Isolation von menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen für In-vitro- Decidualization

Zusammenfassung

Diese Studie bietet eine validierte und optimierte Verfahren zur Isolierung und Kultur menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen in Vitro Decidualization Assay durchzuführen. Darüber hinaus bietet diese Studie einer detaillierte Methode, um effizient Knockdown ein bestimmtes Gen mit SiRNAs in menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen.

Zusammenfassung

Die Differenzierung der menschlichen Stromazellen endometriumzellen (HESC) von Fibroblasten-aussehen in sekretorischen Dezidua ist eine Transformation, die für die Implantation des Embryos in die Gebärmutterschleimhaut der mütterlichen Gebärmutter erforderlich. Unsachgemäße Decidualization wurde als Hauptursache für die Implantation Scheitern und anschließende frühen Embryo fehl-gegründet. Daher ist das Verständnis der molekularen Mechanismen, die Decidualization vorteilhaft zur Verbesserung der Rate der erfolgreichen Geburten. In Vivo Studien des künstlichen Decidualization schränken oft aufgrund der ethischen Dilemmata Humanforschung sowie translational Komplikationen innerhalb von Tiermodellen zugeordnet. Dadurch werden in-vitro- Tests durch Primärzelle Kultur oft genutzt, um die Modulation des Decidualization über Hormone zu erkunden. Diese Studie liefert ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von HESC und anschließende künstliche Decidualization über die Ergänzung der Hormone, um die Kultivierung Medium. Darüber hinaus bietet diese Studie einer durchdachten Methode, um Zuschlag jedes Gen des Interesses durch die Verwendung von Lipid-basierte SiRNA Transfektionen. Dieses Protokoll ermöglicht die Optimierung der Kultur Reinheit sowie Produktausbeute, und die Fähigkeit, dieses Modell als eine zuverlässige Methode zu verstehen, die molekularen Mechanismen Decidualization, und der anschließenden Quantifizierung der nutzen maximieren freigesetzten Mittel durch decidualized Stromazellen endometriumzellen.

Einleitung

Zwischen den Phasen der Menarche und Menopause unterziehen Frauen im gebärfähigen Alter Monatszyklen der Hormon reguliert endometrial Proliferation, Differenzierung und anschließende Vergießen in Vorbereitung auf die Schwangerschaft in einem Prozeß bekannt als Menstruation^{1 ,2}. Solche körperlichen Änderungen des menschlichen Endometriums sind notwendig für richtige Embryos in der Gebärmutter Wand¹. Veränderungen des Endometriums, morphologische und biochemische Anpassungen, einschließlich vermittelt während des Menstruationszyklus über Eierstockkrebs Steroid-Hormone Östrogen und Progesteron (P4)^3,4,5. Innerhalb der proliferative (oder follikulären) Phase Ebenen präovulatorische Östrogen Anstieg, Einleitung Verdickung der Gebärmutterschleimhaut. Nach Eisprung fördert die sekretorische (oder luteal) Phase einen signifikanten Anstieg der P4-Konzentrationen induzieren die morphologische Transformation von Stromazellen endometriumzellen (ESC) von Fibroblasten-aussehen gerundet, epithelialen wie deziduale Zellen in einem Prozess, bekannt als Decidualization^4,6. Unsachgemäße Decidualization wurde als Hauptursache für die Implantation Scheitern und anschließende frühen Embryo fehl-^4,7,8gegründet. Daher ist es vorteilhaft, die Diagnose und Behandlung von frühen schwangerschaftverlust, Verständnis der molekularen Mechanismen, die Decidualization.

Derzeit werden mehrere Methoden genutzt, um die zugrunde liegenden Auswirkungen von Decidualization auf Stromazellen endometriumzellen untersuchen. In Vivo, die Maus Gebärmutter künstlich induziert werden können, für Decidualization durch mechanische Stimulation (z.B.Kratzer) oder Öl-Injektion in einem hormonell grundiert Gebärmutter-⁹. Deutlich von den Menschen, fördert diese synthetischen Stimulation die Differenzierung des uterinen Lumens durch das Aussehen der Blastozyste Präsenz, ein Schritt, der für die Einleitung des Decidualization in Nagetieren^10,11erforderlich ist. Entsprechend, durch translationalen Komplikationen im Zusammenhang mit Tiermodellen und die ethischen Dilemmata rund um in-Vivo Studien am Menschen, Decidualization basierte Modelle sind am erfolgreichsten studierte in-vitro-.

In dieser Studie werden die Themen durch die Platzierung von anzeigen in beiden Englisch und Spanisch Lokalzeitungen rekrutiert. Themen als geeignete Kandidaten für diese Studie identifiziert werden gebracht zu einem Treffen mit der Forschungskoordinator, in denen eine vollständige Offenlegung der Risiken werden besprochen. Nach Bestätigung der ein vollständiges Verständnis der potenziellen Risiken wird Probanden Zustimmung in schriftlicher und mündlicher Form erreicht. Einwilligung schließt die Berechtigung (1) unterziehen Aderlass (2) langfristige Speicherung von ihrem Gewebe für die zukünftige Forschung und (3) zur Schaffung von Primärkulturen aus gesammelten Gewebemustern zustimmen. Nach Zustimmung erhalten Themen eine Form, in welcher zulässigen Selbstidentifikation der Rasse/Ethnizität und/oder das Recht auf Geheimhaltung abzuschließen. Ein anschliessender Besuch soll die Endometrium-Biopsie basierend auf das Thema Menstruationszyklus zu erreichen. Freiwillige, die zu dieser Studie rekrutiert die ethnische und rassische Demographie der Metropolregion St. Louis zu reflektieren, wie durch die Volkszählung 2012 dokumentiert und beinhaltete nicht die Beteiligung der gefährdeten Bevölkerung einschließlich Schwangere, Föten, Embryonen, Kinder unter 18 Jahren alt oder anderen gefährdeten Gruppen. Voraussetzungen für die Teilnahme an der Biopsie-Probe-Sammlung gehören (1) wird im Alter von 18-45 Jahre (2) mit regelmäßigen Menstruationszyklus (25-32 Tage) (3), die keine aktuelle Schwangerschaft oder hormonelle/intrauterine Vorrichtung Verhütungsmittel 30 Tage vor der Einschreibung (4) ohne aktuelle vaginale Infektion oder sexuell übertragbare Krankheiten (5), die keine aktuelle Antibiotika-Behandlungen, und (6) haben keine aktuellen abnormen PAP-Abstrich.

Im Rahmen dieser Studie menschlichen Stromazellen endometriumzellen (HESC) kultiviert und künstlich induziert in-vitro- Decidualization durch die Ergänzung der Hormone (Östradiol (E2), Medroxyprogesteron Acetat (MPA) und zyklische Adenosin zu unterziehen Monophosphate (cAMP)) auf das Medium. Bei dieser Methode wird der Grad der Decidualization basierend auf die Gesamtzahl der Tage der hormonellen Behandlung verändert. In Verbindung mit Zellskelett Neuordnung induziert hormonelle Supplementierung biochemische Anpassungen, die wie die deziduale Zellen sekretorischen Qualitäten^2,4erleben. Die Expression von Genen Markenzeichen, wie Prolaktin (PRL) und Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-bindendes Protein 1 (IGFBP1), kann genutzt werden, um zu bestätigen und zu quantifizieren, den Grad der HESC Decidualization^{5,12, 13 , 14}. wichtiger ist, beweist auch die Lebensfähigkeit dieses Protokolls, spezifischen gen-Knockdown durchzuführen.

Protokoll

Alle menschlichen Endometrium Biopsien gesammelt für diese Studie wurden erreicht von der Washington University in St. Louis, Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie mit einer institutionellen Review Board (IRB) genehmigt schriftliche Einverständniserklärung.

1. Vorbereitung

1. Bereiten Sie 500 mL 1 x Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS) durch Zugabe von 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin, die Medien mit Flasche (weiter als HBSS + Medium verwiesen).
2. 500 mL Dulbeccos geändert Eagle Medium vorbereiten: Nährstoff-Mischung f-12 (DMEM/F12) mit Phenol rot, L-Glutamin und 15 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES) durch Zugabe von 1 % Antibiotikum antimykotische Lösung (Endkonzentration ist 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 0,25 µg/mL Fungizone), das Medium mit Flasche (weiter als HESC Isolation Medien verwiesen).
3. Bereiten Sie 500 mL DMEM/F12 mit Phenol rot, L-Glutamin und 15 mM HEPES durch Zugabe von 10 % fetalen Bovine Serum (FBS), 1 X Na₂HCO₃und 1 % Penicillin (10.000 U/mL) und Streptomycin (10.000 µg/mL) (Stift Strep) an die Medien, die enthalten (weitere Flasche als HESC Medien verwiesen).
4. Bereiten Sie 500 mL reduziert Serum Medium mit L-Glutamin, 2,4 g/L Natriumbicarbonat und HEPES mit 2 % Holzkohle abgestreift fötalen Rinderserum (CsFBS) und 1 % Strep Stift an die Medien, die Flasche (weiter als Decidualization Medien referenziert) enthalten.
5. Bereiten Sie 500 mL Phenol rot frei DMEM/F12 durch Zugabe von 2 % Holzkohle fötalen Rinderserum (CsFBS) in den Medien mit Flasche (weiter als Änderung Medien referenziert) beraubt.
6. Vorbereitung 10 nM Estradiol (E2), 1 µM Medroxyprogesteron Acetat (MPA) und 50 µM zyklische Adenosin Monophosphate (cAMP) in einem 15 mL Polypropylen konische Rohr und Hinzufügen einer 2 mL pro gut aliquoten vorbereitete Decidualization Medien für in-vitro- Decidualization-Assay (weiter als EPC Medien verwiesen).
7. Bereiten Sie 50 mL des Einfrierens Medien mit 90 % FBS und 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in 50 mL Polypropylen konischem Rohr (weiter als Einfrieren Medien referenziert vor).
8. Vorher wiegen 25 mg Kollagenase und 5 mg der DNase I in ein 50 mL konische Polypropylen-Rohr und Speicher bei-20° C.

(2) menschliche Endometrium-Biopsie-Übernahme

1. Der IRB genehmigten Klinik in HBSS einzuholen Sie menschlichen Endometrium-Biopsie-Proben in der proliferativen Phase (Tag 9 - Tag 12) des Menstruationszyklus.
2. Biopsie-Proben mit 1 mL vorgewärmte 37 ° C HBSS + Medium waschen und vorsichtig schütteln entfernen Sie überschüssiges Blut und Schleim.

3. Isolation von menschlichen Stromazellen Endometriumzellen (HESC)

Hinweis: Dieses Verfahren isoliert wird in einer sterilen Umgebung unter einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt.

1. Übertragen die Biopsie mit sterilisierten Pinzette in ein 50 mL konische Polypropylen Zentrifugenröhrchen mit 10 mL frisches HBSS.
2. Zentrifugieren Sie die Biopsie bei Raumtemperatur bei 500 X g 90 s.
   1. Wenn die Zelle Pellet Brüche, Re-spin die Biopsie bei 2.000 x g für 90 s.
3. Entfernen Sie das Medium mit einer 1 mL pipettieren und Waschen mit 10 mL von 37 ° C vorgewärmt HESC Isolation Media gefolgt von Zentrifugation bei 500 X g 90 s.
4. Entfernen Sie das Medium mit einer 1 mL pipettieren, und kräftig 3 mL frische HESC-Isolation-Medien, die Biopsie zu verdrängen.
5. Dekantieren Sie die Biopsie in eine Petrischale mit 5 mL HESC Isolation Medien.
6. Zerkleinere die Biopsie in als kleine Stücke wie möglich mit #5 Pinzetten und Scheren feine Geradstich für etwa 20 Minuten.
7. Bereiten-DNase I und Kollagenase Enzyme durch Zugabe von 10 mL HESC Isolation Medien zu vorgewogene DNase I (0,5 mg/mL) und Kollagenase (2,5 mg/mL). Mischen Sie mit pipettieren.
8. Pipette schneiden Gewebeproben mit einer 1 mL pipettieren in eine neue 50 mL konische Polypropylen-Rohr. Waschen mit 7 mL HESC Isolation Medien und fügen Sie in das Polypropylen Röhrchen, die vollständige Probe zu erwerben.
9. Zentrifuge die Probe bei Raumtemperatur bei 800 X g für 2 min. entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit Pipette.
10. Filtern Sie die DNase ich und Kollagenase Lösung durch 0,2 µm Filter 10 mL Spritze direkt auf Pellet angebracht.
11. Wirbel für 10 s zu Pellet aufzuwirbeln.
12. Digest in 37 ° C Wasserbad für 1,5 h, Vortexen für 10 s gründlich alle 10 min, bis Gewebe verdaut wird.
13. Filtern Sie die Probe durch ein 40 µm Zelle Sieb gestapelt über eine 50 mL konische Polypropylen Röhrchen, die epithelialen Zellen und Gewebe Schutt zu entfernen.
    Hinweis: Stromale Zellen sind in der 50 mL konische Polypropylen-Rohr.
14. Zentrifugieren Sie die 50 mL konische Polypropylen Rohr bei 800 X g 2,5 min bei Raumtemperatur. Den Überstand mit einer 1-mL-Pipette vorsichtig zu entfernen.
15. Das Pellet in 10 mL HESC Isolation Medien aufzuwirbeln.
16. Zentrifugieren Sie bei 800 X g 2,5 min bei Raumtemperatur. Den überstand abgesaugt, und dann Aufschwemmen Zellen in 6 mL HESC Medien und Pipette vorwärts und rückwärts zu mischen.
17. Langsam Schicht auf 3 mL Dichte Gradienten Medien auf die resuspendierte Zellen, übrigen Blutzellen aus den Stromazellen Zellen, ohne dabei die Schichten vermischen zu trennen.
18. Zentrifugieren Sie das 15 mL Polypropylen-Rohr auf 400 X g für 30 min bei Raumtemperatur.
19. Sammeln Sie 5 mL des Überstands in einem neuen 50 mL Polypropylen-Rohr und fügen Sie eine zusätzliche 5 mL HESC Medien um die Zellen zu Aufschwemmen.
20. Zentrifugieren Sie bei 800 X g 2,5 min bei Raumtemperatur, gefolgt von Entfernung des Überstands und Zugabe von 6 mL HESC Medien. Wirbel die Probe für 10 s und Mix von pipettieren weiterleiten und 5 Mal umkehren.
21. Aliquoten 10 µL neu suspendierten Zellen zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch für Zellzahl.
22. Fügen Sie 10 µL von 0,4 % Trypan blau färben zu Zelle aliquoten und mischen Sie mit pipettieren. Laden Sie 10 µL der aliquoten und zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
23. Platte die Zellen in eine geeignete Flasche total Zellzahl in 15 mL HESC Medien abhängig.
    1. Wenn die Gesamtzahl der Zellen weniger als 1 Million ist, Platte alle Zellen in 25 cm Kolben mit 6 mL HESC Medien. Wenn die Gesamtzahl der Zellen mehr als 1 Million ist, Platte alle Zellen in 75 cm Kolben mit 15 mL HESC Medien.
24. Die Zellen in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37 ° C für mindestens 6 h zu gewährleisten korrekte Zelladhäsion und wechseln Sie das Medium HESC-Medien-Kultur.
25. Kultur der isolierten HESC in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37 ° C für einen Zeitraum von 3-5 Tage bis die Zellen einer Monoschicht erreichen 80-90 % Konfluenz in einem vergoldeten Kolben bilden.
26. Wechseln Sie HESC Medium alle zwei Tage.
    1. Warmen HESC-Medien im Wasserbad 37 ° C für 15-20 min.
    2. Aspirieren Sie Medien aus der Flasche und fügen neue HESC-Medien in den Kolben (Arbeitsvolumen: 8 mL oder 16 mL pro 25 cm oder 75 cm Kolben bzw.).
    3. Setzen Sie Kolben wieder in die 5 % CO₂ Inkubator bei 37 ° C, bis 80-90 % Konfluenz erreicht ist.
27. Sobald HESC werden 80-90 % Zusammenfluss, Zellen übertragen von 25 cm bis 75 cm Kolben oder aus einem 75-cm-Flasche auf drei 75-cm-Küvetten.
    Hinweis: HESC kann eingefroren und zu diesem Zeitpunkt für zukünftige Experimente zur späteren Verwendung gespeichert werden.

(4) Einfrieren und Auftauen embryonaler

1. Aspirieren Sie Medien aus der 75-cm-Flasche und 2 mL Trypsin-EDTA.
2. Inkubieren Sie in einem 5 % CO₂ Inkubator für 2-3 min bei 37 ° C, bis die Zellen aus der Flasche zu verdrängen.
3. 7 mL HESC Medien und Mischung gut durch pipettieren vorwärts- und hinzugeben.
4. Bei 800 X g 2,5 min zentrifugieren und den überstand abgesaugt.
5. Einfrieren von Rohren mit Zell-Linie, Datum und Passagenanzahl Label.
6. Wieder aussetzen der Zelle Pellet in 5 mL des Einfrierens Medien.
7. Aliquoten 1 mL neu suspendierten HESC jedes Rohr und Transfer Rohre bis-80 ° C Gefrierschrank.
8. Übertragen Sie Rohre zu flüssigem Stickstoff innerhalb von 24 Stunden.
   Hinweis: Wenn Zellen Auftauen in naher Zukunft planen, speichern Sie gefrorene Zellen bei-80 ° C für einen Monat.
9. Zum Auftauen die hESC Heizen Sie HESC Medien für 20 Minuten vor.
10. 25 cm Kolben 8 mL vorgewärmten HESC Medien hinzufügen.
11. Rufen Sie den einfrierenden Schlauch aus dem flüssigen Stickstoff-Tank oder-80 ° C ab und Tauchen Sie das Rohr in 37 ° C Wasserbad für ca. 1-2 min Auftauen der Zellen.
12. Aufgetauten HESC auf eine 25-cm-Flasche mit HESC Medien übertragen und in einem 5 % CO₂ Inkubator über Nacht bei 37 ° c inkubieren
13. Am nächsten Tag wechseln Sie das Medium HESC und warten Sie 2-3 Tage bis HESC konfluierende und Zellen auf 75 cm Kolben wie nachfolgend in Protokoll Nr. 5 übertragen.
    1. Warmen HESC-Medien im Wasserbad 37 ° C für 15-20 min.
    2. Aspirieren Sie Medien aus der Flasche und fügen neue HESC-Medien in den Kolben (Arbeitsvolumen: 8 mL oder 16 mL pro 25 cm oder 75 cm Kolben bzw.).
    3. Setzen Sie Kolben wieder in die 5 % CO₂ Inkubator bei 37 ° C, bis 80-90 % Konfluenz erreicht ist.

(5) menschlichen endometrialen Stromazellen Zelle (HESC) Kultivierung

Hinweis: Dieses Culturing Verfahren wird in einer sterilen Umgebung unter einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt.

1. Vorheizen HESC Medien bei 37 ° C in einem Wasserbad für 20-30 Minuten.
2. Aspirieren Sie Medien aus der Flasche und 0,25 % Trypsin Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (1 mL für 25 cm Kolben oder 2 mL für 75-cm-Kolben).
3. Inkubieren Sie in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37 ° C für ca. 2-3 min, bis die Zellen verdrängen.
4. Klopfen Sie leicht die Küvette Wände um die verbleibenden Zellen verdrängen. 7 mL HESC Medien und Mischung gut durch pipettieren vorwärts- und hinzugeben.
5. Pipettieren der Zelle-Mischung in ein 50 mL konische Polypropylen-Rohr und Zentrifuge bei 800 X g 2,5 min bei Raumtemperatur.
6. Überstand abgesaugt und erneut aussetzen der Zelle Pellet in HESC Medien.
   1. 15 mL für 25 cm Kolben oder 45mL für 75-cm-Kolben (15 mL) hinzugeben.
7. Jede Flasche 25 cm oder 75 cm bzw. 5 mL oder 15 mL Zellsuspension hinzufügen.
8. Kultur der isolierten HESC in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37 ° C für einen Zeitraum von 3-5 Tage bis die Zellen einer Monoschicht erreichen 80-90 % Konfluenz in einem vergoldeten Kolben bilden.
9. Wechseln Sie HESC Medium alle zwei Tage.
   1. Warmen HESC-Medien im Wasserbad 37 ° C für 15-20 min.
   2. Aspirieren Sie Medien aus der Flasche und fügen neue HESC-Medien in den Kolben (Arbeitsvolumen: 8 mL oder 16 mL pro 25 cm oder 75 cm Kolben bzw.).
   3. Setzen Sie Kolben wieder in die 5 % CO₂ Inkubator bei 37 ° C, bis 80-90 % Konfluenz erreicht ist.

6. menschliche endometrialen Stromazellen Zelle (HESC) Beschichtung und SiRNA Transfection

Hinweis: Dieses Verfahren Transfektion wird in einer sterilen Umgebung unter einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt.

1. Aspirieren Sie HESC Medien aus der 75-cm-Flasche und 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung von 0,25 %.
2. Inkubieren Sie in 5 % CO₂ Inkubator bei 37 ° C für ca. 2-3 min, bis die Zellen verdrängen.
3. Sobald Zellen aus der Flasche verdrängt sind, 7 mL HESC Medien hinzufügen und mischen durch pipettieren vorwärts und rückwärts 5 Mal.
4. Pipettieren der Zelle-Mischung in ein 50 mL konische Polypropylen-Rohr und Zentrifuge bei 800 X g 2,5 min bei Raumtemperatur. Den überstand abgesaugt und erneut aussetzen der Zelle Pellet in 10 mL HESC Medien.
   Hinweis: Wenn Zellen aus mehr als eine Flasche Beschichtung, einfach die Lautstärke HESC Medien.
5. Anzahl Zellen mit einem Hemocytometer.
   1. Aliquoten 10 µL neu suspendierten Zellen zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
   2. Fügen Sie 10 µL von 0,4 % Trypan blau färben auf Zelle aliquoten und mischen, indem Sie vorwärts pipettieren und rückgängig zu machen.
6. Platte 0,8 x 10⁵ Zellen pro Bohrloch in 6-Well Platten. Nach zwei Tagen sollten die Zellen 60-70 % Zusammenfluss zur optimalen Transfektion sein.
7. Bereiten Sie für jede Probe SiRNA Transfection komplexe mit SiRNA (60 Nanomoles), Transfection Reagens.
8. Verdünnen Sie 5 µL Transfection Reagens in 150 µL reduzierte Serum freier Medien und 5 min inkubieren.
9. Verdünnen Sie 60 Nanomoles von SiRNA in 100 µL reduzierte Serum freier Medien und 5 min inkubieren.
10. Nach 5 Minuten verdünnten SiRNA mit verdünnter Transfektion Reagenzlösung kombinieren und mischen durch pipettieren nach vorne und rückwärts 5 Mal.
    Hinweis: Wenn eine oder mehrere SiRNA in mehreren Brunnen transfecting, bereiten Sie master-Mix in 10 mL Polystyrol Rohre.
11. Inkubieren Sie SiRNA-Transfection Reagens komplexe für 5 min bei Raumtemperatur.
12. Während diese Inkubation fügen Sie 1 mL der Änderung Medien in jede Vertiefung hinzu.
13. Zentrifugieren Sie nach 5 min Inkubation Rohre bei 500 X g für 2 min Lösung zu sammeln und auch mit Zellen und Medien jeweils 250 µL der SiRNA-Transfection Reagens komplexe hinzufügen.
14. Mischen Sie, indem Sie sanft schaukelnden und inkubieren Sie die Zellen bei 37° C in einem 5 % CO₂ Inkubator für 5 h.
15. Nach 5 h wechseln Sie das Medium HESC Medien.
16. 2 Tage in der Vorbereitung für eine in-vitro- Decidualization Assay inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einem 5 % CO₂ Inkubator.

7. in-vitro- Decidualization-Assay

Hinweis: Dieser Test wird in einer sterilen Umgebung unter einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt.

1. Bereiten Sie die EPC-Medien vor Behandlungsbeginn die in-vitro- Decidualization wie in Camden Et Al. beschrieben ³ (siehe 1.6).
2. Aspirieren Sie die Medien aus der Post-48 Stunde transfizierten Linie HESC aus Schritt 6.16 inkubiert.
3. Fügen Sie 2 mL des EPÜ Medien in jede Vertiefung.
   Beachten Sie: als Kontrolle, eine Gruppe von Zellen mit EPC Medien unbehandelt, lassen. Stattdessen fügen Sie 2 mL HESC-Medien, die Kontroll-Vertiefungen.
4. 6 Tage inkubieren Sie die Zellen in 5 % CO₂ Inkubator bei 37 ° C.
   1. Ändern Sie den EPC-Medien alle 48 Stunden.
      1. Warm und bereiten EPÜ Medien im Wasserbad 37 ° C für 15-20 min.
      2. Aspirieren Sie Medien aus dem Brunnen und fügen Sie frischen EPÜ Medien hinzu.
      3. Platzieren Sie die Platte wieder in den 5 % CO₂ Inkubator bei 37 ° C.
5. Analysieren Sie nach dem sechsten Tag das Ausmaß der Stromazellen Zelle Decidualization über ELISA und qRT-PCR (wie unten beschrieben).

8. Bewertung von In vitro- Decidualization nutzen Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR)

Hinweis: qRT-PCR erfolgt wie oben beschrieben in Kommagani Et Al¹⁰.

1. Isolieren Sie die gesamte-RNS von HESC unter Verwendung des Protokolls aus einem handelsüblichen RNA Isolierung Bausatz.
   1. Analysieren Sie die RNA-Menge und Reinheit (ein260/a₂₈₀) mit einem NanoDrop oder ähnliche Methodik wie in Garcia-Elias Et Al¹⁵beschrieben.
2. CDNA von 1 µg Gesamt-RNS durch ein handelsübliches reversen Transkription Kit Protokoll zu synthetisieren.
3. Führen Sie eine qRT-PCR-Reaktion, wie in einem handelsüblichen qRT-PCR-Kit-Protokoll beschrieben.
   1. Führen Sie die Reaktion unter Verwendung eines handelsüblichen Real-Time PCR Master Mix und spezifischen gen-Sonden zusammen mit systeminternen Steuerelemente (18, PRLund IGFBP1).

9. Überprüfung der In vitro- Decidualization Verwendung von ELISA

1. Die sekretierten Prolaktin-Spiegel aus der Gewebekultur Medien unter Verwendung einer handelsüblichen Prolaktin-ELISA-Kit zu quantifizieren.

10. Überprüfung von In vitro- Decidualization Verwendung von Phalloidin Färbung.

1. Sterile Deckgläsern in jede Vertiefung eine 12-well-Platte einsetzen.
2. Wiederholen Sie die Schritte 6.1-6.5.
3. Platte 0,8 x 10⁵ Zellen pro Bohrloch eine 12-well-Platte.
4. 2 Tage inkubieren Sie die Zellen in 5 % CO₂ Inkubator bei 37 ° C.
5. Aspirieren Sie die Medien.
6. Wiederholen Sie die Schritte 7,3-7,4.
7. Befestigen Sie die Zellen in 4 % Paraformaldehyd (PFA) Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur für 30 min.
8. Aspirieren Sie die Fixierung-Lösung und 3 Mal mit 1 mL PBS für 5 min waschen.
9. Fügen Sie 0,1 % nicht-ionische Tenside Polyethylenglykol Tert-Octyl-Phenyl-Äther in PBS für 5 min zu den festen Zellen um die Durchlässigkeit zu erhöhen.
10. 3 Mal mit 1 mL PBS für 5 min waschen.
11. Fügen Sie 100 µL Phalloidin Lösung pro Deckglas und bei Raumtemperatur für 90 min inkubieren.
    1. Bereiten Sie 1: 100 Verdünnung mit PBS-Puffer aus mit einer Phalloidin Vorratslösung in 1 Einheit pro 5 µL.
12. 3 Mal mit 1 mL PBS für 5 min waschen.
13. Montieren Sie die Folien mit Eindeckmittel mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
14. Die Zellen unter Verwendung einer confocal Mikroskop zu beobachten.

Ergebnisse

Decidualization in HESC Kultur

Nach Isolierung, menschliche endometriale Stromazellen Zellen wurden zu einer Monoschicht-Formation mit 80-90 % Konfluenz kultivierten und induzierte für in-vitro- Decidualization durch die Behandlung mit 10 nM E2, 1 µM MPA und 50 µM cAMP (EPC). Morphologische Veränderungen in Vitro Decidualization zugeordnet wurden in Figur 1Avis...

Diskussion

Die weiblichen reproduktiven Zyklus zeichnet sich durch einen Anstieg der Progesteron-Spiegel während der luteal Phase, so induzieren die Decidualization des ESC in Runde, epithelialen anmutenden sekretorischen Zellen^3,8. Die Einleitung der Decidualization ist Art angewiesen. Beim Menschen tritt Decidualization spontan nach dem Aufstieg der Progesteron-Konzentration, während Mäuse Blastozyste Präsenz^10,11

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070	For decidualization media
DMEM / F12 (1:1) (1X)	Gibco	11330-032
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061	For cell count
PureLink RNA Mini Kit	Invitrogen	12183018A	For RNA Isolation/Purification
TaqMan 2X Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4374967
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control	Life Technologies	4319413E	For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe	Applied Biosystems	4331182	For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe	Applied Biosystems	4331182	For qPCR internal control
Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter	Abcam	ab176753
Human Prolactin ELISA Kit	Invitrogen	EHIAPRL
16% Paraformaldehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	Fixative
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778150	Transfection Reagent
ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	For mounting
0.25% Trypsin-EDTA (1X)	Gibco	25200-056
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum	Sigma	F6765-500ML
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080-094
Ficoll-Paque PLUS Reagent	Fisher Scientific	45001749
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C0130-1G
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma	DN25-100MG
Medroxyprogesterone 17-acetate	Sigma	M1629-1G	For EPC Media
Estradiol	Sigma	E1024-1G	For EPC Media
cAMP	Sigma	A6885-100MG	For EPC Media
Fine straight stitch scissors	Fine Science Tools	15396-00
TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe	Applied Biosystems	4351372
Fetal Bovine Serum, heat inactivated	Gibco	10-082-147
Antibiotic-antimycotic	Thermo Scientific	15240062
Hank’s Balanced Salt Solution	Corning	21-021-cv
50 mL conical polypropylene Falcon tube	Corning	352098
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
100 x 15 mm Glass Petri dish	VWR	75845-546
40 micron cell strainer	Midsci	229481
Isotemp 215 Water bath	Fisher Scientific	FS-215
LSE Centrifuge	Corning	6755
Human NCOA2 siRNA	Dharmacon	L-020159-00	Gene specific qPCR probe
Steri-cycle i160 CO2 Incubator	Thermo Scientific	51030301
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000	For RNA quantification
Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	50146771
75 cm Canted Neck Cell Culture flask	Corning	430641U
6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate	Corning	3506
Pipet Controller Ultra	Corning	4099
Photoshop	Adobe	19.0.1.334
25 cm Canted Neck Cell Culture flask	Corning	7200876
Triton X-100	Sigma	X100-1L
15 mL conical polypropylene Falcon tube	Corning	352099
10 mL Syringe	BD	302995
1300 Series A2 Biological Safety Hood	Thermo Scientific	1377
accuspin Micro17 centrifuge	Fisher Scientific	13100675
7500 Fast real time PCR system	Applied Biosystems	3052632
EVOS FL Immunofluorescence Microscope	Life Technologies	01414-155G-291
Leica Inverted Light Microscope	Leica	DMi1
Illrustrator	Adobe	22.0.1.253
Excel Spreadsheets	Microsoft	2016
Deckglaser 18 mm cover glasses	NeuVitro	GG-18
Reichert Bright-Line Hemacytometer	Sigma	Z359629-1EA
2-mercaptoethanol	Fisher Bioreagents	BP176-100	For RNA lysis buffer
1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	430658	For freezing HESC cells
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	For freezing media