JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה מציג שגרה מאומת וממוטב עבור הבידוד של התרבות האנושית תאי סטרומה רירית הרחם לנהל במבחנה decidualization assay. יתרה מזאת, מחקר זה מספק שיטה מפורט ביעילות תמונות ציפורים גנים ספציפיים באמצעות siRNAs בתאי סטרומה רירית הרחם אדם.

Abstract

הבידול של רירית הרחם סטרומה תאים אנושיים (HESC) ממראה כמו פיברובלסט. לתוך רותמי הפרשה היא שינוי נדרש השרשת לתוך הרחם רירית רחם אימהי. Decidualization לא תקין נוצרה כמו שורש לבעיה כשל השרשה, הבאים הפלה העובר מוקדם. לכן, להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס decidualization הוא יתרון בשיפור שיעור לידות מוצלחות. In vivo המבוסס על מחקרים של decidualization מלאכותיים הם הגבלת לעיתים קרובות עקב דילמות אתיות המשויך מחקר אנושי, כמו גם הסיבוכים translational בתוך חייתיים. כתוצאה מכך, במבחנה מבחני דרך התרבות התא הראשי מנוצלים לעיתים קרובות כדי לחקור את האפנון של decidualization באמצעות הורמונים. מחקר זה מספק נוהל מפורט בידודו של HESC ו- decidualization מלאכותיים עוקבות באמצעות תוספת של הורמונים למדיום culturing. עוד יותר, מחקר זה מספק שיטה מעוצב היטב נוקאאוט בכל הגן עניין על-ידי ניצול siRNA מבוססי השומנים transfections. פרוטוקול זה מאפשר אופטימיזציה של טוהר התרבות, כמו גם התשואה מוצר, ובכך למקסם את היכולת לנצל את המודל הזה בתור שיטה אמינה כדי להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס decidualization, כימות עוקבות של סוכנים מופרשים על-ידי decidualized תאי סטרומה רירית הרחם.

Introduction

בין השלבים של הוסת, גיל המעבר, נשים בגיל הפריון לעבור מחזורים חודשיים של הורמון מוסדר התפשטות רירית הרחם, בידול, ושפך הבאים לקראת הריון בתהליך המכונה הווסת1 ,2. ושינויים פיזיים אלו של רירית הרחם האדם נחוצים להשתלת עובר תקין לתוך הרחם1. שינויים של רירית הרחם, כולל עיבודים מורפולוגי וביוכימי, הן מתווכת לאורך המחזור החודשי באמצעות הורמונים סטרואידים השחלות אסטרוגן ופרוגסטרון (P4)3,4,5. במסגרת שלב המקדימות (או הזקיקים), רמות אסטרוגן preovulatory עלייה, ייזום עיבוי רירית הרחם. בעקבות ביוץ, השלב הפרשה (או luteal) מקדמת לעלייה משמעותית בריכוז P4, גרימת שינוי מורפולוגי תאי סטרומה רירית הרחם (ESC) של פיברובלסט דמוי מראה מעוגל, תאי אפיתל דמויי decidual בתהליך המכונה decidualization4,6. Decidualization לא תקין נוצרה כמו שורש לבעיה עבור ההשתלה כשל ו עוקבות בתחילת העובר הפלה4,7,8. לכן, להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס decidualization הוא יתרון באבחון וטיפול של אובדן הריון מוקדם.

כיום, מספר מתודולוגיות מנוצלים כדי לחקור את ההשפעות הבסיסית של decidualization על תאי סטרומה רירית הרחם. In vivo, הרחם העכבר יכולה להיגרם באופן מלאכותי על decidualization באמצעות גירוי מכני (קרי,מגרד) או שמן ההזרקה הרחם הורמונאלית להתקפת9. נבדל בני אדם, גירוי מלאכותי זה מקדם את הבידול של לומן הרחם על ידי מתן את המראה של הבלסטוציסט נוכחות, צעד זה נדרש עבור אתחול של decidualization מכרסמים10,11. בהתאם לכך, עקב סיבוכים translational הקשורים בבעלי חיים של דילמות סביב ויוו המבוסס על מחקרים בבני אדם, decidualization מבוסס מודלים ביותר בהצלחה נלמדים במבחנה.

במחקר זה, נושאים מגויסים דרך המיקום של פרסומות בעיתונים מקומיים בשתי באנגלית ובספרדית. נושאים מזוהה מועמדים מתאימים למחקר זה מובאים להיפגש עם מתאם מחקר, שבו מתוארים על גילוי מלא של סיכונים פוטנציאליים. אישור ההזמנה הבנה מלאה של הסיכונים הפוטנציאליים, מושגת ההסכמה של הנבדקים בצורות בכתב ומילולית. נושא הסכמה כוללת רשות (1) עוברים דם ורידי אחסון (2) לטווח ארוך של הרקמות שלהם למטרות מחקר עתידי, (3) מסכים ליצירתו של תרבויות העיקרי של דגימות רקמה שנאספו. בעקבות הסכמה, נותנים לנסיינים טופס כדי להשלים איזו self-identification המותר של גזע/מוצא אתני ו/או הזכות של סודיות. ביקור עוקבות מתוזמנת כדי להשיג את הביופסיה רירית הרחם בהתבסס על המחזור החודשי של הנושא. מתנדבים מגויס מחקר זה לשקף שני אתנית וגזעית דמוגרפיים של אזור המטרופולין סנט לואיס כפי שתועדו בידי מפקד 2012 ו לא היה כרוך ההשתתפות של כל אוכלוסיה פגיעה כולל נשים בהריון, העוברים, עוברי, ילדים מתחת לגיל 18 שנים של גיל או קבוצות פגיעות אחרות. דרישות הכשירות להשתתפות האוסף דגימת ביופסיה כוללים (1) להיות בין הגילאים 18-45 שנים (2) שיש מווסת סדירה (25-32 ימים) (3) לאחר ההריון הנוכחי וללא שימוש באמצעי מניעה הורמונליים/תוך רחמי ההתקן 30 ימים לפני ההרשמה (4) אין זיהום נרתיקי הנוכחי או מחלות המועברות במגע מיני (5) נתקל אין טיפולים אנטיביוטיים הנוכחי, ו (6) נתקל אין פאפ חריגות הנוכחי.

במסגרת מחקר זה, תאי סטרומה רירית הרחם (HESC) אדם תרבותי, המושרה באופן מלאכותי לעבור במבחנה decidualization דרך תוספת של הורמונים (אסטרדיול (E2) medroxyprogesterone אצטט (MPA), אדנוזין מחזורית monophosphate (מחנה)) למדיום. בשיטה זו, היא מידת decidualization שונה בהתבסס על המספר הכולל של ימים של טיפול הורמונלי. יחד עם התמורות cytoskeletal, תוספי ההורמונלי גורם עיבודים ביוכימי שבו התאים decidual לחוות הפרשה כמו איכויות2,4. הביטוי של גנים הולמרק, פרולקטין (PRL) ו פקטורי גדילה דמויי אינסולין מחייב חלבון 1 (IGFBP1), יכול להיות מנוצל כדי לאשר ולכמת את מידת HESC decidualization5,12, 13 , 14. חשוב, הכדאיות של פרוטוקול זה לנהל גנים ספציפיים נוקאאוט גם הוכח.

Protocol

כל ביופסיות רירית הרחם האנושי שנאספו במחקר זה פיקחו את אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס, המחלקה למיילדות, גינקולוגיה באמצעות לוח סקירה מוסדיים (IRB) אישור טופס הסכמה בכתב.

1. הכנה

  1. להכין 500 מ של 1 x מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק) על-ידי הוספת פניצילין U/mL 100 100 סטרפטומיצין µg/mL הבקבוק מכיל מדיה (הפניה נוספות כמו HBSS + בינוני).
  2. הכנת 500 מ"ל של מדיום נשר שונה של Dulbecco: F-12 תערובת חומרי מזון (DMEM/F12) עם פנול אדום-גלוטמין, 15 מ מ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES) על-ידי הוספת 1% פתרון אנטיביוטיקה-antimycotic (סופי הריכוז פניצילין U/mL 100, 100 µg/mL סטרפטומיצין ו 0.25 µg/mL Fungizone) בכלי התקשורת המכיל בקבוק (הפניה נוספות כמו HESC בידוד מדיה).
  3. הכנת 500 מ"ל של DMEM/F12 עם פנול אדום-גלוטמין, 15 מ מ HEPES על-ידי הוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 1 x נה HCO23ו 1% פניצילין (10,000 U/mL), סטרפטומיצין (10,000 µg/mL) (עט חיידק) לתקשורת המכיל בקבוק (בהמשך הפניה כמו מדיה HESC.)
  4. הכנת 500 מ"ל מופחת סרום בינוני עם L-גלוטמין, 2.4 g/L סודיום ביקרבונט HEPES עם 2% פחם הפשיטו עוברית שור סרום (csFBS) ו- 1% עט חיידק למדיה המכיל בקבוק (הפניה נוספות כמו Decidualization מדיה).
  5. הכנת 500 מ"ל של פנול אדום DMEM/F12 חינם על-ידי הוספת 2% פחם הפשיטו סרום שור עוברית (csFBS) בתקשורת המכיל בקבוק (הפניה נוספות כמו שינוי מדיה).
  6. הכינו 10 ננומטר אסטרדיול (E2), אצטט medroxyprogesterone 1 מיקרומטר (MPA) ו 50 מיקרומטר מחזורית אדנוזין monophosphate (מחנה) צינור חרוטי פוליפרופילן 15 מ"ל ולהוסיף 2 מ לכל aliquot טוב של decidualization בעבר מוכן מדיה עבור במבחנה decidualization assay (הפניה נוספות כמו EPC מדיה).
  7. להכין 50 מ של קפוא מדיה עם 90% FBS ו 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) 50 מ ל צינור חרוטי פוליפרופילן (הפניה נוספות כמו מדיה קפוא).
  8. מראש לשקול 25 מ ג של Collagenase ו- 5 מ"ג של DNase אני צינור פוליפרופילן חרוט 50 מ ל, חנות ב-20° C.

2. רכישת ביופסיה רירית הרחם אנושי

  1. להשיג דגימות ביופסיה רירית הרחם האנושי שנאספו בשלב המקדימות (9 יום - יום 12) של המחזור החודשי מהמרפאה IRB אושרה ב- HBSS.
  2. לשטוף את דגימות ביופסיה עם 1 מ"ל של prewarmed 37 ° C HBSS + בינוני וללחוץ בעדינות כדי להסיר את עודף דם, ריריות.

3. בידוד של תאי סטרומה רירית הרחם אדם (HESC)

הערה: הליך זה בידוד מתבצע בסביבה סטרילית תחת בטיחות ביולוגית ארון.

  1. להעביר את הביופסיה עם מלקחיים סטיריליים לתוך שפופרת צנטרפוגה פוליפרופילן חרוט 50 מ ל, המכיל 10 מ"ל HBSS טריים.
  2. Centrifuge את הביופסיה בטמפרטורת החדר 500 g x עבור 90 s.
    1. אם יתבקע צניפה התא, ספין מחדש את הביופסיה-g x 2,000 עבור 90 s.
  3. להסיר את המדיה באמצעות pipet של 1 מ"ל, לשטוף עם 10 מ"ל של 37 ° C prewarmed HESC בידוד מדיה ואחריו צנטריפוגה ב 500 x g עבור 90 s.
  4. מסיר את המדיה באמצעות pipet של 1 מ"ל, והוסף נמרצות 3 מ"ל של מדיה בידוד HESC טריים לנתק את הביופסיה.
  5. Decant את הביופסיה לתוך צלחת פטרי המכיל 5 מ של HESC בידוד מדיה.
  6. מינצ את הביופסיה לתוך כמו חתיכות קטנות ככל האפשר באמצעות #5. מלקחיים ומספריים בסדר תפר ישר למשך 20 דקות.
  7. להכין DNase אני ואנזימים Collagenase על-ידי הוספת 10 מ"ל אמצעי בידוד HESC DNase שנשקל מראש אני (0.5 mg/mL), Collagenase (2.5 mg/mL). מערבבים עם pipet.
  8. פיפטה לחתוך דגימות רקמה באמצעות pipet של 1 מ"ל לתוך 50 מ ל חרוט פוליפרופילן צינור. לשטוף עם mL 7 אמצעי בידוד HESC ולהוסיף צינור פוליפרופילן לרכוש המדגם המלא.
  9. צנטריפוגה המדגם בטמפרטורת החדר ב 800 x g עבור 2 דק להסיר בעדינות את תגובת שיקוע בעזרת פיפטה.
  10. לסנן את DNase Collagenase פתרון באמצעות מסנן 0.2 µm ואני מחובר 10 מ"ל מזרק ישירות על גבי גלולה.
  11. מערבולת 10 s כדי resuspend גלולה.
  12. תקציר ב- 37 מעלות צלזיוס המים הרותחים עבור 1.5 h, vortexing 10 s ביסודיות כל 10 דקות, עד רקמות מתעכלת.
  13. לסנן את הדגימה דרך מסננת תא 40 µm מוערמים על צינור חרוטי 50 מ ל פוליפרופילן כדי להסיר תאים אפיתל ופסולת רקמות.
    הערה: תאי סטרומה הם בצינור פוליפרופילן חרוט 50 מ.
  14. Centrifuge 50 מ ל צינור פוליפרופילן חרוט ב g 800 x 2.5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בעדינות את תגובת שיקוע עם פיפטה 1 מ"ל.
  15. Resuspend בגדר ב 10 מ"ל אמצעי בידוד HESC.
  16. צנטריפוגה ב g 800 x 2.5 דקות בטמפרטורת החדר. וארוקן את תגובת שיקוע ולאחר מכן resuspend תאים 6 מ של מדיה HESC פיפטה ואחורה לערבב.
  17. לאט לאט שכבה על 3 מ"ל של מדיה הדרגתיות צפיפות התאים resuspended כדי להפריד את כדוריות הדם הנותרים של תאי סטרומה, נזהר שלא לערבב את השכבות.
  18. Centrifuge 15 mL צינור פוליפרופילן ב g x 400 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  19. לאסוף 5 מיליליטר תגובת שיקוע בתוך צינור פוליפרופילן 50 מ"ל ולהוסיף של 5 מ"ל HESC מדיה נוספים כדי resuspend את התאים.
  20. צנטריפוגה ב g 800 x 2.5 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו הסרת תגובת שיקוע, תוספת של 6 מ ל HESC מדיה. מערבולת המדגם עבור 10 s ומיקס על ידי pipetting קדימה, להפוך 5 פעמים.
  21. Aliquot µL 10 תאים מחדש על תנאי צינור microcentrifuge 1.5 mL עבור ספירת תאים.
  22. להוסיף 10 µL של 0.4% Trypan Blue כתם תא aliquot ולערבב עם pipet. לטעון 10 µL של aliquot ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.
  23. צלחת התאים את הבקבוק המתאים תלויים ספירת התאים הכולל בתקשורת HESC 15 mL.
    1. אם המספר הכולל של תאים פחות מ 1 מיליון, צלחת כל התאים את הבקבוק 25 ס מ עם 6 מ של המדיה HESC. אם מספר התאים הכולל יותר מ- 1 מיליון, צלחת כל התאים את הבקבוק 75 ס מ עם 15 מ"ל של המדיה HESC.
  24. התרבות התאים CO 5%2 החממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 6 שעות כדי להבטיח התא הנכון אדהזיה ולשנות התקשורת למדיה HESC.
  25. תרבות של HESC מבודדים בתוך חממה2 CO 5% ב 37 מעלות צלזיוס במשך תקופה של 3-5 ימים עד התאים יוצרים טפט להשגת 80-90% confluency בבקבוקון מצופה.
  26. שינוי HESC מדיה כל יומיים.
    1. מדיה HESC חמים בתוך אמבט מים 37 º C למשך 15-20 דקות.
    2. תשאף המדיה מן הבקבוק ולהוסיף מדיה HESC טריים הבקבוק (אמצעי אחסון של עבודה: 8 mL או 16 מ"ל לכל הבקבוק 25 ס מ או 75 ס מ בהתאמה).
    3. מקם את הבקבוק בחזרה לתוך החממה 5%2 CO ב 37 ° C עד 80-90% confluency מושגת.
  27. ברגע HESC הופכים confluent 80-90%, העברת תאים מתוך 25-ס"מ עד 75 ס מ את הבקבוק או מתוך הבקבוק 75 ס מ אחד שלוש מבחנות 75 ס מ.
    הערה: HESC יכול להיות קפוא ומאוחסנים לשימוש מאוחר יותר בשלב זה לניסויים עתידיים.

4. הקפאה והפשרה HESCs

  1. האחות המדיה מן הבקבוק 75 ס מ ומוסיפים 2 מ של טריפסין-EDTA.
  2. דגירה ב חממה2 CO 5% למשך 2-3 דקות ב 37 ° C עד התאים לסלק מן הבקבוק.
  3. להוסיף 7 מ של מדיה HESC, לערבב היטב על ידי pipetting ואחורה.
  4. צנטריפוגה ב g 800 x 2.5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע.
  5. תווית קפוא צינורות עם שורת התאים, תאריך ומספר המעבר.
  6. מחדש להשעות בגדר תא ב 5 מ של הקפאת מדיה.
  7. Aliquot 1 מ"ל של HESC מושעה מחדש את כל צינורות צינור והעברה ל-80 מעלות צלזיוס מקפיא.
  8. העברת צינורות חנקן נוזלי בתוך 24 שעות.
    הערה: אם תכנון להפשיר תאים בתקופה הקרובה, לאחסן תאים קפוא ב-80 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד.
  9. עבור מפשיר את HESCs מחממים HESC מדיה עבור 20 דקות.
  10. הוסף 8 מ של מדיה HESC טרופה הבקבוק 25 ס מ.
  11. לאחזר את הצינור הקפאה מיכל חנקן נוזלי או-80 ° C ויציפו את הצינור ב- 37 מעלות צלזיוס המים הרותחים למשך 1-2 דקות. להפשיר את התאים.
  12. להעביר HESC המופשרים בקבוקון 25 ס מ עם HESC מדיה, דגירה ב חממה2 CO 5% בין לילה ב 37 º C.
  13. ביום למחרת, לשנות את התקשורת HESC והמתן 2-3 ימים עד HESC הופכים confluent להעביר תאים 75 ס מ הבקבוק כפי שיפורט להלן פרוטוקול 5.
    1. מדיה HESC חמים בתוך אמבט מים 37 º C למשך 15-20 דקות.
    2. תשאף המדיה מן הבקבוק ולהוסיף מדיה HESC טריים הבקבוק (אמצעי אחסון של עבודה: 8 mL או 16 מ"ל לכל הבקבוק 25 ס מ או 75 ס מ בהתאמה).
    3. מקם את הבקבוק בחזרה לתוך החממה 5%2 CO ב 37 ° C עד 80-90% confluency מושגת.

5. תאי סטרומה רירית הרחם (HESC) אדם Culturing

הערה: הליך זה Culturing מתבצע בסביבה סטרילית תחת בטיחות ביולוגית ארון.

  1. מראש בחום HESC מדיה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים למשך 20-30 דקות.
  2. האחות המדיה מן הבקבוק ולהוסיף 0.25% טריפסין ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (1 מ"ל הבקבוק 25 ס מ או 2 מ"ל על הבקבוק 75 ס מ).
  3. דגירה ב CO 5%2 החממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות עד לסלק התאים.
  4. טפח בעדינות על הקירות את הבקבוק מכך התאים הנותרים. להוסיף 7 מ של מדיה HESC, לערבב היטב על ידי pipetting ואחורה.
  5. Pipet התערובת תא לתוך צינור פוליפרופילן חרוט 50 מ ל צנטריפוגה ב 800 x g 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. וארוקן את תגובת שיקוע, מחדש להשעות בגדר תא HESC בתקשורת.
    1. להוסיף 15 מ"ל 25 ס מ את הבקבוק או 45 מ עבור הבקבוק 75 ס מ (15 מ ל כל אחד).
  7. להוסיף התליה תא מ ל או 15 מ"ל כל הבקבוק 25 ס מ או 75 ס מ בהתאמה.
  8. תרבות של HESC מבודדים בתוך חממה2 CO 5% ב 37 מעלות צלזיוס במשך תקופה של 3-5 ימים עד התאים יוצרים טפט להשגת 80-90% confluency בבקבוקון מצופה.
  9. שינוי HESC מדיה כל יומיים.
    1. מדיה HESC חמים בתוך אמבט מים 37 º C למשך 15-20 דקות.
    2. תשאף המדיה מן הבקבוק ולהוסיף מדיה HESC טריים הבקבוק (אמצעי אחסון של עבודה: 8 mL או 16 מ"ל לכל הבקבוק 25 ס מ או 75 ס מ בהתאמה).
    3. מקם את הבקבוק בחזרה לתוך החממה 5%2 CO ב 37 ° C עד 80-90% confluency מושגת.

6. האדם יופיצ תא (HESC) סטרומה רירית הרחם ואת siRNA תרביות תאים

הערה: הליך זה תרביות תאים מתבצע בסביבה סטרילית תחת בטיחות ביולוגית ארון.

  1. האחות HESC המדיה מן הבקבוק 75 ס מ ומוסיפים 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA פתרון.
  2. דגירה ב- 5% CO חממה2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות עד לסלק התאים.
  3. ברגע תאים נעקרות את הבקבוק, להוסיף 7 מ של מדיה HESC, לערבב בעדינות על ידי pipetting קדימה, להפוך 5 פעמים.
  4. Pipet התערובת תא לתוך צינור פוליפרופילן חרוט 50 מ ל צנטריפוגה ב 800 x g 2.5 דקות בטמפרטורת החדר. וארוקן את תגובת שיקוע, מחדש להשעות בגדר תא ב- 10 מ"ל של המדיה HESC.
    הערה: אם ציפוי תאים מן הבקבוק אחד או יותר, פשוט להגדיל את נפח המדיה HESC.
  5. ספירת תאים באמצעות של Hemocytometer.
    1. µL 10 aliquot של תאים מושעה מחדש לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.
    2. להוסיף 10 µL של 0.4% Trypan Blue כתם תא aliquot, לערבב על ידי pipetting קדימה, הפוך.
  6. צלחת 0.8 x 105 תאים לכל טוב טוב 6 צלחות. לאחר יומיים, תאים צריך להיות 60-70% confluent של האופטימלית תרביות תאים.
  7. עבור כל דגימה siRNA תרביות תאים, להכין את מתחמי באמצעות siRNA (60 nanomoles) כדי ריאגנט תרביות תאים.
  8. לדלל 5 µL של תרביות תאים ריאגנט ב 150 µL מדיה פנויה מופחת סרום, תקופת דגירה של 5 דקות.
  9. לדלל 60 nanomoles של siRNA ב 100 µL מדיה פנויה מופחת סרום, תקופת דגירה של 5 דקות.
  10. לאחר 5 דקות, לשלב siRNA מדולל עם תרביות תאים מדולל ריאגנט פתרון, לערבב בעדינות על ידי pipetting קדימה, להפוך 5 פעמים.
    הערה: אם transfecting אחד או יותר siRNA בבארות מרובים, להכין מיקס מאסטר ב- 10 מ"ל צינורות פוליסטירן.
  11. דגירה מתחמי ריאגנט siRNA-תקנים עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  12. במהלך זה דגירה, להוסיף 1 מ"ל של שינוי מדיה מכל קידוח.
  13. אחרי 5 דקות של דגירה, צנטריפוגה צינורות ב 500 g x למשך 2 דקות לאסוף את הפתרון ולהוסיף את µL 250 של מתחמי ריאגנט siRNA-תקנים לכל טוב המכיל תאים ומדיה.
  14. לערבב במוזיקת בעדינות, דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO 5% במשך 5 שעות.
  15. לאחר 5 שעות, לשנות את המדיה HESC מדיה.
  16. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב חממה2 5% CO 2 ימים לקראת assay decidualization במבחנה .

7. במבחנה Decidualization Assay

הערה: זו assay מתבצע בסביבה סטרילית תחת בטיחות ביולוגית ארון.

  1. להכין כלי התקשורת EPC לפני מתחיל את הטיפול decidualization במבחנה כמתואר בקמדן. et al. 3 (ראה 1.6).
  2. האחות המדיה מן השעה פוסט-48 transfected שורה של HESC מודגרות מהשלב 6.16.
  3. להוסיף 2 מיליליטר EPC מדיה בכל טוב.
    שימו לב: כמו פקד, השאר ערכה אחת של תאים לא מטופל עם EPC מדיה. במקום זאת, הוסף 2 מ"ל של מדיה HESC הבארות שליטה.
  4. דגירה התאים 5% CO2 החממה ב 37 ° C ל-6 ימים.
    1. לשנות את המדיה EPC כל 48 שעות.
      1. חם ולהתכונן EPC מדיה באמבט מים 37 ° C 15-20 דקות.
      2. האחות מדיה מן הבאר והוסף מדיה EPC טריים.
      3. מקם את הצלחת בחזרה לתוך החממה 5%2 CO ב 37 º C.
  5. לאחר יום השישי, לנתח את היקף סטרומה תא decidualization ויה ELISA ו לרביעיית-PCR (כמפורט להלן).

8. אימות של Decidualization ב חוץ גופית ניצול בזמן אמת כמותיים PCR (לרביעיית-PCR)

הערה: לרביעיית-PCR הושלמה כאמור שמתואר ואחKommagani10.

  1. לבודד את הרנ א סה כ מ HESC ניצול פרוטוקול ערכה זמינים מסחרית של בידוד ה-RNA.
    1. לנתח את כמות ה-RNA וטוהר (260/A280) באמצעות NanoDrop או מתודולוגיה דומה כפי שמתואר גרסיה-אליאס ואח15.
  2. לסנתז cDNA מ 1 µg של RNA הכולל דרך פרוטוקול ערכת זמינים מסחרית שעתוק במהופך.
  3. להפעיל תגובת לרביעיית-PCR כפי שמתואר פרוטוקול ערכת לרביעיית זמינים מסחרית-PCR.
    1. לבצע את התגובה באמצעות שילוב PCR מאסטר זמינים מסחרית בזמן אמת, גנים ספציפיים רגשים יחד עם פקדים מערכת פנימיים (18s, PRLו IGFBP1).

9. אימות של Decidualization ב חוץ גופית ניצול אליסה

  1. לכמת את רמות פרולקטין המופרש מהתקשורת תרביות רקמה ניצול ערכת דיאגנוסטיקה פרולקטין זמינים מסחרית.

10. אימות של Decidualization ב חוץ גופית ניצול Phalloidin מכתים.

  1. הכנס coverslips סטרילי כל טוב של צלחת טוב 12.
  2. חזור על שלבים 6.1-6.5.
  3. צלחת 0.8 x 105 תאים לכל טוב של צלחת טוב 12.
  4. דגירה התאים 5% CO2 החממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
  5. האחות התקשורת.
  6. חזור על שלבים 7.3-7.4.
  7. לתקן את התאים ב- 4% paraformaldehyde (PFA) buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  8. האחות הפתרון קיבוע ולשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS למשך 5 דקות.
  9. להוסיף 0.1% חומרים פעילי שטח ללא יונית פוליאתילן גליקול טרט-תמצית phenyl אתר ב- PBS עבור 5 דקות לתאים קבועות כדי להגדיל את חדירות.
  10. לשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS למשך 5 דקות.
  11. להוסיף 100 µL phalloidin פתרון לכל coverslip, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות.
    1. להכין מטריים דילול ב- PBS באמצעות פתרון מניות phalloidin ביחידה 1 לכל 5 µL.
  12. לשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS למשך 5 דקות.
  13. הר השקופיות הרכבה בינונית המכיל 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (דאפי).
  14. לבחון את התאים ניצול מיקרוסקופ קונפוקלי.

תוצאות

Decidualization בתרבות HESC

בעקבות בידוד, תאי סטרומה רירית הרחם אדם היו בתרבית היווצרות חד שכבתי עם 80-90% confluency, שנגזרות עבור במבחנה decidualization בטיפול עם 10 ננומטר E2 1 מיקרומטר MPA, מחנה 50 מיקרומטר (EPC). משמרות מורפולוגי המשויך במבחנה decidu...

Discussion

המחזור החודשי הרבייה הנשי מאופיין על ידי עלייה ברמות הפרוגסטרון לאורך כל שלב luteal, ובכך גרימת את decidualization של ESC לתוך תאים הפרשה עגול, אפיתל דמויי3,8. אתחול של decidualization הוא מין התלויים. בבני אדם, decidualization מתרחשת באופן ספונטני על עליית ריכוז הפרוגסטרון, ואילו עכבר?...

Disclosures

עבודה זו נתמכת על ידי מימון של נבחרת מכונים לבריאות (NIH) / המכון הלאומי של גרנט ובריאות הילד והתפתחות האדם (NICHD) (R00 HD080742), בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון הזנק מממן את ר. ק ברצוננו להודות המרפאה לפוריות אוניברסיטת וושינגטון למתן את דגימות ביופסיה רירית הרחם.

Acknowledgements

המחברים אין לחשוף.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Opti-MEM I (1X) Reduced Serum MediumGibco31985-070For decidualization media
DMEM / F12 (1:1) (1X)Gibco11330-032
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061For cell count
PureLink RNA Mini KitInvitrogen12183018AFor RNA Isolation/Purification
TaqMan 2X Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
High Capacity cDNA Reverse Transcription KitApplied Biosystems4374967
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous ControlLife Technologies4319413EFor qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay Prolactin ProbeApplied Biosystems4331182For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 ProbeApplied Biosystems4331182For qPCR internal control
Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainterAbcamab176753
Human Prolactin ELISA KitInvitrogenEHIAPRL
16% ParaformaldehydeAlfa Aesar30525-89-4Fixative
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen13778150Transfection Reagent
ProLong Gold antifade reagent with DAPIInvitrogenP36935For mounting
0.25% Trypsin-EDTA (1X)Gibco25200-056
Penicillin StreptomycinGibco15140-122
Charcoal Stripped Fetal Bovine SerumSigmaF6765-500ML
Sodium Bicarbonate (7.5%)Gibco25080-094
Ficoll-Paque PLUS ReagentFisher Scientific45001749
Collagenase from Clostridium histolyticumSigmaC0130-1G
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigmaDN25-100MG
Medroxyprogesterone 17-acetateSigmaM1629-1GFor EPC Media
EstradiolSigmaE1024-1GFor EPC Media
cAMPSigmaA6885-100MGFor EPC Media
Fine straight stitch scissorsFine Science Tools15396-00
TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 ProbeApplied Biosystems4351372
Fetal Bovine Serum, heat inactivatedGibco10-082-147
Antibiotic-antimycoticThermo Scientific15240062
Hank’s Balanced Salt Solution Corning21-021-cv
50 mL conical polypropylene Falcon tubeCorning352098
Dumont #5/45 ForcepsFine Science Tools11251-35
100 x 15 mm Glass Petri dishVWR75845-546
40 micron cell strainerMidsci229481
Isotemp 215 Water bathFisher ScientificFS-215
LSE Centrifuge Corning6755
Human NCOA2 siRNA DharmaconL-020159-00Gene specific qPCR probe
Steri-cycle i160 CO2 Incubator Thermo Scientific51030301
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000For RNA quantification
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific50146771
75 cm Canted Neck Cell Culture flaskCorning430641U
6 well Non-Pyrogenic Cell Culture PlateCorning3506
Pipet Controller UltraCorning4099
PhotoshopAdobe19.0.1.334
25 cm Canted Neck Cell Culture flaskCorning7200876
Triton X-100SigmaX100-1L
15 mL conical polypropylene Falcon tubeCorning352099
10 mL SyringeBD302995
1300 Series A2 Biological Safety HoodThermo Scientific1377
accuspin Micro17 centrifugeFisher Scientific13100675
7500 Fast real time PCR systemApplied Biosystems3052632
EVOS FL Immunofluorescence MicroscopeLife Technologies01414-155G-291
Leica Inverted Light MicroscopeLeicaDMi1
IllrustratorAdobe22.0.1.253
Excel SpreadsheetsMicrosoft2016
Deckglaser 18 mm cover glassesNeuVitroGG-18
Reichert Bright-Line HemacytometerSigmaZ359629-1EA
2-mercaptoethanolFisher BioreagentsBP176-100For RNA lysis buffer
1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic VialCorning430658For freezing HESC cells 
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)SigmaD2650-100mLFor freezing media

References

  1. Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
  2. Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
  3. Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
  4. Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
  5. Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
  6. Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
  7. Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
  8. Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
  9. Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
  10. Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
  11. Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
  12. Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
  13. Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
  14. Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
  15. Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
  16. Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
  17. Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

139siRNA decidualization

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved