement CSEh à pré-pesés DNase I (0,5 mg/mL) et collagénase (2,5 mg/mL). Mélanger avec la pipette.
8. Pipette de coupe les échantillons de tissus à l’aide d’une pipette de 1 mL dans un nouveau tube polypropylène conique de 50 mL. Laver avec 7 mL de milieux d’isolement CSEh et ajouter dans le tube en polypropylène pour acquérir l’ensemble de l’échantillon.
9. Centrifuger l’échantillon à la température ambiante à 800 x g pendant 2 min. Retirez délicatement le surnageant de pipette.
10. Filtrer la DNase collagénase solution par le biais de 0,2 µm filtre et j’ai attachés à la seringue de 10 mL directement sur pellet.
11. Vortexer pendant 10 s pour remettre en suspension les granulés.
12. Digérer au bain-marie à 37 ° C pendant 1,5 h, vortex pour 10 s soigneusement toutes les 10 min, jusqu'à ce que le tissu est digéré.
13. Filtrer l’échantillon à travers une passoire de cellule 40 µm empilés sur un tube en polypropylène 50 mL conique pour éliminer les cellules épithéliales et les débris tissulaires.
    Remarque : Les cellules du stroma sont dans le tube en polypropylène 50 mL conique.
14. Centrifuger le tube polypropylène conique de 50 mL à 800 g pendant 2,5 min à température ambiante. Retirez délicatement le surnageant avec une pipette de 1 mL.
15. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieux d’isolement de CSEh.
16. Centrifuger à 800 g pour 2,5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et puis remettre en suspension les cellules dans 6 mL de CSEh Media et pipette avant et arrière pour mélanger.
17. Couche lentement sur 3 mL de média gradient de densité pour les cellules resuspendues afin de séparer les cellules restantes de sang des cellules stromales, en veillant à ne pas mélanger les couches.
18. Centrifuger le tube de 15 mL en polypropylène à 400 g pendant 30 min à température ambiante.
19. Collecter 5 mL du surnageant dans un nouveau tube en polypropylène 50 mL et ajouter une supplémentaire 5 mL CSEh Media pour remettre en suspension les cellules.
20. Centrifuger à 800 g pour 2,5 min à température ambiante, suivie de la suppression du liquide surnageant et ajout de 6 mL de milieu de CSEh. Vortex l’échantillon de 10 s et mélanger en pipettant également, avance et retour 5 fois.
21. Aliquote 10 µL de cellules remises en suspension à un tube de microtubes de 1,5 mL pour la numération des cellules.
22. Ajouter 10 µL de 0,4 % le bleu Trypan tache cellulaire aliquote et mélanger avec la pipette. Charger de 10 µL de l’aliquote et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
23. Plaque de cellules dans une fiole appropriée dépend du nombre de cellules total dans 15 mL de milieu de CSEh.
    1. Si le nombre total de cellules est inférieur à 1 million, plaque de toutes les cellules dans ballon 25 cm avec 6 mL de CSEh Media. Si le nombre total de cellules est plus de 1 million, plaque de toutes les cellules dans ballon 75 cm avec 15 mL de CSEh Media.
24. La culture des cellules dans un incubateur à CO 5 %₂ à 37 ° C pendant au moins 6 h pour assurer l’adhérence de la cellule appropriée et changer les médias en médias CSEh.
25. Culture le CSEh isolé dans un 5 % CO₂ incubateur à 37 ° C pendant une période de 3 à 5 jours jusqu'à ce que les cellules forment une monocouche atteindre 80-90 % confluence dans un ballon plaqué.
26. Changer les CSEh médias tous les deux jours.
    1. Médias de CSEh chaud dans un bain d’eau de 37 ° C pendant 15-20 min.
    2. Aspirer les médias de la fiole et ajouter des supports neufs de CSEh dans le ballon (volume de travail : 8 ou 16 mL par flacon de 25 cm ou 75 cm respectivement).
    3. Placer le ballon dans le 5 % CO₂ incubateur à 37 ° C jusqu'à ce que la confluence de 80 à 90 % est atteint.
27. Une fois CSEh devenir confluente de 80 à 90 %, les cellules de transfert de 25 cm à 75 cm flacon ou d’une fiole de 75 cm à trois flacons de 75 cm.
    NOTE : CSEh peut être congelé et stocké pour un usage ultérieur en ce moment d’expérimentation future.

4. gel et de dégel CSEh

1. Aspirer les médias de la fiole de 75 cm et ajouter 2 mL de trypsine-EDTA.
2. Incuber dans une étuve à₂ CO 5 % pendant 2-3 min à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules se déloger de la fiole.
3. Ajouter 7 mL de CSEh Media et mélanger bien en pipettant également, avant et arrière.
4. Centrifuger à 800 g pour 2,5 min et aspirer le surnageant.
5. Identifier les tubes gel avec lignée cellulaire, la date et le numéro de passage.
6. Resuspendre le culot dans 5 mL de gel de médias.
7. Aliquote 1 mL de la CSEh remises en suspension dans chaque tubes tube et transfert pour congélateur-80 ° C.
8. Transfert des tubes à l’azote liquide dans les 24 heures.
   NOTE : Si vous voulez décongeler des cellules dans un avenir immédiat, stocker des cellules congelées à-80 ° C pendant un mois.
9. Pour dégeler les CSEh Préchauffer CSEh médias pendant 20 min.
10. Ajoutez 8 mL de médias de CSEh préchauffé dans ballon 25 cm.
11. Extraire le tube de gel de la cuve d’azote liquide ou de-80 ° C et plonger le tube dans le bain-marie à 37 ° C pendant 1 à 2 min à dégeler les cellules.
12. Transférer les CSEh décongelé dans une fiole jaugée de 25 cm avec les médias de CSEh et incuber dans une étuve à₂ CO 5 % pendant une nuit à 37 ° C.
13. Lendemain, changer les médias CSEh et attendre 2 ou 3 jours jusqu'à ce que les CSEh deviennent confluente et cellules de transfert dans ballon 75 cm tel que décrit ci-après dans le Protocole N° 5.
    1. Médias de CSEh chaud dans un bain d’eau de 37 ° C pendant 15-20 min.
    2. Aspirer les médias de la fiole et ajouter des supports neufs de CSEh dans le ballon (volume de travail : 8 ou 16 mL par flacon de 25 cm ou 75 cm respectivement).
    3. Placer le ballon dans le 5 % CO₂ incubateur à 37 ° C jusqu'à ce que la confluence de 80 à 90 % est atteint.

5. culture de cellules Stromal endométrial humaines (CSEh)

Remarque : Cette procédure Culturing s’effectue dans un environnement stérile sous une hotte de sécurité biologique.

1. Préchauffer les CSEh Media à 37 ° C au bain-marie pendant 20-30 min.
2. Aspirer les médias du flacon et ajouter de l’acide éthylènediaminetétraacétique 0,25 % trypsine (EDTA) (mL 1 flacon de 25 cm ou 2 mL pour ballon 75 cm).
3. Incuber dans un incubateur à CO 5 %₂ à 37 ° C pendant 2-3 min jusqu'à ce que les cellules déloger.
4. Tapotez doucement les parois du ballon pour déloger les cellules restantes. Ajouter 7 mL de CSEh Media et mélanger bien en pipettant également, avant et arrière.
5. Ajouter le mélange de cellules dans un tube en polypropylène 50 mL conique et centrifuger à 800 x g pendant 2,5 min à température ambiante.
6. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans les médias de CSEh.
   1. Ajouter 15 mL pour flacon de 25 cm ou 45mL pour 75 cm ballon (15 mL chaque).
7. Ajouter 5 mL ou 15 mL de suspension de cellules dans chaque fiole 25 cm ou 75 cm respectivement.
8. Culture le CSEh isolé dans un 5 % CO₂ incubateur à 37 ° C pendant une période de 3 à 5 jours jusqu'à ce que les cellules forment une monocouche atteindre 80-90 % confluence dans un ballon plaqué.
9. Changer les CSEh médias tous les deux jours.
   1. Médias de CSEh chaud dans un bain d’eau de 37 ° C pendant 15-20 min.
   2. Aspirer les médias de la fiole et ajouter des supports neufs de CSEh dans le ballon (volume de travail : 8 ou 16 mL par flacon de 25 cm ou 75 cm respectivement).
   3. Placer le ballon dans le 5 % CO₂ incubateur à 37 ° C jusqu'à ce que la confluence de 80 à 90 % est atteint.

6. humain l’endomètre Stromal Cell (CSEh) placage et Transfection de siARN

Remarque : Cette procédure de transfection est effectuée dans un environnement stérile sous une hotte de sécurité biologique.

1. Aspirer les CSEh Media de la fiole de 75 cm et ajouter 2 mL de solution de trypsine-EDTA de 0,25 %.
2. Incuber dans 5 % CO₂ incubateur à 37 ° C pendant 2-3 min jusqu'à ce que les cellules déloger.
3. Une fois que les cellules sont délogés du flacon, ajouter 7 mL de CSEh Media et mélanger doucement en pipettant également, vers l’avant et inverser 5 fois.
4. Ajouter le mélange de cellules dans un tube en polypropylène 50 mL conique et centrifuger à 800 x g pendant 2,5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et Resuspendre le culot dans 10 mL de CSEh Media.
   Remarque : Si les cellules de plus d’une fiole de placage, tout simplement augmenter le volume de CSEh Media.
5. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
   1. Aliquote 10 µL de cellules remises en suspension dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
   2. Ajouter 10 µL de 0,4 % le bleu Trypan tacher à cellule aliquote et mélanger en pipettant également vers l’avant et inverser.
6. Plaque de 0,8 x 10⁵ cellules par puits dans les plaques 6 puits. Après deux jours, les cellules devraient être anastomosé de 60 à 70 % pour la transfection optimale.
7. Pour chaque échantillon de transfection de siARN, préparer des complexes à l’aide de siARN (60 nanomoles) au réactif de transfection.
8. Diluer 5 µL de réactif de transfection dans 150 µL de médias libres sériques réduites et incuber pendant 5 min.
9. Diluer 60 nanomoles de siARN dans 100 µL de médias libres sériques réduites et incuber pendant 5 min.
10. Après 5 minutes, combiner des siARN dilué avec la solution de réactif de transfection dilué et mélanger doucement en pipettant également vers l’avant et inverser 5 fois.
    Remarque : Si transfectants un ou plusieurs siARN dans plusieurs puits, préparer un mélange maître dans 10 mL tubes en polystyrène.
11. Incuber les complexes réactif siARN-transfection pendant 5 min à température ambiante.
12. Durant cette incubation, ajouter 1 mL de médias de changement à chaque puits.
13. Après 5 min d’incubation, centrifuger les tubes à 500 g pendant 2 min recueillir de solution et ajouter les 250 µL de complexes de réactif de siARN-transfection dans chaque cupule contenant des cellules et des médias.
14. Mélanger en poussant doucement et incuber les cellules à 37° C dans une étuve à₂ CO 5 % pendant 5 h.
15. Après 5 h, remplacez les médias médias CSEh.
16. Incuber les cellules à 37 ° C dans une étuve à₂ CO 5 % pendant 2 jours en vue d’un essai in vitro décidualisation avec.

7. essai in Vitro décidualisation avec

Remarque : Cette analyse est réalisée dans un environnement stérile sous une hotte de sécurité biologique.

1. Préparer les médias CBE avant d’entreprendre le traitement de décidualisation in vitro , tel que décrit dans Camden et al. ³ (voir 1.6).
2. Aspirer les médias de la post-48 heure ligne transfectée de CSEh incubé à l’étape 6.16.
3. Ajouter 2 mL d’EPC multimédia dans chaque puits.
   Note : comme un contrôle, laisser un jeu de cellules non traité avec les médias de la CBE. Au lieu de cela, ajouter 2 mL de CSEh Media dans les puits de contrôle.
4. Incuber les cellules dans 5 % CO₂ incubateur à 37 ° C pendant 6 jours.
   1. Modifier les médias CBE toutes les 48 heures.
      1. Réchauffer et préparer les milieux de l’EPC dans un bain-marie à 37 ° C pendant 15-20 min.
      2. Aspirer les médias du puits et ajouter les supports neufs CBE.
      3. Replacez la plaque dans le 5 % CO₂ incubateur à 37 ° C.
5. Après le sixième jour, analyser l’étendue de la décidualisation de cellules stromales via ELISA et qRT-PCR (comme décrit ci-dessous).

8. validation de décidualisation In Vitro utilisant la PCR Quantitative en temps réel (qRT-PCR)

Note : qRT-PCR est complétée comme décrit dans Kommagani et al.¹⁰.

1. Isoler l’ARN total de CSEh utilisant le protocole d’un kit d’isolation d’ARN disponible dans le commerce.
   1. Analyser la quantité de RNA et de la pureté (un260/a₂₈₀) utilisant un NanoDrop ou une méthode similaire, comme décrit dans Elias-Garcia et al.¹⁵.
2. Synthétiser des ADNc de 1 µg d’ARN total via un protocole de kit de transcription inverse disponibles dans le commerce.
3. Exécutez une réaction qRT-PCR comme décrit dans un protocole de kit qRT-PCR disponibles dans le commerce.
   1. Effectuer la réaction en utilisant un mélange de maître de la PCR en temps réel disponibles dans le commerce et sondes de gènes spécifiques ainsi que les réglages de système interne (18 s, PRLet IGFBP1).

9. validation de décidualisation In Vitro utilisant ELISA

1. Quantifier le taux de prolactine sécrétée partir du support de culture de tissus utilisant un kit de prolactine ELISA disponible dans le commerce.

10. validation de décidualisation In Vitro utilisant la coloration de la phalloïdine.

1. Insérer les lamelles stériles dans chaque puits d’une plaque bien 12.
2. Répétez les étapes 6.1-6.5.
3. Plaque de 0,8 x 10⁵ cellules par puits d’une plaque bien 12.
4. Incuber les cellules dans 5 % CO₂ incubateur à 37 ° C pendant 2 jours.
5. Aspirer les médias.
6. Répétez les étapes 7.3 à 7.4.
7. Fixer les cellules à 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à température ambiante pendant 30 min.
8. Aspirer la solution de fixation et laver 3 fois avec 1 mL de PBS de 5 min chacun.
9. Ajouter 0,1 % éther de phényle surfactant non ionique polyéthylèneglycol tert-octyl dans du PBS pendant 5 min pour les cellules fixes pour augmenter la perméabilité.
10. Laver 3 fois avec 1 mL de PBS de 5 min chacun.
11. Ajouter 100 µL de solution de la phalloïdine par lamelle et laisser incuber à température ambiante pendant 90 min.
    1. Préparer la dilution de 1/100 dans du PBS d’utiliser une solution mère de phalloïdine dans 1 unité par 5 µL.
12. Laver 3 fois avec 1 mL de PBS de 5 min chacun.
13. Monter les diapositives avec support de montage contenant 4', 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI).
14. Observer les cellules en utilisant un microscope confocal.

Résultats

Décidualisation CSEh culture

Après isolement, cellules du stroma endométriales humains sont cultivés à une formation monocouche avec confluence de 80 à 90 % et induite pour in vitro décidualisation en traitant avec 10 nM E2, 1µm MPA et cAMP de 50 µM (CBE). Changements morphologiques associées en vitro décidualisation sont visualisées à la Figure 1 a. ?...

Discussion

Le cycle menstruel reproducteur féminin se caractérise par une augmentation de la concentration de progestérone pendant la phase lutéale, induisant ainsi la décidualisation de ESC en rond, épithéliales-comme des cellules sécrétrices^3,8. L’initiation de décidualisation est espèces dépendantes. Chez l’homme, décidualisation se fait spontanément sur la hausse de la concentration de progestérone, tandis que les souris exigent blastocyste présence<...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070	For decidualization media
DMEM / F12 (1:1) (1X)	Gibco	11330-032
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061	For cell count
PureLink RNA Mini Kit	Invitrogen	12183018A	For RNA Isolation/Purification
TaqMan 2X Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4374967
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control	Life Technologies	4319413E	For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe	Applied Biosystems	4331182	For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe	Applied Biosystems	4331182	For qPCR internal control
Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter	Abcam	ab176753
Human Prolactin ELISA Kit	Invitrogen	EHIAPRL
16% Paraformaldehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	Fixative
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778150	Transfection Reagent
ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	For mounting
0.25% Trypsin-EDTA (1X)	Gibco	25200-056
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum	Sigma	F6765-500ML
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080-094
Ficoll-Paque PLUS Reagent	Fisher Scientific	45001749
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C0130-1G
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma	DN25-100MG
Medroxyprogesterone 17-acetate	Sigma	M1629-1G	For EPC Media
Estradiol	Sigma	E1024-1G	For EPC Media
cAMP	Sigma	A6885-100MG	For EPC Media
Fine straight stitch scissors	Fine Science Tools	15396-00
TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe	Applied Biosystems	4351372
Fetal Bovine Serum, heat inactivated	Gibco	10-082-147
Antibiotic-antimycotic	Thermo Scientific	15240062
Hank’s Balanced Salt Solution	Corning	21-021-cv
50 mL conical polypropylene Falcon tube	Corning	352098
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
100 x 15 mm Glass Petri dish	VWR	75845-546
40 micron cell strainer	Midsci	229481
Isotemp 215 Water bath	Fisher Scientific	FS-215
LSE Centrifuge	Corning	6755
Human NCOA2 siRNA	Dharmacon	L-020159-00	Gene specific qPCR probe
Steri-cycle i160 CO2 Incubator	Thermo Scientific	51030301
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000	For RNA quantification
Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	50146771
75 cm Canted Neck Cell Culture flask	Corning	430641U
6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate	Corning	3506
Pipet Controller Ultra	Corning	4099
Photoshop	Adobe	19.0.1.334
25 cm Canted Neck Cell Culture flask	Corning	7200876
Triton X-100	Sigma	X100-1L
15 mL conical polypropylene Falcon tube	Corning	352099
10 mL Syringe	BD	302995
1300 Series A2 Biological Safety Hood	Thermo Scientific	1377
accuspin Micro17 centrifuge	Fisher Scientific	13100675
7500 Fast real time PCR system	Applied Biosystems	3052632
EVOS FL Immunofluorescence Microscope	Life Technologies	01414-155G-291
Leica Inverted Light Microscope	Leica	DMi1
Illrustrator	Adobe	22.0.1.253
Excel Spreadsheets	Microsoft	2016
Deckglaser 18 mm cover glasses	NeuVitro	GG-18
Reichert Bright-Line Hemacytometer	Sigma	Z359629-1EA
2-mercaptoethanol	Fisher Bioreagents	BP176-100	For RNA lysis buffer
1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	430658	For freezing HESC cells
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	For freezing media