JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا طريقة قوية لإعادة برمجة الخلايا الليفية الجنينية الأولية في cardiomyocytes الوظيفية من خلال أوفيريكسبريشن من GATA4، Hand2، Mef2c، Tbx5، مير-1، ومير-133 (GHMT2m) جنبا إلى جنب مع تثبيط الإشارات TGF-β. يولد لدينا بروتوكول cardiomyocytes الضرب أقرب وقت توصيل بعد 7 أيام بنسبة تصل إلى 60% الكفاءة.

Abstract

ترانس-التفريق بين نوع خلية جسدية واحدة إلى آخر إمكانات هائلة لنموذج وعلاج الأمراض التي تصيب الإنسان. أظهرت الدراسات السابقة أن الفأر الجنينية، يمكن برمجتها الليفية الجلدية، وأمراض القلب إلى الخلايا التي يسببها-كارديوميوسيتي-مثل الوظيفية (iCMs) من خلال overexpression عوامل النسخ كارديوجينيك بما في ذلك GATA4، Hand2، Mef2c، و Tbx5 على حد سواء في المختبر و في فيفو. ومع ذلك، أظهرت هذه الدراسات السابقة كفاءة منخفضة نسبيا. من أجل استعادة وظيفة القلب بعد الإصابة، يجب توضيح الآليات التي تحكم إعادة برمجة القلب لزيادة الكفاءة والنضج من iCMs.

أظهرنا سابقا أن تثبيط الإشارات برو تليفية هائلة يزيد من كفاءة إعادة برمجة. هنا، نحن بالتفصيل الأساليب لتحقيق كفاءة إعادة برمجة لتصل إلى 60%. وعلاوة على ذلك، يصف لنا العديد من الطرق بما في ذلك التدفق الخلوي والتصوير إيمونوفلوريسسينت، وتصوير الكالسيوم لقياس كفاءة إعادة برمجة ونضوج الخلايا الليفية أعيدت برمجتها. استخدام البروتوكول بالتفصيل هنا، ميكانيكية يمكن إجراء دراسات لتحديد المنظمين الإيجابية والسلبية لإعادة برمجة القلب. هذه الدراسات قد تحدد مسارات الإشارات التي يمكن استهدافها لتشجيع إعادة برمجة الكفاءة والنضج، مما يمكن أن يؤدي إلى علاجات الخلية رواية لعلاج أمراض القلب البشري.

Introduction

مرض القلب الاقفاري سبب الرئيسي للوفاة في الولايات المتحدة1. تجربة الأميركيين تقريبا 800,000 أول أو المتكررة احتشاء عضلة القلب (ميتشيغن) كل سنة1. عقب مي، يضعف وفاة كارديوميوسيتيس (CMs) وتليف القلب، أودعت بتنشيط الخلايا الليفية القلب، قلب الدالة2،3. تطور قصور القلب بعد مي لا رجعة فيه إلى حد كبير نظراً لقدرة التجدد الفقراء من الكبار CMs4،5. بينما العلاجات السريرية الحالية بطء تطور المرض وتقليل مخاطر أحداث القلب المستقبل6،7،،من89، لا العلاجات عكس تطور المرض بسبب عدم القدرة على تجديد اتفاقية الأنواع المهاجرة احتشاء بعد10. تظهر الخلية رواية العلاجات لعلاج المرضى بعد "اللون مخيب للآمال"، وقد أظهرت التجارب السريرية إيصال الخلايا الجذعية للقلب بعد مي حتى الآن غير حاسمة التجدد المحتملة11،12، 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.

توليد الخلايا الجذعية المشتقة من الإنسان المستحثة pluripotent (هيبسكس) من الخلايا الليفية التي overexpression من أربعة عوامل النسخ، تجلى أولاً تاكاهاشي & ياماناكا، فتحت الباب أمام اختراقات جديدة في خلية العلاج19. يمكن تمييز هذه الخلايا إلى كافة الطبقات الجرثومية الثلاث19، والعديد من الطرق عالية الكفاءة لتوليد إعداد كبيرة من الأنواع المهاجرة وقد ثبت سابقا20،21. CMs المستمدة من هيبسك (الوركين-CMs) يوفر منصة قوية لدراسة كارديوميوجينيسيس، وقد آثار هامة بالنسبة لإصلاح القلب بعد الإصابة. ومع ذلك، الوركين-المهاجرة تواجه حاليا عقبات متعدية الجنسيات بسبب المخاوف من تيراتوما تشكيل22، وقد تكون طبيعتها غير ناضجة برو-أرهيثموجينيك23. إعادة برمجة الخلايا الليفية في هيبسكس آثار الاهتمام في مباشرة إعادة برمجة الخلايا الليفية في أنواع الخلايا الأخرى. إيدا et al. أثبتت أن overexpression من GATA4 و Mef2c و Tbx5 (بتوقيت جرينتش) في نتائج الليفية في إعادة برمجة مباشرة إلى النسب القلب، أن كان ذلك في انخفاض كفاءة24. تم تحسين برمجة الكفاءة بالإضافة إلى Hand2 (غمت)25. ومنذ هذه الدراسات المبكرة، أثبتت العديد من المنشورات أن تغيير كوكتيل عامل إعادة برمجة مع النسخ الإضافية من العوامل26،27،،من2829، برمجة الكروماتين معدلات30،31أو32،ميكرورناس33الجزيئات الصغيرة34 يؤدي إلى تحسين الكفاءة و/أو نضوج المستحث كارديوميوسيتي مثل الخلايا (iCMs ).

ونقدم هنا بروتوكول مفصل لتوليد iCMs من الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFs) بكفاءة عالية. ونحن سابقا أظهر أن غمت كوكتيل هو تحسن كبير بالإضافة إلى مير-1 ومير-133 (GHMT2m)، وكذلك تحسين عند برو-تليفية إشارات المسارات بما في ذلك تحويل عامل النمو بيتا (TGF-β) إشارات أو المرتبطة رو البروتين كيناز (روك) مسارات الإشارات التي تحول دون35. نحن استخدام هذا البروتوكول، تبين أن حوالي 60% خلايا عن القلب "تروبونين تي" (كتنت)، أعرب حوالي 50% عن α-أكتينين، ويمكن ملاحظة وجود عدد كبير من الخلايا الضرب أقرب يوم 11 بعد توصيل لإعادة برمجة العوامل والعلاج مع TGF-β من النوع الأول مثبط لمستقبلات A-83-01. وعلاوة على ذلك، هذه iCMs التعبير عن الفجوة تقاطع البروتينات بما في ذلك كونيكسين 43 ويحمل الانكماش عفوية والعابرين الكالسيوم. تحسن ملحوظ في إعادة برمجة الكفاءة مقارنة بالدراسات السابقة وهذا يدل على إمكانية تجديد اتفاقية الأنواع المهاجرة من السكان الخلية الذاتية التي تبقى في احتشاء عضلة القلب بعد.

Protocol

جميع التجارب التي تتطلب الحيوانات أقرتها لجنة الاستخدام UC دنفر انشوتز الطبية داخل حرم ورعاية الحيوان المؤسسية.

1-عزل ميفس

  1. شراء الفئران الحوامل C57BL/6 في E13. السفينة بين عشية وضحاها.
  2. Euthanize الأم وفقا للبروتوكولات المعتمدة في إياكوك (ت: ~1.3 CO لتر في الدقيقة2 حتى يظهر الحيوان الميت متبوعاً بخلع عنق الرحم)
  3. رذاذ الأم مع الإيثانول 70% وفتح تجويف البطن. إزالة القرن الرحم التي تحتوي على الأجنة ووضعه في صحن 10 سم مع PBS العقيمة.
  4. إجراء شق في كيس الجنين بالإفراج عن الجنين. نقل الجنين إلى تنظيف صحن 10 سم مع PBS العقيمة. أشطف بعناية.
  5. قطع الجسم أسفل الكبد وتجاهل في الرأس والجزء العلوي من الجسم. إزالة الأجهزة الداخلية وتجاهل. نقل الأنسجة المتبقية إلى طبق نظيف 10 سم مع PBS العقيمة ونقل اللوحة إلى مجلس الوزراء 2 أو 1 مستوى السلامة الأحيائية. والجمع بين الأنسجة من جميع الأجنة في صحن سم 10 نظيفة وجافة وفرم أربا غرامة.
  6. إضافة 6 مل من 0.25% التربسين/1 مم أدتا إلى أجنة مفروم. تريتوراتي عدة مرات ماصة تفكك النسيج. احتضان لمدة 40 دقيقة في ˚C 37 مع شركة 5%2.
  7. ريسوسبيند الخلايا في نمو متوسط (الجدول 1). يتم ضبط حجم الوسائط استناداً إلى عدد الأجنة حصادها. بشكل عام، استخدام نسبة تبلغ حوالي 25 مل وسائط النمو للأجنة 1.2.
  8. لوحة 25 مل خلايا حراكه في طبق 15 سم. بعد 24 ساعة، نضح وسائط الإعلام وإضافة 25 مل متوسط نمو جديدة لكل لوحة.
  9. بعد 72 ساعة، إضافة 2 مل من 0.25% التربسين/1 مم أدتا إلى كل طبق 15 سم. عند فصل الخلايا من طبق الثقافة، إلغاء تنشيط التربسين مع 15 مل نمو متوسطة وجمع الخلايا في أنابيب مخروطية البوليستيرين 50 مل. الطرد المركزي خلايا لمدة 3 دقائق في 160 x ز في درجة حرارة الغرفة. ريسوسبيند بيليه الخلية في النمو المتوسطة وتصفية من خلال مصفاة خلية مسام 70 ميكرون.
  10. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وتجميد MEFs في مختبرين الخلايا 2 مليون في تجميد متوسطة ([دمس] 10%، 25% FBS في النسر المتوسط تعديل (دميم في دولبيكو)/ارتفاع الجلوكوز) في-80 درجة مئوية. نقل الخلايا إلى النتروجين السائل بعد 24 ساعة، ومخزن حتى جاهزة للاستخدام.
    ملاحظة: التعبير الجيني العالمي في ميفس كان لمحة عن عزلة باستخدام هذا البروتوكول بواسطة تسلسل الحمض النووي الريبي (الرنا-seq) لضمان مصادقة الخلية. تم تحميل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي من الخلايا MEF ترميز من المعاهد الوطنية للصحة الجينات التعبير الجامع (GEO) مع انضمام عدد GSE93454. تسلسل الحمض النووي الريبي البيانات التعبير الجيني ل MEFs المستخدمة من قبل الولايات المتحدة أودعت في المعاهد الوطنية للصحة توقعات البيئة العالمية مع انضمام عدد GSE71405. تم دمج هاتين المجموعتين من البيانات وفقا لرموز الجينات المشتركة. البيانات التعبير ثم تحولت ضد سجل وولدت سكاتيربلوت البيانات التعبير لدينا ميفس وترميز ميفس وتتناسب مع خط انحدار خطي (الشكل 1A). ميفس معزولة باستخدام هذا البروتوكول جزيئيا مماثلة لتلك التي تم عزلة بواسطة مختبرات أخرى.

2-إنتاج لفي وتوصيل MEFs

ملاحظة: جميع الخطوات في هذا القسم يجب أن يتم في "مجلس الوزراء 2 مستوى السلامة الأحيائية". حيث يستخدم هذا البروتوكول توصيل النسخ العكسي، ضمان أن السلامة هي الاحتياطات المتخذة بما في ذلك معالجة جميع النفايات التي تحتوي على وسائط الإعلام الفيروسية مع التبييض 10% على الأقل 20 دقيقة الرجوع إلى الشكل 1B لوضع جدول زمني لإعادة برمجة.

  1. الإنتاج لفي استخدام خط الخلية البلاتين ه (PE)
    1. الحفاظ على الخلايا PE المتاحة تجارياً في PE المتوسطة (الجدول 1) التي تحتوي على بلاستيسيدين وبوروميسين اختيار علامات لضمان التعبير عن هفوة-الجيناتبول و الحياة الفطرية للجسيمات للفيروسات التراجعية كفاءة الإنتاج36 . مرور الخلايا في 1:4 أو 1:5 كل يومين. العناية لمنع الاكتظاظ من الخلايا كهذا يمكن أن تقلل من غلة الإنتاج للفيروسات الرجعية.
    2. اليوم-1، البذور حوالي 5 × 106 خلايا للطبق 10 سم في المتوسط النمو (الجدول 1) 16-20 ح قبل تعداء (انظر الجدول 2 للطلاء كثافات لأحجام صحن الثقافة خلية قياسية أخرى). روك بلطف الأطباق ذهابا وإيابا عدة مرات ووضع بعناية في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة لضمان توزيع الطلاء حتى (انظر الشكل 1 للكثافة المثلى والطلاء قبل تعداء).
      ملاحظة: الحرص على صفيحة PE الخلايا في الأجلين المتوسط وخاليا من علامات التحديد قبل تعداء لضمان المتوسطة التي تحتوي على جزيئات الفيروس الذي تم إنشاؤه لا تقتل ميفس.
    3. اليوم 0، إعداد الحمض النووي تعداء. إضافة للطبق 10 سم تعداء، 2 ميكروغرام لكل عامل من عوامل إعادة برمجة-GATA4، Hand2، Mef2c، Tbx5، مير-1، ومير-133 (GHMT2m) – إلى أنبوب 1.5 مل.
      ملاحظة: الرجوع إلى الجدول 2 لقياس كمية الحمض النووي بحاجة إلى ترانسفيكت أحجام صحن الثقافة خلية قياسية أخرى.
    4. في أنبوب منفصل 1.5 مل، إضافة الوسائط المصل انخفاض ميليلتر 360. قم بإضافة كاشف تعداء ميليلتر 36 مباشرة إلى انخفاض مصل وسائط الإعلام. بلطف ونفض الغبار الأنبوب احتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: لتجنب تعداء انخفاض الكفاءة، بعناية على إضافة كاشف تعداء مباشرة إلى وسائط الإعلام المصل مخفضة.
    5. إضافة خليط كاشف الإعلام/تعداء المصل انخفاض للحمض النووي GHMT2m كوكتيل. بلطف ونفض الغبار الأنبوب احتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. عدم دوامة.
    6. إضافة الخليط رد فعل dropwise إلى الخلايا PE، بلطف دوامة وسائل الإعلام عن 10-15 ثانية، ووضع في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة.
      ملاحظة: حسب الشركة المصنعة، تولد خلايا PE عيار متوسط 106 إلى 107 المعدية وحدة/مل. ويولد هذا البروتوكول حوالي 2 × 106 التهابات وحدة/مل قبل 24 ساعة و 6 × 106 التهابات وحدة/مل قبل 48 ساعة في المتوسط موي 4. تعداء للتجارة والنقل/دسريد يمكن أن تستخدم أيضا كبديل لكفاءة تعداء/توصيل إذا رغبت في ذلك؛ تعداء الكفاءة المتوقع أن يتجاوز 90% خلال 48 ساعة (الشكل 1).
  2. تنبيغ MEFs
    1. اليوم 0، معطف الأطباق مع الكولاجين ومكان في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة ح 2 على الأقل.
    2. إزالة ميفس من النتروجين السائل وذوبان الجليد. لوحة 0.2 × 106 خلايا كل طبق 60 ملم في الأجلين المتوسط والنمو. بلطف لوحات روك لضمان حتى توزيع الطلاء ووضع في الحاضنة (انظر الشكل 1 الكثافة المثلى والطلاء و الجدول 2 للطلاء كثافات لأحجام صحن الثقافة خلية قياسية أخرى).
      ملاحظة: تم اختبار هذه الكثافة الطلاء على دفعات متعددة من MEFs معزولة؛ ما لم يكن للخطر MEFs العرض إلى حد كبير جدوى، ضبط الخلية البذر الكثافة ليست ضرورية.
    3. في اليوم 1، 24 ساعة بعد انتهاء تعداء، استخدام المحاقن 30 مل لجمع المتوسطة للفيروس التي تم إنشاؤها بواسطة الخلايا PE. تمرير المتوسطة من خلال مرشح حجم مسام ميكرومتر 0.45 في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. إضافة كاشف تعداء بروميد هيكساديميثريني بتركيز نهائي من 6 ميكروغرام/مل. بعناية إضافة 10 مل نمو جديدة متوسطة إلى خلايا PE بوسائل الإعلام بيبيتينج على جدار الطبق الثقافة لمنع نزوح خلايا.
    4. نضح المتوسطة من ميفس وإضافة 4 مل من المقطوع الطازجة المتوسطة للفيروسات الرجعية لكل طبق. عودة ميفس إلى الحاضنة. إضافة التبييض 10% على جميع المواد التي تتلامس مع المتوسط الفيروسية إلى تحييد الجزيئات للفيروسات الرجعية.
    5. في اليوم 2، تعداء بعد 48 ساعة، كرر الخطوات من 2.2.2 و 2.2.3. يتم تجاهل الخلايا PE بعد جمع 2nd المتوسطة للفيروسات الرجعية.
      ملاحظة: إضافة التبييض 10% إلى تجاهل الخلايا PE لمدة 20 دقيقة على الأقل لتحييد لفي غير المرغوب فيها.
    6. في اليوم 3، نضح المتوسطة من ميفس، وتجديد مع 4 مل iCM المتوسطة (الجدول 1) التي تحتوي على 0.5 ميكرومتر A-83-01، TGF-β من النوع الأول مثبط لمستقبلات. تجديد iCM المتوسطة التي تحتوي على A-83-01 كل يومين.
      ملاحظة: إذا كان استخدام بروتينات فلورية خضراء كعنصر تحكم توصيل، التعبير من المتوقع أن تتجاوز 90 في المائة من هذه النقطة الزمنية (الشكل 1).

3-التدفق الخلوي لعلامات القلب

  1. برمجة المتوسطة aspirate من يوم 9 ميفس والمياه والصرف الصحي (س 1) مع برنامج تلفزيوني 1 x لإزالة الخلايا الميتة والحطام.
  2. أضف 1 مل 0.25% التربسين/يدتا لمدة 5 دقائق في 37 ˚C. فحص الخلايا باستخدام مجهر ضوء ويهز الطبق؛ إذا كانت الخلايا لا تزال تعلق، احتضان 5 دقيقة أكثر في 37 ˚C حتى فصل الخلايا.
  3. تغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 1 x التي تحتوي على 5% FBS وتصفية من خلال مصفاة خلية مسام 70 ميكرون.
  4. الطرد المركزي في 160 x ز لمدة 3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والسائل aspirate من بيليه.
    ملاحظة: لزيادة غلة الخلية، اترك السائل ميليلتر حوالي 50 أعلاه بيليه الخلية.
  5. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1 x 500 ميليلتر التي تحتوي على 1% جيش صرب البوسنة.
  6. إصلاح الخلايا مع 0.2 مل/1 مليون خلايا حل التثبيت لمدة 20 دقيقة على الجليد.
  7. أضف 1 مل 1 x المثلج بيرم/يغسل المخزن المؤقت.
    ملاحظة: هو الحل الخاص بالشركة المصنعة 10 x.
  8. الطرد المركزي خلايا في 160 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية ونضح المادة طافية.
  9. كرر الخطوات من 3.7 و 3.8 وقت إضافي. بعد الغسيل 2nd ، انتقل مباشرة إلى الخطوة التالية، أو إبقاء الخلايا في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  10. كتلة مع 100 ميليلتر من 5% الماعز المصل والمصل حمار في 1 × بيرم/يغسل المخزن المؤقت لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  11. إضافة 100 ميليلتر من جسم الابتدائي المخفف.
    ملاحظة: لهذا البروتوكول، خلايا تم تسميته بالماوس "تروبونين تي" (1: 200) والماوس α-أكتينين (1: 200) لتقدير النسبة المئوية للخلايا إيجابية للمكونات الرئيسية ساركومير القلب. احتضان جسم الأولية ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  12. الطرد المركزي خلايا في 160 x ز 5 م في 4 درجات مئوية ونضح المادة طافية، وتغسل x 2 مع بيرم المثلج/يغسل المخزن المؤقت.
  13. إضافة 100 ميليلتر من جسم الثانوي المخفف.
    ملاحظة: لهذا البروتوكول، تم تسمية الخلايا مع الماوس المضادة 647 جسم الثانوي نانومتر (1: 200). احتضان جسم الثانوية لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على دوار أكثر من نهاية أنبوب. حماية الخلايا من الضوء بالتفاف الأنابيب في إحباط.
  14. الطرد المركزي خلايا في 160 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية ونضح المادة طافية وتغسل x 2 مع بيرم المثلج/يغسل المخزن المؤقت.
  15. أضف 1 مل من 1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني، وتنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية فورا.
    ملاحظة: تولد مبعثر الأمام مقابل جانب مبعثر مؤامرة لبوابة خلايا قابلة للتطبيق أولاً عند تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية. بدلاً من ذلك، استخدم وصمة خلية يعيش الميت متاحة تجارياً قبل تحديد الخلايا لتحديد لايف والخلية قتل السكان.

4-Immunostaining MEFs أعيدت برمجتها

  1. برمجة المتوسطة aspirate من يوم 14 ميفس والمياه والصرف الصحي (س 1) مع 1 مل 1 × برنامج تلفزيوني المثلج.
    ملاحظة: إيمونوستينينج، إعادة برمجة أجرى في 12 لوحات جيدا لتقليل كميات حل جسم. ويمكن أيضا استخدام 24 لوحات جيدا؛ مجرد نصف جميع وحدات التخزين التالية.
  2. نضح وإصلاح الخلايا مع 500 بارافورمالدهيد 2% ميليلتر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. نضح وغسل الخلايا 3 مرات مع مل 1 1 x برنامج تلفزيوني (5 دقيقة للمياه والصرف الصحي في درجة حرارة الغرفة).
  4. بيرميبيليزي الخلايا مع 500 ميليلتر 0.2% permeabilization الكاشف في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. نضح وكتلة في 500 ميليلتر 10% الحصان المصل في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. نضح واحتضان مع 500 ميليلتر من جسم الابتدائي المخفف ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: لهذا البروتوكول، الخلايا المسماة بالماوس "تروبونين تي" أو α-أكتينين (كل 1: 400) والمسمى يشترك مع كونيكسين 43 (1: 400) أو تروبونين (1: 400) أنا.
  7. نضح جسم الأولية وتغسل ثلاث مرات مع مل 1 1 x برنامج تلفزيوني (5 دقيقة للمياه والصرف الصحي في درجة حرارة الغرفة).
  8. نضح واحتضان مع 500 ميليلتر جسم الثانوي المخفف لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: لهذا البروتوكول، خلايا تم تسميته بالماوس المضادة 555 نانومتر الثانوي الأجسام المضادة (1:800) الاعتراف "تروبونين تي" أو α-أكتينين وارنب المضادة 488 نانومتر الثانوي الأجسام المضادة (1:800) الاعتراف كونيكسين 43 أو تروبونين أولاً بالإضافة إلى ذلك، كانت ملطخة نوى هويشت (01:10، 000). حماية الخلايا من الضوء التي تفرخ في الظلام.
  9. نضح جسم الثانوية وتغسل ثلاث مرات مع مل 1 1 x برنامج تلفزيوني (5 دقيقة للمياه والصرف الصحي في درجة حرارة الغرفة). التفاف اللوحة في إحباط لحماية الخلايا من الضوء وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  10. صورة باستخدام الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي ثلاث قنوات.

5-تصوير الكالسيوم

ملاحظة: إذا كان التصوير في 10 X التكبير، أطباق الثقافة الخلايا القياسية ولوحات تصلح لتصوير الكالسيوم. التصوير في أعلى التكبير يتطلب أن يكون مطلي بالخلايا في كوفيرسليبس الزجاج أو الزجاج أسفل الأطباق.

  1. نضح المتوسطة وإضافة 2 مل (للوحة 6 أيضا) تعديل الحل تيرودي (140 ملم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 1.8 مم كاكل2، 1 مم مجكل2، الجلوكوز 10 مم، 10 مم حبيس وجيش صرب البوسنة 0.1% 1% بيروفات، درجة الحموضة 7.4) التي تحتوي على 5 ميكرومتر وأنا Fura-2 و 0.1% F-127 بلورونيك للضرب (D14 t iCMs س D20). احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: حماية الخلايا من الضوء لمنع تبريد مؤشر الفلورسنت.
  2. تغسل الخلايا في حل 2 مل تيرودي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح الأسترة دي Fura-2 صباحا.
  3. صورة مع الغزل القرص المجهري [كنفوكل] في 340 نانومتر و 380 نانومتر باستخدام سليديبوك 5.5 Ca2 + برامج التصوير. القيام بالتصوير في درجة حرارة الغرفة.
  4. العابرين الكالسيوم يتم حسابها باستخدام نسبة كثافة fluorescence في 340 نانومتر على مدى شدة الأسفار في 380 نانومتر.
  5. إذا رغبت في ذلك، تعامل iCMs مع isoproterenol ميكرومتر 1 أو 2 أو 10 ميكرون النيفديبين للتلاعب بالكالسيوم المناولة بعد التصوير الأساس الكالسيوم العابرين. إضافة مركبات محلياً إلى الخلايا والصورة.

النتائج

استخدام استراتيجية إعادة برمجة المبينة أعلاه وفي الشكل 1 باء، أنشأنا iCMs مع حوالي 70% خلايا معربا عن القلب "تروبونين تي" وحوالي 55% من الخلايا معربا عن القلب α-أكتينين، كمياً بالتدفق الخلوي في يوم 9 بعد توصيل GHMT2m (الشكل 2 أ وب). بالإضافة ...

Discussion

تحدد هذه الدراسة استراتيجية ذات الكفاءة العالية لمباشرة إعادة برمجة الخلايا الليفية في iCMs الوظيفية عن طريق تسليم GHMT2m إعادة برمجة العوامل جنبا إلى جنب مع قمع برو تليفية مسارات الإشارات. استخدام التدفق الخلوي والتصوير إيمونوفلوريسسينت والكالسيوم التصوير، وضرب عدد خلايا، نعرض معظم الخلاي...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذا البحث كان تدعمها أموال من المؤسسة بوتشير وارنج ويب "الطبية الحيوية برنامج البحوث"، عالم جمعية القلب الأمريكية التنمية منحة (13SDG17400031)، جامعة كولورادو قسم الطب المهني المبكر المعلقة برنامج باحث، جامعة "كولورادو شعبة من أمراض القلب بارلو نيل" الهبات، والمعاهد الوطنية للصحة R01HL133230 (إلى كانساس). A.S.R أيده المعاهد الوطنية للصحة/نكتس كولورادو كتسا المنحة رقم TL1TR001081 وزمالة قبل دكتوراه من جامعة كولورادو الكونسورتيوم التليف البحوث والترجمة (كفريت). بتأييد هذه البحوث أيضا بمنحه دعم مركز السرطان (P30CA046934)، والمنحة النوى أبحاث أمراض الجلد (P30AR057212)، وجوهر التدفق الخلوي في حرم جامعة كولورادو انشوتز الطبية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6 MiceCharles River's Laboratory027For MEF isolation
Platinum E (PE) CellsCell Biolabs, INCRV-101For retrovirus production
DMEM High GlucoseGibcoSH30022.FSComponent of iCM, PE, and Growth media
Medium 199Life Technologies11150-059Component of iCM media
Fetal Bovine SerumGemini100106Component of iCM, PE, and Growth media
Donor Horse SerumGemini100508 500Component of iCM media
MEM Essential Amino Acids, 50XLife Technologies11130051Component of iCM media
Sodium Pyruvate Solution, 100XLife Technologies11360070Component of iCM media and for calcium imaging
MEM Non-Essential Amino Acids, 100XLife Technologies11140050Component of iCM media
MEM Vitamin Solution, 100XLife Technologies11120-052Component of iCM media
Insulin-Transferrin-SeleniumGibco41400045Component of iCM media
B27Gibco17504-044Component of iCM media
Penicilin-StreptomycinGibco15140-122Component of iCM, PE, and Growth media
GlutaMAX (L-Glutamine Supplement)Gibco35050-061Component of iCM, PE, and Growth media
Blasticidin-HClLife TechnologiesA11139-03Component of PE media
Puromycin dihydrochlorideLife TechnologiesA11138-03Component of PE media
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200-056For detaching cells from culture dishes
A-83-01R&D Systems - Tocris2939/10Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM
DMSOThermo Scientific85190For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium
SureCoatCellutronSC-9035For coating dishes to plate MEFs
FuGENE 6 Transfection ReagentPromegaE2692Transfection Reagent
Opti-MEM Reduced Serum MediaGibco11058-021Transfection Reagent
pBabe-X Myc-GATA4Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Hand2Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Mef2cPlasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Tbx5Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-1Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-133Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X GFPPlasmid containing reprogramming factor
Polybrene (Hexadimethrine bromide)SigmaH9268-5GFor viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL
Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores)Nalgene 569-0020 For filtering media
SyringesBd Vacutainer Labware 309654For viral filtration
0.45 µm FiltersCelltreat229749For viral filtration
70 µm cell strainersFalcon 352350For MEF isolation and Flow Cytometry
Cytofix/Cytoperm SolutionBD554722For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry
perm/wash buffer BD554723For washing cells for flow cytometry
DPBS 1XGibco14190-250For washing cells
Bovine Serum AlbuminVWR0332-100gFor flow cytometry and calcium imaging
Goat SerumSigma G9023For blocking cells for Flow Cytometry
Donkey SerumSigmaD9663-10mgFor blocking cells for Flow Cytometry
Mouse Troponin TThermo Scientificms-295-p1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Mouse α-actininSigmaA7811L1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Rabbit Connexin 43Sigma C62191:400 IF
Rabbit Troponin IPhosphoSolutions2010-TNI1:400 IF
HoechstLife Technologies622491:10000 IF
Alexa 488, rabbitLife TechnologiesA-110341:800 IF
Alexa 555, mouseLife TechnologiesA-214221:800 IF
Alexa 647, mouseLife TechnologiesA-315711:200 Flow Cytometry
27-color ZE5 Flow Cytometer Bio-RADFor FACS
ParaformaldehydesigmaP6148-500mgFor fixing cells for IF
Triton X-100PromegaH5142For permeabilization of cells for IF
EVOS™ FL Color Imaging SystemThermo ScientificAMEFC4300For IF
NaClRPIS23020-5000For calcium imaging
KClVWR395For calcium imaging
CaCl2FisherC614-500For calcium imaging
MgCl2VWR97061-352For calcium imaging
glucosesigmaG7528-250gFor calcium imaging
HEPESsigmaH4034-500gFor calcium imaging
Fura-2 AMLife TechnologiesF1221For calcium imaging
Fluronic F-127SigmaP2443-250gFor calcium imaging
NifedipineSigmaN7634-1GFor disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM
IsoproterenolsigmaI6504-1gFor increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM
Marianas Spinning Disk Confocal microscope3iFor calcium imaging
ethanolDecon Laboratories2801
bleachClorox
50 mL conical tubesGREINER BIO-ONE227261
15 mL conical tubesGREINER BIO-ONE188271
15 cm cell culture dishesFalcon353025
10 cm cell culture dishesFalcon353003
60 mm cell culture dishesGREINER BIO-ONE628160
6 well cell culture platesGREINER BIO-ONE657160 
12 well cell culture platesGREINER BIO-ONE665180 
24 well cell culture platesGREINER BIO-ONE662160 

References

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
  3. Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
  7. Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
  8. The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
  9. Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
  10. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
  11. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  12. Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
  13. Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
  14. Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
  15. Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
  16. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
  17. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  18. Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
  19. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  20. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  21. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
  23. Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
  24. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
  25. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  26. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
  27. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  28. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  29. Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
  30. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  31. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
  32. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
  33. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
  34. Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
  36. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
  37. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  38. Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
  39. Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
  40. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  41. Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136 1 TGF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved