JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים שיטה חזקה לתכנת fibroblasts עובריים הראשי לתוך cardiomyocytes פונקציונלי. דרך ביטוי של GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, מיר-1, ומיר-133 (GHMT2m) לצד עיכוב של TGF-β איתות. פרוטוקול שלנו יוצרת מכות cardiomyocytes מוקדם ככל 7 ימים שלאחר התמרה חושית עם עד 60% יעילות.

Abstract

טרנס-התמיינות של תאים סומטיים אחד סוג אחר יש פוטנציאל עצום דגם ולטפל מחלות אנושיות. מחקרים קודמים הראו את העכבר עובריים, עורי, וכן הלב fibroblasts שניתן לתכנת לתאים המושרה cardiomyocyte-כמו תפקודית (לעוצמה מלאה) דרך ביטוי של גורמי שעתוק קרדיוגני כולל GATA4, Hand2, Mef2c, ו Tbx5 גם במבחנה וגם בתוך vivo. עם זאת, מחקרים קודמים אלו הראו יעילות נמוכה יחסית. על מנת לשחזר את תפקוד הלב בעקבות פגיעה, מנגנונים המסדירים התכנות הלב חייב להיות הובהר כדי לשפר את היעילות ואת התבגרותם של לעוצמה מלאה.

אנחנו בעבר הראו כי עיכוב של pro-fibrotic איתות באופן דרמטי מגביר יעילות התיכנות. כאן, אנו מפרטים שיטות כדי להשיג יעילות התיכנות של עד 60%. יתר על כן, נתאר מספר שיטות כולל cytometry זרימה, הדמיה immunofluorescent של סידן הדמיה לכמת יעילות התיכנות, ההבשלה של fibroblasts מחדש. באמצעות פרוטוקול מפורט כאן, ניתן לבצעם מכניסטית מחקרים כדי לקבוע הרגולטורים חיוביים ושליליים של התכנות הלב. מחקרים אלה עשויים לזהות איתות המסלולים זה ניתן לפלח כדי לקדם את יעילות התיכנות, התבגרות, אשר יכול להוביל לטיפולים חדשניים תא לטיפול במחלות לב אנושי.

Introduction

מחלת לב איסכמית הוא הגורם המוביל המוות. ארצות הברית1. כ 800,000 אמריקנים ניסיון קודם או מדלקות אוטם שריר הלב (MI) לכל שנה1. בעקבות MI, מותו של cardiomyocytes (CMs) ואת הלב פיברוזיס, שהופקדו על ידי fibroblasts לב מופעל, לפגום הלב תפקוד2,3. ההתקדמות של אי ספיקת לב לאחר MI בלתי הפיך במידה רבה בשל יכולת ההתחדשות המסכן של CMs למבוגרים4,5 בזמן הנוכחי טיפולים קליניים להאט את התקדמות המחלה, להקטין את הסיכון של אירועי לב בעתיד6,7,8,9, טיפולים לא להפוך את התקדמות המחלה בשל אי להתחדש CMs שלאחר אוטם10. טיפולים חדשניים תא מתגלים לטיפול בחולים בעקבות חוקר אורח מאכזב, הראו ניסויים קליניים אספקת תאי גזע הלב בעקבות MI כה חד משמעיות regenerative פוטנציאלי11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.

הדור של האדם, נגזר המושרה גזע pluripotent (hiPSCs) מ fibroblasts על ידי ביטוי של ארבעה גורמי שעתוק, שהראו מאת טקהאשי & יאמאנקה, פתח את הדלת לפריצות חדש מתא טיפול19. תאים אלה יכולים להתמיין שלוש שכבות הנבט כל19ולאחר מספר שיטות יעילים ביותר ליצירת מספר גדול של CMs בעבר הוכחו20,21. HiPSC-derived CMs (ירכיים-CMs) מציע כלי עוצמתי ללמוד cardiomyogenesis ועל כן ייתכנו השלכות חשובות על תיקון הלב בעקבות פגיעה. עם זאת, ירכיים-CMs כעת להתמודד עם מכשולים translational בשל חששות של היווצרות טרטומה22, טבעם לא בוגר יכול להיות פרו-arrhythmogenic23. התכנות fibroblasts לתוך hiPSCs עוררה עניין ישירות התכנות fibroblasts לתוך סוגי תאים אחרים. . Ieda et al. הפגינו זה ביטוי של GATA4, Mef2c ו- Tbx5 (GMT) בתוצאות fibroblasts ב התכנות ישירה אל הלב, שושלת היוחסין, אם כי-יעילות נמוכה24. התכנות יעילות היה משופר עם התוספת של Hand2 (GHMT)25. מאז אלה מחקרים מוקדם, פרסומים רבים הראו כי שינוי קוקטייל גורם התיכנות עם שעתוק נוספים הגורמים26,27,28,29, כרומטין מכפילי30,31,32,מיקרו Rna33או מולקולות קטנות34 מוביל לשיפור התכנות יעילות ו/או ההבשלה של cardiomyocyte דמוי המושרה תאים (לעוצמה מלאה ).

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי ליצור לעוצמה מלאה מתוך העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) עם יעילות גבוהה. בעבר הראינו כי GHMT קוקטייל משתפרת בצורה משמעותית עם התוספת של מיר-1 ומיר-133 (GHMT2m), חל שיפור נוסף כאשר pro-fibrotic איתות המסלולים כולל הפיכת גורם הגדילה β (TGF-β) איתות או הקשורים רו פרוטאין קינאז (רוק) איתות המסלולים הם עכבות35. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מראים כי כ- 60% של תאים אקספרס טרופונין לב T (cTnT), כ- 50% אקספרס α-actinin, מספר גבוה של תאי מכות יכול להיות שנצפו מוקדם ככל 11 יום לאחר התמרה חושית של התכנות גורמים וטיפול עם TGF-β מסוג מעכבי הקולטן A-83-01. יתר על כן, אלה לעוצמה מלאה אקספרס gap junction חלבונים כולל connexin 43 ולהציג שנחשולי סידן להתכווצות ספונטנית. השתפרות ב התכנות יעילות לעומת מחקרים מוקדמים יותר מדגים את היכולת להתחדש CMs של אוכלוסיות תא אנדוגני תישאר הלב לאחר אוטם.

Protocol

כל הניסויים הדורשים חיות אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה בקמפוס UC דנבר Anschutz רפואית.

1. בידוד של MEFs

  1. לרכוש עכברים בהריון C57BL/6-E13. הספינה בין לילה.
  2. המתת חסד האמא לפי פרוטוקולים IACUC שאושרו (לשעבר: ~1.3 L/min CO2 להופעת חיה מתה ואחריו נקע בצוואר הרחם)
  3. לרסס את האמא עם 70% אתנול, פתיחת חלל הבטן. להסיר את הקרן רחמי המכיל עוברי ומניחים בצלחת 10 ס מ עם PBS סטרילי.
  4. לבצע חתך שק העובר לשחרר את העובר. להעביר את העובר כדי לנקות צלחת 10 ס מ עם PBS סטרילי. לשטוף היטב.
  5. לחתוך את הגוף מתחת הכבד ולמחוק את הראש ואת פלג הגוף העליון. להסיר את האיברים הפנימיים וזורקים. להעביר את הרקמה הנותרת מאכל נקי 10 ס מ עם PBS סטרילי ולהעביר לצלחת עם אבטחה ברמה 1 או 2 הקבינט. לשלב רקמות מן כל העוברים בקערה נקייה, יבשה 10 ס מ, מינצ לחתיכות משובחים.
  6. להוסיף 6 מ של 0.25% טריפסין/1 מ מ EDTA עוברי טחון. Triturate מספר פעמים על ידי פיפטה כדי לשבור את הרקמה. תקופת דגירה של 40 דקות ב- 37 הלעפה תרוטרפמט עם 5% CO2.
  7. Resuspend בתאים מדיום הגידול (טבלה 1). הנפח של מדיה מותאמת מבוסס על מספר העוברים שנקטפו. באופן כללי, השתמש יחס של 25 מ ל מדיה צמיחה לכל העוברים 1.2.
  8. צלחת 25 מ של תאים resuspended בקערה 15 ס מ. לאחר 24 שעות, תשאף התקשורת ולהוסיף 25 מ של מדיום הגידול טריים כל צלחת.
  9. לאחר 72 h, להוסיף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין/1 מ מ EDTA כל מנה 15 ס מ. כאשר תאים לנתק מן המנה תרבות, בטל טריפסין עם מדיום הגידול 15 מ"ל ולאסוף תאים צינורות חרוט פוליסטירן 50 מ. צנטריפוגה תאים עבור 3 דקות ב x 160 גרם בטמפרטורת החדר. Resuspend בגדר תא מדיום הגידול, לסנן דרך מסננת תא נקבובית 70 מיקרומטר.
  10. לספור תאים באמצעות hemocytometer ו MEFs ב 2 מיליון תאים aliquots ההקפאה בינוני (דימתיל סולפוקסיד 10%, 25% FBS של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) / גבוהה גלוקוז) ב- 80 ° C העברת תאים חנקן נוזלי לאחר 24 שעות ביממה וחנות עד מוכן לשימוש.
    הערה: ביטוי גנים העולמי ב MEFs היה פרופיל מבודדת באמצעות פרוטוקול זה על ידי RNA-רצף (RNA-seq) כדי להבטיח תא אימות. RNA-seq נתונים מתאי MEF לקודד הורדו מן Omnibus ביטוי גנים NIH (GEO) עם מספר גישה GSE93454. RNA-seq ג'ין ביטוי נתונים עבור MEFs המשמשים אותנו הופקדו ב NIH גיאוגרפי עם מספר גישה GSE71405. אלה שתי סדרות נתונים מוזגו על פי בסימנים ג'ין נפוצים. הנתונים ביטוי ואז יומן-נהפכו, scatterplot של הנתונים הביטוי שלנו MEFs, קדד MEFs היו שנוצר ובכושר עם קו רגרסיה ליניארית (איור 1 א'). MEFs מבודדים באמצעות פרוטוקול זה דומים מולקולרי לאלה מבודדת על ידי מעבדות נוספות.

2. ייצור של רטרווירוס התמרה חושית של MEFs

הערה: כל השלבים בסעיף זה צריך להתבצע בארון 2 רמת אבטחה. מאז פרוטוקול זה מנצל retroviral התמרה חושית, להבטיח את בטיחות זהירות נלקחים כולל טיפול שכל פסולת המכילה מדיה ויראלית עם מלבין 10% לפחות 20 דקות עיין כדי איור 1B עבור ציר זמן עבור התכנות.

  1. הייצור של רטרווירוס באמצעות שורת תאים פלטינה E (PE)
    1. לשמור על PE זמינים מסחרית, בתאים PE בינוני (טבלה 1) המכיל blasticidin ו- puromycin הבחירה סמנים כדי להבטיח ביטוי של מחסום פה- גניםpol ו env לייצור חלקיק retroviral יעיל36 . מעבר תאים ב- 1:4 או 1:5 כל יומיים. לטפל כדי למנוע צפיפות יתר של תאים כמו זה יכול להפחית ייצור retroviral התשואות.
    2. ביום-1, זרע כ 5 x 106 תאים לכל צלחת 10 ס מ במצע הגידול (טבלה 1) 16-20 h לפני תרביות תאים (ראו טבלה 2 יופיצ צפיפויות עבור אחרים הגדלים צלחת של תרבות תא סטנדרטי). רוק בעדינות מנות ואחורה מספר פעמים ומניחים בזהירות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 חממה כדי להבטיח אפילו ציפוי הפצה (ראה איור 1C צפיפות אופטימלית ציפוי לפני תרביות תאים).
      הערה: תשמרי על צלחת PE תאים המדיום ללא בחירה סמני לפני תרביות תאים כדי להבטיח בינוני המכיל חלקיקים retroviral שנוצר לא הרג את MEFs.
    3. ביום 0, היכונו DNA תרביות תאים. תרביות תאים צלחת 10 ס מ, להוסיף 2 µg של כל גורם התיכנות — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, מיר-1, ומיר-133 (GHMT2m) — כדי צינור 1.5 מ ל.
      הערה: עיין בטבלה 2 לשינוי גודל כמות הדנ א צריך transfect אחרים הגדלים צלחת של תרבות תא סטנדרטי.
    4. בשפופרת mL 1.5 נפרדים, להוסיף מדיה מופחת סרום µL 360. לאחר מכן להוסיף מגיב 36 של תרביות תאים µL ישירות למדיה מופחת סרום. בעדינות לסתור את הצינור, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
      הערה: כדי להימנע תקנים מופחתת יעילות, להוסיף בזהירות תרביות תאים ריאגנט ישירות למדיה מופחת סרום.
    5. להוסיף תערובת ריאגנט מדיה/תקנים מופחת סרום GHMT2m DNA קוקטייל. בעדינות לסתור את הצינור, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לא מערבולת.
    6. להוסיף את תערובת התגובה dropwise לתאים PE בעדינות מערבולת מדיה עבור s 10-15, מקום 37 ° C, 5% CO2 מיכלים.
      הערה: על פי היצרן, PE תאים ליצור עם כייל נוגדנים ממוצע של 106 עד 107 זיהומיות יחידות/מ"ל. פרוטוקול זה מייצר כ 2 x 106 זיהומים יחידות/mL מאת 24 h ו- 6 x 106 זיהומים יחידות/mL מאת h 48 בממוצע MOI של 4. תרביות תאים של GFP/DsRed עשוי גם לשמש פונדקאית ליעילות תרביות תאים/התמרה חושית במידת הצורך; תרביות תאים יעילות צפוי תעלה על 90% לפי 48 שעות (איור 1C).
  2. התמרה חושית של MEFs
    1. ביום 0, מעיל מנות עם קולגן, במקום 37 ° C, 5% CO2 מגשים כבר לפחות שעתיים.
    2. הסר MEFs חנקן נוזלי, הפשרה. צלחת 0.2 x 106 תאים לכל מאכל 60 מ מ במצע הגידול. בעדינות לוחות אבן כדי להבטיח אפילו ציפוי הפצה ומניחים בחממה (ראה איור 1C אופטימלית ציפוי צפיפות, בטבלה 2 עבור ציפוי צפיפויות עבור אחרים הגדלים צלחת של תרבות תא סטנדרטי).
      הערה: צפיפות ציפוי אלה נבדקו מעל במספר אצוות של MEFs מבודדים; אלא אם כן MEFs התצוגה בסכנה משמעותית הכדאיות, התאמת תא זריעה צפיפויות אינה הכרחית.
    3. ביום 1, 24 שעות לאחר תרביות תאים, השתמש מזרק 30 מ ל כדי לאסוף בינוני retroviral שנוצר על ידי תאים PE. עוברים המדיום 0.45 µm גודל הנקבוביות מסנן לתוך צינור חרוטי 50 מ. להוסיף hexadimethrine ברומיד תרביות תאים ריאגנט ריכוז סופי של 6 µg/mL. להוסיף בזהירות מדיום הגידול טריים 10 מ"ל לתאים PE על-ידי תקשורת pipetting על גבי הקיר של המנה תרבות כדי למנוע תזוזה של תאים.
    4. האחות האמצעי MEFs ולהוסיף 4 מיליליטר בינוני retroviral שנקטפו זה עתה כל מנה. לחזור MEFs החממה. להוסיף 10% מלבין כל החומרים בקשר עם המדיום ויראלית כדי לנטרל. את החלקיקים retroviral.
    5. יום 2, 48 שעות שלאחר תרביות תאים, חזור על שלבים 2.2.2, 2.2.3. PE תאים מתבטלים בעקבות אוסף המוזיאון 2nd של המדיום retroviral.
      הערה: להוסיף 10% מלבין לתאים PE שהושלכו לפחות 20 דקות לנטרל. את הרטרו וירוס לא רצויים.
    6. ביום 3, תשאף בינוני מ MEFs ו לחדש 4 מ"ל iCM בינונית (טבלה 1) המכילה 0.5 מיקרומטר A-83-01, TGF-β מסוג מעכבי הקולטן. לחדש iCM בינוני המכיל A-83-01 כל יומיים.
      הערה: אם משתמש GFP כפקד התמרה חושית, הביטוי צפוי תעלה על 90% ובשלב זה זמן (איור 1C).

3. דנ לסמני הלב

  1. וביופסיה בינוני 9 יום מחדש מסיר כתמים MEFs (1 x) עם 1 x PBS להסרת תאים מתים ופסולת.
  2. להוסיף 1 מ"ל 0.25% טריפסין/EDTA עבור 5 דקות הלעפה תרוטרפמט 37. לבדוק תאים באמצעות מיקרוסקופ אור, לנער מאכל; אם התאים יישארו מצורפים, דגירה 5 דקות יותר-הלעפה תרוטרפמט 37 עד ניתוק התאים.
  3. לשטוף את התאים ב- PBS 1 x המכילה 5% FBS וסינון דרך מסננת תא נקבובית 70 מיקרומטר.
  4. צנטריפוגה ב x 160 g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב נוזל מן בגדר.
    הערה: כדי להגדיל את התשואה תא, השאר µL כ-50 נוזל מעל בגדר התא.
  5. לשטוף תאים עם PBS 1 x 500 µL המכיל 1% BSA.
  6. לתקן תאים עם 0.2 מ ל/1 מיליון תאים קיבוע פתרון עבור 20 דקות על קרח.
  7. להוסיף 1 מ"ל 1 x פרם קפואים/שטיפת המאגר.
    הערה: הפתרון של היצרן הוא 10 x.
  8. צנטריפוגה תאים ב x 160 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, תשאף תגובת שיקוע.
  9. חזור על שלבים 3.7 ו- 3.8 שעה נוספת. אחרי כביסה 2nd , ישירות לשלב הבא או להשאיר תאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  10. לחסום עם 100 µL של סרום עיזים 5% ואת החמור סרום 1 x פרם/שטיפת מאגר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  11. להוסיף 100 µL של נוגדן ראשוני מדולל.
    הערה: עבור פרוטוקול זה, תאים עם תווית עם העכבר טרופונין T (1:200), העכבר α-actinin (1:200) לכמת את האחוז תאים חיובית עבור רכיבי מפתח של סרקומר הלב. דגירה נוגדן ראשוני לשעה בטמפרטורת החדר.
  12. צנטריפוגה תאים ב x 160 g עבור 5 מ'-4 ° C, תשאף תגובת שיקוע, לשטוף 2 x עם מאגר פרם קפואים/לשטוף.
  13. להוסיף 100 µL של נוגדנים משניים מדולל.
    הערה: עבור פרוטוקול זה, תאים הודבקו תוויות עם אנטי-העכבר 647 nm משני אינץ נוגדנים (1:200). נוגדנים משניים למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר-מסובב מעל קצה-שפופרת דגירה. להגן על תאים מפני האור על ידי ליפוף צינורות בנייר.
  14. צנטריפוגה תאים ב x 160 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, תשאף תגובת שיקוע, לשטוף 2 x עם מאגר פרם קפואים/לשטוף.
  15. להוסיף 1 מ"ל של BSA 1% ב- PBS ולבצע FACS מיד.
    הערה: ליצור לעומת פיזור קדמי צד פיזור מגרש לשער התאים קיימא ראשית בעת ביצוע FACS. לחלופין, השתמש כתם זמינים מסחרית תא חי/מת לפני תיקון התאים כדי לזהות חי מת תא אוכלוסיות.

4. Immunostaining של MEFs מחדש

  1. וביופסיה בינוני מיום 14 היו MEFs ושטוף (1 x) עם 1 מ ל 1 x PBS קר כקרח.
    הערה: עבור immunostaining, התכנות בוצעה ב 12 צלחות טוב כדי למזער את הנוגדן פתרון אחסון. 24 צלחות טוב עשוי גם לשמש; פשוט חצי כל בעקבות כרכים.
  2. האחות ותקן תאים עם 500 paraformaldehyde 2% µL 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. האחות ולשטוף תאים 3 פעמים עם PBS 1 x 1 מ"ל (5 דקות לכל כביסה בטמפרטורת החדר).
  4. Permeabilize תאים עם 500 µL 0.2% permeabilization מגיב ב- PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. האחות וחסום בנסיוב 500 µL 10% סוס ב- PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. האחות, דגירה עם 500 µL של נוגדן ראשוני מדולל לשעה בטמפרטורת החדר.
    הערה: עבור פרוטוקול זה, התאים היו עם העכבר טרופונין T או α-actinin (כל 1:400) תוויות ומוענקת משותפת Connexin 43 (1:400) או טרופונין אני (1:400).
  7. האחות הראשית נוגדן ולשטוף שלוש פעמים עם PBS 1 x 1 מ"ל (5 דקות לכל כביסה בטמפרטורת החדר).
  8. האחות, דגירה עם 500 µL נוגדנים משניים מדוללת למשך שעה בטמפרטורת החדר.
    הערה: עבור פרוטוקול זה, תאים עם תווית עם אנטי-העכבר 555 nm משני נוגדנים (1:800) כדי לזהות טרופונין T או α-actinin, אנטי-ארנב 488 ננומטר משני נוגדנים (1:800) לזהות Connexin 43 או טרופונין אני בנוסף, גרעינים היו מוכתמות Hoechst (1:10, 000). להגן על תאים מפני האור על ידי המקננת בחושך.
  9. תשאף הנוגדן משנית ותרחצי שלוש פעמים עם PBS 1 x 1 מ"ל (5 דקות לכל כביסה בטמפרטורת החדר). לעטוף את הצלחת בנייר כדי להגן על התאים מפני אור ולאחסן ב 4 º C.
  10. התמונה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence שלושה ערוצים.

5. סידן הדמיה

הערה: אם הדמיה בהגדלה X 10, תא סטנדרטי תרבות מנות וצלחות מתאימים עבור הדמיה סידן. הדמיה בהגדלה גבוהה דורש כי התאים להיות מצופה על coverslips זכוכית דקה או כלי הזכוכית התחתונה.

  1. תשאף בינונית ומוסיפים 2 מ"ל (עבור 6 טוב לוח) שונה פתרון של Tyrode (140 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 1.8 מ"מ CaCl2, 1 מ MgCl2, גלוקוז 10 מ מ, 10 מ מ HEPES, BSA 0.1%, 1% פירובט, pH 7.4) המכיל 5 מיקרומטר אני Fura-2 ו- 0.1% Pluronic F-127 להכות (D14 t o D20) לעוצמה מלאה. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: להגן על תאים מפני אור כדי למנוע שכבתה של מחוון פלורסנט.
  2. לשטוף את התאים בפתרון של 2 mL Tyrode למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר דה-esterification של Fura-2 בבוקר.
  3. התמונה עם ספינינג דיסק מיקרוסקופיה קונפוקלית-340 nm ו 380 nm באמצעות Slidebook 5.5 Ca2 + תוכנות ליצירת תמונות. ביצוע ההדמיה בטמפרטורת החדר.
  4. סידן שנחשולי מחושבים באמצעות היחס בין עוצמת קרינה פלואורסצנטית ב 340 nm מעל עוצמת קרינה פלואורסצנטית ב 380 nm.
  5. אם רצונך בכך, להתייחס לעוצמה מלאה עם isoproterenol מיקרומטר 1 או 2 או 10 מיקרומטר Nifedipine לתמרן סידן טיפול לאחר הדמיה שנחשולי סידן בסיסית. להוסיף תרכובות מקומית תאים ותמונה.

תוצאות

באמצעות האסטרטגיה התיכנות המתוארים לעיל, איור 1B, יצרנו לעוצמה מלאה עם-70% של תאים לבטא T טרופונין הלב, כ- 55% של תאים לבטא לב α-actinin, לכמת על ידי cytometry זרימה-יום 9 בעקבות התמרה חושית של GHMT2m (איור 2 א ו- B). בנוסף, הרוב המכריע של תאים אקספרס טי ...

Discussion

המחקר הנוכחי מתווה אסטרטגיה יעילות גבוהה לתכנת fibroblasts ישירות לתוך פונקציונלי לעוצמה מלאה באמצעות מסירת GHMT2m התכנות גורמים בשילוב עם דיכוי של pro-fibrotic איתות המסלולים. שימוש cytometry זרימה, הדמיה immunofluorescent, סידן הדמיה, ומכים תא ספירת, אנו מראים את רוב התאים ב פרוטוקול זה עוברים התכנות מוצלחת ולאמץ...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי קרנות מתוכנית של קרן Boettcher וארינג ווב ביו מחקר, מענק פיתוח מדען איגוד הלב האמריקאי (13SDG17400031), אוניברסיטת קולורדו מחלקת הרפואה בראשית הקריירה יוצאת מן הכלל תוכנית מלומד, אוניברסיטת קולורדו חלוקה של קרדיולוגיה בארלו Nyle הקדש, ואת NIH R01HL133230 (ל K.S). A.S.R נתמכה על ידי NIH/NCATS קולורדו CTSA גרנט מספר TL1TR001081, מלגת הדוקטורט מראש מן האיחוד אוניברסיטת קולורדו עבור מחקר פיברוזיס & תרגום (CFReT). מחקר זה גם נתמך על ידי המענק תמיכה מרכז הסרטן (P30CA046934), המענק ליבות (P30AR057212) לחקר מחלות העור, הליבה Cytometry זרימה בקמפוס אוניברסיטת קולורדו Anschutz רפואית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6 MiceCharles River's Laboratory027For MEF isolation
Platinum E (PE) CellsCell Biolabs, INCRV-101For retrovirus production
DMEM High GlucoseGibcoSH30022.FSComponent of iCM, PE, and Growth media
Medium 199Life Technologies11150-059Component of iCM media
Fetal Bovine SerumGemini100106Component of iCM, PE, and Growth media
Donor Horse SerumGemini100508 500Component of iCM media
MEM Essential Amino Acids, 50XLife Technologies11130051Component of iCM media
Sodium Pyruvate Solution, 100XLife Technologies11360070Component of iCM media and for calcium imaging
MEM Non-Essential Amino Acids, 100XLife Technologies11140050Component of iCM media
MEM Vitamin Solution, 100XLife Technologies11120-052Component of iCM media
Insulin-Transferrin-SeleniumGibco41400045Component of iCM media
B27Gibco17504-044Component of iCM media
Penicilin-StreptomycinGibco15140-122Component of iCM, PE, and Growth media
GlutaMAX (L-Glutamine Supplement)Gibco35050-061Component of iCM, PE, and Growth media
Blasticidin-HClLife TechnologiesA11139-03Component of PE media
Puromycin dihydrochlorideLife TechnologiesA11138-03Component of PE media
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200-056For detaching cells from culture dishes
A-83-01R&D Systems - Tocris2939/10Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM
DMSOThermo Scientific85190For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium
SureCoatCellutronSC-9035For coating dishes to plate MEFs
FuGENE 6 Transfection ReagentPromegaE2692Transfection Reagent
Opti-MEM Reduced Serum MediaGibco11058-021Transfection Reagent
pBabe-X Myc-GATA4Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Hand2Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Mef2cPlasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Tbx5Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-1Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-133Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X GFPPlasmid containing reprogramming factor
Polybrene (Hexadimethrine bromide)SigmaH9268-5GFor viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL
Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores)Nalgene 569-0020 For filtering media
SyringesBd Vacutainer Labware 309654For viral filtration
0.45 µm FiltersCelltreat229749For viral filtration
70 µm cell strainersFalcon 352350For MEF isolation and Flow Cytometry
Cytofix/Cytoperm SolutionBD554722For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry
perm/wash buffer BD554723For washing cells for flow cytometry
DPBS 1XGibco14190-250For washing cells
Bovine Serum AlbuminVWR0332-100gFor flow cytometry and calcium imaging
Goat SerumSigma G9023For blocking cells for Flow Cytometry
Donkey SerumSigmaD9663-10mgFor blocking cells for Flow Cytometry
Mouse Troponin TThermo Scientificms-295-p1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Mouse α-actininSigmaA7811L1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Rabbit Connexin 43Sigma C62191:400 IF
Rabbit Troponin IPhosphoSolutions2010-TNI1:400 IF
HoechstLife Technologies622491:10000 IF
Alexa 488, rabbitLife TechnologiesA-110341:800 IF
Alexa 555, mouseLife TechnologiesA-214221:800 IF
Alexa 647, mouseLife TechnologiesA-315711:200 Flow Cytometry
27-color ZE5 Flow Cytometer Bio-RADFor FACS
ParaformaldehydesigmaP6148-500mgFor fixing cells for IF
Triton X-100PromegaH5142For permeabilization of cells for IF
EVOS™ FL Color Imaging SystemThermo ScientificAMEFC4300For IF
NaClRPIS23020-5000For calcium imaging
KClVWR395For calcium imaging
CaCl2FisherC614-500For calcium imaging
MgCl2VWR97061-352For calcium imaging
glucosesigmaG7528-250gFor calcium imaging
HEPESsigmaH4034-500gFor calcium imaging
Fura-2 AMLife TechnologiesF1221For calcium imaging
Fluronic F-127SigmaP2443-250gFor calcium imaging
NifedipineSigmaN7634-1GFor disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM
IsoproterenolsigmaI6504-1gFor increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM
Marianas Spinning Disk Confocal microscope3iFor calcium imaging
ethanolDecon Laboratories2801
bleachClorox
50 mL conical tubesGREINER BIO-ONE227261
15 mL conical tubesGREINER BIO-ONE188271
15 cm cell culture dishesFalcon353025
10 cm cell culture dishesFalcon353003
60 mm cell culture dishesGREINER BIO-ONE628160
6 well cell culture platesGREINER BIO-ONE657160 
12 well cell culture platesGREINER BIO-ONE665180 
24 well cell culture platesGREINER BIO-ONE662160 

References

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
  3. Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
  7. Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
  8. The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
  9. Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
  10. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
  11. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  12. Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
  13. Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
  14. Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
  15. Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
  16. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
  17. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  18. Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
  19. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  20. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  21. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
  23. Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
  24. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
  25. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  26. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
  27. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  28. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  29. Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
  30. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  31. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
  32. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
  33. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
  34. Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
  36. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
  37. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  38. Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
  39. Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
  40. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  41. Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136Rnapro fibroticTGF 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved