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Resumen

Aquí presentamos un método robusto para reprogramar fibroblastos embrionarios primarios en cardiomiocitos funcionales a través de la sobreexpresión de GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 y miR-133 (GHMT2m) junto con la inhibición de la señalización de TGF-β. Nuestro protocolo genera cardiomiocitos paliza tan pronto como transducción después de 7 días con hasta un 60% eficiencia.

Resumen

Trans-diferenciación del tipo de una célula somática en otro tiene un enorme potencial para modelar y tratar enfermedades humanas. Estudios anteriores han demostrado que ratón embrionario, fibroblastos cutáneos y cardíacos pueden ser reprogramados en células similares de cardiomiocitos inducida funcionales (iCMs) a través de la sobreexpresión de factores de transcripción cardiogénico como GATA4, Hand2, Mef2c, y TBX5 in vitro e in vivo. Sin embargo, estos estudios previos han demostrado la eficacia relativamente baja. Para restablecer la función del corazón después de lesiones, mecanismos que regulan la reprogramación cardiaca deben ser aclados para aumentar la eficiencia y la maduración del iCMs.

Previamente demostramos que la inhibición de la señalización pro-fibróticos dramáticamente aumenta la eficiencia de reprogramación. Aquí, se detallan métodos para alcanzar una eficiencia de reprogramación de hasta un 60%. Además, se describen varios métodos incluyendo la citometría de flujo, imagen inmunofluorescente y proyección de imagen de calcio para cuantificar la eficiencia de reprogramación y la maduración de reprogramado fibroblastos. Utilizando el protocolo detallado aquí, pueden realizarse estudios mecanísticos para determinar los reguladores positivos y negativos de reprogramación cardiaca. Estos estudios pueden identificar vías de señalización que pueden ser dirigidas para promover la eficiencia de reprogramación y la maduración, que podría conducir a terapias celulares nuevos para el tratamiento de enfermedades del corazón humano.

Introducción

Cardiopatía isquémica es la principal causa de muerte en los Estados Unidos1. Aproximadamente 800.000 estadounidenses experimentan un primera o recurrente infarto de miocardio (IM) por año1. Después de MI, la muerte de los cardiomiocitos (CMs) y la fibrosis cardiaca, depositado por los fibroblastos cardiacos activados, afectar corazón función2,3. Progresión de la insuficiencia cardíaca después de MI es en gran medida irreversible debido a la pobre capacidad de regeneración de adultos CMs4,5. Mientras que los tratamientos clínicos actuales lenta progresión de la enfermedad y disminuyen el riesgo de eventos cardíacos futuros6,7,8,9, no hay terapias revertir la progresión de la enfermedad debido a la incapacidad de regenerar el CMs postinfarto10. Terapias celulares nuevos están emergiendo para tratar pacientes con mi desgracia, entrega de células madre al corazón después de MI hasta ahora los ensayos clínicos han demostrado concluyente regenerativo potencial11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.

La generación de células pluripotentes inducidas derivadas de humanos (hiPSCs) de fibroblastos por la sobreexpresión de cuatro factores de transcripción, demostrada por primera vez por Takahashi & Yamanaka, abrió la puerta a nuevos avances en la terapia de la célula19. Estas células pueden distinguir en tres capas germinales todos19y varios métodos eficientes para la generación de grandes cantidades de CMs han demostrado previamente20,21. Derivados de HiPSC CMs (CMs-cadera) ofrece una poderosa plataforma para estudiar cardiomyogenesis y puede tener implicaciones importantes para reparar el corazón después de lesión. Sin embargo, CMs de caderas enfrentan actualmente aplicadas vallas debido a las preocupaciones de teratoma formación22, y su naturaleza inmadura puede ser pro-arritmogénico23. Reprogramación de fibroblastos en hiPSCs despertó interés en directamente reprogramar fibroblastos en otros tipos celulares. Ieda et al demostraron que la sobreexpresión de Mef2c y GATA4 y Tbx5 (GMT) en los resultados de fibroblastos en reprogramación directa al linaje cardíaco, aunque a bajo rendimiento24. Eficiencia de reprogramación fue mejorada con la adición de Hand2 (GHMT)25. Desde estos primeros estudios, numerosas publicaciones han demostrado que alterando el reprogramación factor cóctel con transcripción adicional factores26,27,28,29, modificadores de la cromatina30,31, microRNAs32,33o34 conduce a mejorar las moléculas pequeñas reprogramación eficiencia y maduración de células cardiomiocito inducidas (iCMs ).

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para generar iCMs de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) con alta eficiencia. Demostramos previamente que la GHMT cóctel se mejoró significativamente con la adición de los miR 1 y miR-133 (GHMT2m) y es mejorado cuando pro-fibróticos como transformación de factor de crecimiento β (TGF-β) señalización de rutas de señalización o Rho-associated vías de señalización de la proteína quinasa (ROCK) son inhibidos35. Mediante este protocolo, nos muestran que aproximadamente el 60% de las células express troponina T cardiaca (cTnT), aproximadamente el 50% expresan α-actinina, y un alto número de células de golpeo puede observarse tan pronto como el día 11 después de transducción de reprogramación factores y tratamiento con el TGF-β del tipo I inhibidor del receptor de A-83-01. Además, estos iCMs expresar proteínas de ensambladura de gap incluyendo connexin 43 y exhiben oscilaciones de calcio y la contracción espontánea. Esta marcada mejora en la eficiencia en comparación con estudios anteriores de reprogramación demuestra el potencial para regenerar CMs de poblaciones celulares endógenos que permanecen en el postinfarto de corazón.

Protocolo

Todos los experimentos que requieren animales fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso en la UC Denver Anschutz Medical Campus.

1. aislamiento de MEFs

  1. Comprar ratones C57BL/6 embarazadas E13. Nave durante la noche.
  2. Eutanasia a la madre según protocolos aprobados de IACUC (ex: ~1.3 CO L/min2 hasta que el animal aparece muerto seguido por dislocación cervical)
  3. La madre del aerosol con etanol al 70% y abrir la cavidad abdominal. El cuerno uterino que contiene embriones de Quite y coloque en un plato de 10 cm con PBS estéril.
  4. Hacer una incisión en el saco del embrión para liberar el embrión. Transferencia de embrión para limpiar plato de 10 cm con PBS estéril. Enjuague bien.
  5. Cortar el cuerpo por debajo del hígado y descartar la cabeza y parte superior del cuerpo. Retirar vísceras y desechar. Transferir el tejido restante en un plato limpio 10 cm con PBS estéril y transferir la placa a un nivel de bioseguridad 1 o 2 del gabinete. Combinar los tejidos de todos los embriones en un recipiente limpio y seco de 10 cm y pique en trozos finos.
  6. Añadir 6 mL de 0.25% tripsina/1 mM EDTA a embriones picaditos. Triturate varias veces con la pipeta para romper el tejido. Incubar durante 40 min a 37 ° c con 5% CO2.
  7. Resuspender las células en un medio (tabla 1). El volumen de los medios de comunicación se ajusta en base al número de embriones que se cosechan. En general, utilizan una relación de medios de crecimiento de aproximadamente 25 mL por cada 1,2 embriones.
  8. 25 mL de células resuspendidas en un plato de 15 cm de la placa. Después de 24 h, Aspire los medios de comunicación y añadir 25 mL de medio de cultivo fresco a cada plato.
  9. Después de 72 h, añadir 2 mL de 0.25% tripsina/1 mM EDTA a cada plato de 15 cm. Cuando las células se separan de la placa de cultivo, inactivación de la tripsina con medio de cultivo de 15 mL y recoger las células en tubos cónicos de poliestireno de 50 mL. Centrifugar las células por 3 min a 160 x g a temperatura ambiente. Resuspender el precipitado de células en medio del crecimiento y el filtro a través de un tamiz de celular poro 70 μm.
  10. Contar las células usando un hemocitómetro y la congelación de MEFs en alícuotas de 2 millones de células en el medio de congelación (10% DMSO, 25% FBS en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) / alta glucosa) a-80 ° C. Transferir las células a nitrógeno líquido después de 24 horas y tienda hasta que esté listo para usar.
    Nota: Expresión génica Global en MEFs se perfila aislados usando este protocolo por secuenciación del RNA (RNA-seq) para asegurar la autenticación de la célula. Datos de RNA-seq de células MEF codifica se descargaron de NIH Gene expresión Omnibus (GEO) con número GSE93454. Datos de expresión genética RNA-seq para las MEFs utilizados por nosotros fueron depositados en NIH GEO con número GSE71405. Estos dos conjuntos de datos fueron combinados según símbolos comunes del gene. Los datos de la expresión entonces se ha transformado en registro y un diagrama de dispersión de los datos de expresión de nuestro MEFs y ENCODE MEFs generaron y en forma con una línea de regresión lineal (figura 1A). MEFs aislados usando este protocolo son molecularmente similares a los aislados por otros laboratorios.

2. producción de Retrovirus y transducción de MEFs

Nota: Todos los pasos de esta sección deben llevarse a cabo en un gabinete de bioseguridad nivel 2. Puesto que este protocolo utiliza transducción retroviral, seguridad se toman las precauciones, incluyendo tratamiento de residuos que contienen medios virales con 10% de lejía durante al menos 20 min ver figura 1B para una línea de tiempo de reprogramación.

  1. Producción de Retrovirus utilizando la línea celular de platino E (PE)
    1. Mantener disponibles comercialmente células PE PE medio (tabla 1) que contiene blasticidin y puromicina marcadores para expresión de gag-pol y env genes para la producción eficiente de partícula retroviral36 . Celdas de paso de 1:4 o 1:5 cada dos días. Tenga cuidado de evitar el hacinamiento de las células, esto puede reducir rendimientos retroviral.
    2. En el día -1, semilla de aproximadamente 5 x 106 células por plato 10 cm en el medio de crecimiento (tabla 1) 16-20 h antes de la transfección (ver tabla 2 para platear las densidades para otros tamaños de plato de cultura de célula estándar). Platos de rock suavemente hacia adelante y hacia atrás varias veces y cuidadosamente en a 37 ° C, 5% CO2 incubadora para asegurar incluso la distribución del revestimiento (ver figura 1 para la densidad de placas óptima antes de transfección).
      Nota: tenga cuidado a las células de PE de placa en el medio libre de marcadores de selección antes de transfección para medio que contiene partículas retrovirales generadas no mata MEFs.
    3. En el día 0, preparar DNA transfección. Para transfección de plato de 10 cm, añadir 2 μg de cada factor de reprogramación, GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 y miR-133 (GHMT2m) — a un tubo de 1,5 mL.
      Nota: Consulte la tabla 2 para ampliar la cantidad de ADN necesaria para transfectar otros tamaños de plato de cultura de célula estándar.
    4. En un tubo separado 1,5 mL, añadir 360 μl suero reducido los medios de comunicación. Luego agregue 36 μl de reactivo de transfección directamente en suero reducido los medios de comunicación. Suavemente el tubo de la película e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
      Nota: Para evitar la eficiencia de transfección reducido, agregue cuidadosamente reactivo de transfección directamente a los medios de comunicación de suero reducido.
    5. Añadir suero reducido los medios de comunicación de la transfección reactivo mezcla coctel de ADN de GHMT2m. Suavemente el tubo de la película e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. No no agitar con vortex.
    6. Añadir gota a gota la mezcla de reacción a las células PE, Remolino medios de 10-15 s suavemente y coloque en a 37 ° C, 5% CO2 incubadora.
      Nota: Según el fabricante, las células PE generan un título promedio de 106 a 10 unidades de infecciosas 7/mL. Este protocolo genera aproximadamente 2 x 106 infecciones unidades/mL por 24 h y 6 x 106 infecciones unidades/mL por 48 h para un promedio MOI de 4. Transfección de GFP/DsRed puede usarse como un sustituto para la eficiencia de la transducción de la transfección si así lo desea; eficiencia de la transfección se espera que supere el 90% por 48 h (figura 1).
  2. Transducción de MEFs
    1. En el día 0, la capa con colágeno y lugar a 37 ° C, 5% CO2 incubadora durante al menos 2 h.
    2. Retire la MEFs de deshielo y nitrógeno líquido. Células de6 placa de 0.2 x 10 por plato 60 mm en el medio de crecimiento. Suavemente rock placas para asegurar incluso la distribución de placas y colocar en la incubadora (ver figura 1 para la densidad de placas óptima y la tabla 2 para platear las densidades para otros tamaños de plato de cultura de célula estándar).
      Nota: Estas densidades de placas han sido probadas en múltiples lotes de MEFs aislados; a menos que la pantalla de MEFs significativamente había comprometido viabilidad, ajustando las densidades de siembra de la célula no es necesario.
    3. El día 1, transfección después de 24 h, utilice una jeringa de 30 mL para recoger retroviral medio generado por las células de la PE. Pasar el medio a través de un filtro de tamaño de poro 0.45 μm en un tubo cónico de 50 mL. Añadir el reactivo de transfección de bromuro de hexadimethrine a una concentración final de 6 μg/mL. Cuidadosamente añadir medio fresco 10 mL células PE por medios de pipeteado en la pared de la placa de cultivo para evitar desplazamiento de las células.
    4. Aspire el medio de MEFs y añadir 4 mL de medio de retroviral recién cosechado a cada plato. Vuelva MEFs a la incubadora. Añadir lejía 10% a todos los materiales en contacto con el medio viral para neutralizar partículas retrovirales.
    5. El día 2, transfección después de 48 h, repita los pasos 2.2.2 y 2.2.3. Las células PE se descartan después de la colección 2nd del medio retroviral.
      Nota: Agregue blanqueador 10% células de PE desechados por al menos 20 min neutralizar retrovirus no deseados.
    6. El día 3, aspirar el medio de MEFs y llenar con medio de iCM de 4 mL (tabla 1) que contiene 0,5 μm A-83-01, un TGF-β tipo I inhibidor del receptor. Reponer el iCM medio que contiene A-83-01 cada 2 días.
      Nota: Si utiliza GFP como un control de transducción de señales, la expresión se espera que supere el 90% por este punto del tiempo (figura 1).

3. citometría de flujo para marcadores cardiacos

  1. Medio de aspirado de día 9 reprogramado MEFs y lavado (1 x) con 1 x PBS para eliminar los residuos y células muertas.
  2. Añadir 1 mL 0.25% tripsina/EDTA por 5 min a 37 ° c. Compruebe las células mediante un microscopio de luz y agite el plato; Si las células permanecen conectadas, incubar 5 minutos más a 37 ° c hasta que se desprenda de las células.
  3. Lavar las células en PBS 1 x con un 5% FBS y filtro a través de un tamiz de celular poro 70 μm.
  4. Centrifugue a 160 x g durante 3 min a temperatura ambiente y el líquido aspirado de la pelotilla.
    Nota: Para aumentar el rendimiento de la célula, dejar líquido aproximadamente 50 μl sobre el precipitado de células.
  5. Lavar las células con 500 μL 1 x PBS con 1% de BSA.
  6. Fijar las células con 0,2 mL/1 millones de células solución de fijación por 20 min en hielo.
  7. Añadir 1 mL de tampón de lavado de ondulación permanente fría 1 x.
    Nota: La solución del fabricante es 10 x.
  8. Centrifugar las células a 160 x g durante 5 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante.
  9. Repita los pasos 3.7 y 3.8 un tiempo adicional. Después del lavado 2nd , vaya directamente al paso siguiente o mantener a las células a 4 ° C durante la noche.
  10. Block con 100 μl de suero de burro en el 1 x de tampón de perm/lavado durante 30 min a temperatura ambiente y 5% de suero de cabra.
  11. Añada 100 μl del anticuerpo primario diluido.
    Nota: Para este protocolo, las células fueron etiquetadas con ratón troponina T (1: 200) y ratón α-actinina (1: 200) para cuantificar el porcentaje de células positivas para los componentes claves de la sarcómera cardiaca. Incubar anticuerpo primario por 1 h a temperatura ambiente.
  12. Centrifugar las células a 160 x g por 5 m a 4 ° C, aspirar el sobrenadante y lavar x 2 con tampón de lavado de ondulación permanente fría.
  13. Añada 100 μl del anticuerpo secundario diluido.
    Nota: Para este protocolo, las células fueron etiquetadas con anti-ratón 647 nm de anticuerpo secundario (1: 200). Incubar anticuerpo secundario por 45 min a temperatura ambiente en un rotador de tubo de extremo a extremo. Proteger a las células de la luz envolviendo los tubos en papel de aluminio.
  14. Centrifugar las células a 160 x g durante 5 min a 4 ° C, aspirar el sobrenadante y lavar x 2 con tampón de lavado de ondulación permanente fría.
  15. Añadir 1 mL de 1% de BSA en PBS y realizar inmediatamente la FACS.
    Nota: Generar una dispersión hacia delante vs lado dispersión parcela a puerta primero células viables cuando realice FACS. Alternativamente, usar una mancha comercialmente disponibles celular vivo o muertos antes de la fijación de las células para identificar vivo y muerto de la célula las poblaciones.

4. el Immunostaining de MEFs reprogramadas

  1. Medio de aspirado desde el día 14 había reprogramado MEFs y lavado (1 x) con 1 mL 1 x PBS helado.
    Nota: Para la inmunotinción, reprogramación fue realizada en 12 placas bien para minimizar los volúmenes de solución de anticuerpo. también se pueden utilizar placas de 24 pozos; simplemente medio todo siguiendo volúmenes.
  2. Aspirar y fijar las células con paraformaldehido de 2% de 500 μl 10 min a temperatura ambiente.
  3. Aspirar y lavar las células 3 veces con 1 mL 1 x PBS (5 min por lavado a temperatura ambiente).
  4. Permeabilizar las células con 500 μl 0.2% permeabilización reactivo en PBS durante 15 min a temperatura ambiente.
  5. Aspire y bloquear en 500 μl 10% suero de caballo en PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
  6. Aspirar e incubar con 500 μl del anticuerpo primario diluido por 1 h a temperatura ambiente.
    Nota: Para este protocolo, células eran marcadas con ratón Troponin T o α-actinina (cada 1: 400) y co marcadas conexina 43 (1: 400) o la troponina I (1: 400).
  7. Anticuerpo primario de aspirar y lavar tres veces con 1 mL 1 x PBS (5 min por lavado a temperatura ambiente).
  8. Aspirar e incubar con el anticuerpo secundario diluido de 500 μl durante 1 hora a temperatura ambiente.
    Nota: Para este protocolo, las células fueron etiquetadas con anti-ratón 555 nm secundaria (1: 800) reconocer Troponin T o α-actinina y el anticuerpo anti-conejo 488 nm secundaria (1: 800) reconocer conexina 43 o troponina I. Adicionalmente, los núcleos fueron teñidos con Hoechst (1:10, 000). Proteger a las células de la luz por la incubación en la oscuridad.
  9. El anticuerpo secundario de aspirar y lavar tres veces con 1 mL 1 x PBS (5 min por lavado a temperatura ambiente). Envolver la placa en papel de aluminio para proteger las células de la luz y almacenar a 4 ° C.
  10. Imagen mediante microscopía de epifluorescencia de tres canales.

5. proyección de imagen de calcio

Nota: Si la proyección de imagen con 10 aumentos, platos y platos de la cultura de célula estándar son adecuados para la proyección de imagen de calcio. Imagen a mayor aumento requiere platear las células sobre cubreobjetos de cristal o vidrio platos de fondo.

  1. Aspire el medio y añadir 2 mL (para placa bien un 6) modificada solución de Tyrode (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, glucosa 10 mM, 10 mM HEPES, BSA 0.1% y 1% piruvato, pH 7.4) que contiene 5 μm estoy Fura-2 y 0,1% Pluronic F-127 a batir (D14 t o D20) iCMs. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C.
    Nota: Proteger las células de la luz para evitar el enfriamiento de indicador fluorescente.
  2. Lavar las células en solución de Tyrode 2 mL durante 30 min a temperatura ambiente para permitir que la esterificación de Fura-2 AM.
  3. Imagen con spinning microscopia confocal de disco a 340 nm y 380 nm utilizando Slidebook 5.5 Ca2 + software de imágenes. Realizar la proyección de imagen a temperatura ambiente.
  4. Oscilaciones de calcio se calculan utilizando la relación de intensidad de la fluorescencia a 340 nm sobre la intensidad de fluorescencia en 380 nm.
  5. Si lo desea, tratar iCMs con isoproterenol de 1 ó 2 μm o 10 μm nifedipina para manipular el manejo después de oscilaciones de calcio base la proyección de imagen del calcio. Añadir compuestos localmente a las células y la imagen.

Resultados

Usando la estrategia de reprogramación descrita anteriormente y en la figura 1B, generamos iCMs con aproximadamente 70% de las células cardiacas de troponina T y aproximadamente 55% de las células cardiaca α-actinina, cuantificado por citometría de flujo en el día 9 después de transducción de GHMT2m (figura 2A y B). Además, la mayoría de las células expresa cardiaca troponina T, troponina I y α-actini...

Discusión

El presente estudio esboza una estrategia de alta eficiencia para directamente reprogramar fibroblastos en iCMs funcional vía entrega de GHMT2m reprogramación factores combinados con la supresión de vías de señalización pro-fibróticos. Mediante citometría de flujo, la proyección de imagen inmunofluorescente, calcio imaging y superando a un recuento, nos muestran la mayoría de las células en este protocolo se someten a reprogramación exitosa y adoptar sino del linaje de CM. Previamente hemos demostrado que la ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por fondos de la Fundación Boettcher Webb Waring biomédica investigación programa, americano corazón Asociación científico desarrollo Grant (13SDG17400031), Departamento de la Universidad de Colorado de destacada carrera medicina Programa, de la Universidad de Colorado División de Cardiología Barlow Nyle dotación y R01HL133230 de NIH (a K.S). ASR fue apoyado por NIH/NCATS Colorado CTSA concesión número TL1TR001081 y una beca predoctoral del consorcio Universidad de Colorado para la investigación de la Fibrosis y traducción (CFReT). Esta investigación fue apoyada también por la concesión de apoyo Centro de cáncer (P30CA046934), beca de núcleos de investigación de enfermedades de piel (P30AR057212) y la base de Cytometry del flujo en el Universidad de Colorado Anschutz Medical Campus.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6 MiceCharles River's Laboratory027For MEF isolation
Platinum E (PE) CellsCell Biolabs, INCRV-101For retrovirus production
DMEM High GlucoseGibcoSH30022.FSComponent of iCM, PE, and Growth media
Medium 199Life Technologies11150-059Component of iCM media
Fetal Bovine SerumGemini100106Component of iCM, PE, and Growth media
Donor Horse SerumGemini100508 500Component of iCM media
MEM Essential Amino Acids, 50XLife Technologies11130051Component of iCM media
Sodium Pyruvate Solution, 100XLife Technologies11360070Component of iCM media and for calcium imaging
MEM Non-Essential Amino Acids, 100XLife Technologies11140050Component of iCM media
MEM Vitamin Solution, 100XLife Technologies11120-052Component of iCM media
Insulin-Transferrin-SeleniumGibco41400045Component of iCM media
B27Gibco17504-044Component of iCM media
Penicilin-StreptomycinGibco15140-122Component of iCM, PE, and Growth media
GlutaMAX (L-Glutamine Supplement)Gibco35050-061Component of iCM, PE, and Growth media
Blasticidin-HClLife TechnologiesA11139-03Component of PE media
Puromycin dihydrochlorideLife TechnologiesA11138-03Component of PE media
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200-056For detaching cells from culture dishes
A-83-01R&D Systems - Tocris2939/10Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM
DMSOThermo Scientific85190For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium
SureCoatCellutronSC-9035For coating dishes to plate MEFs
FuGENE 6 Transfection ReagentPromegaE2692Transfection Reagent
Opti-MEM Reduced Serum MediaGibco11058-021Transfection Reagent
pBabe-X Myc-GATA4Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Hand2Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Mef2cPlasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Tbx5Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-1Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-133Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X GFPPlasmid containing reprogramming factor
Polybrene (Hexadimethrine bromide)SigmaH9268-5GFor viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL
Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores)Nalgene 569-0020 For filtering media
SyringesBd Vacutainer Labware 309654For viral filtration
0.45 µm FiltersCelltreat229749For viral filtration
70 µm cell strainersFalcon 352350For MEF isolation and Flow Cytometry
Cytofix/Cytoperm SolutionBD554722For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry
perm/wash buffer BD554723For washing cells for flow cytometry
DPBS 1XGibco14190-250For washing cells
Bovine Serum AlbuminVWR0332-100gFor flow cytometry and calcium imaging
Goat SerumSigma G9023For blocking cells for Flow Cytometry
Donkey SerumSigmaD9663-10mgFor blocking cells for Flow Cytometry
Mouse Troponin TThermo Scientificms-295-p1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Mouse α-actininSigmaA7811L1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Rabbit Connexin 43Sigma C62191:400 IF
Rabbit Troponin IPhosphoSolutions2010-TNI1:400 IF
HoechstLife Technologies622491:10000 IF
Alexa 488, rabbitLife TechnologiesA-110341:800 IF
Alexa 555, mouseLife TechnologiesA-214221:800 IF
Alexa 647, mouseLife TechnologiesA-315711:200 Flow Cytometry
27-color ZE5 Flow Cytometer Bio-RADFor FACS
ParaformaldehydesigmaP6148-500mgFor fixing cells for IF
Triton X-100PromegaH5142For permeabilization of cells for IF
EVOS™ FL Color Imaging SystemThermo ScientificAMEFC4300For IF
NaClRPIS23020-5000For calcium imaging
KClVWR395For calcium imaging
CaCl2FisherC614-500For calcium imaging
MgCl2VWR97061-352For calcium imaging
glucosesigmaG7528-250gFor calcium imaging
HEPESsigmaH4034-500gFor calcium imaging
Fura-2 AMLife TechnologiesF1221For calcium imaging
Fluronic F-127SigmaP2443-250gFor calcium imaging
NifedipineSigmaN7634-1GFor disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM
IsoproterenolsigmaI6504-1gFor increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM
Marianas Spinning Disk Confocal microscope3iFor calcium imaging
ethanolDecon Laboratories2801
bleachClorox
50 mL conical tubesGREINER BIO-ONE227261
15 mL conical tubesGREINER BIO-ONE188271
15 cm cell culture dishesFalcon353025
10 cm cell culture dishesFalcon353003
60 mm cell culture dishesGREINER BIO-ONE628160
6 well cell culture platesGREINER BIO-ONE657160 
12 well cell culture platesGREINER BIO-ONE665180 
24 well cell culture platesGREINER BIO-ONE662160 

Referencias

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
  3. Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
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