JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada birincil embriyonik fibroblastlar içine fonksiyonel cardiomyocytes overexpression GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 ve miR-133, TGF-β sinyal inhibisyon yanında (GHMT2m) aracılığıyla yeniden programlamak için sağlam bir yöntem mevcut. Bizim iletişim kuralı dayak cardiomyocytes 7 gün sonrası iletim % 60 ile olduğu kadar erken oluşturur verimlilik.

Özet

Trans-bir somatik hücre türü başka bir farklılaşma modellemek ve insan hastalıkları tedavi etmek için büyük potansiyele sahiptir. Önceki çalışmalar göstermiştir bu fare embriyonik, dermal ve kardiyak fibroblastlar fonksiyonel indüklenen-cardiomyocyte-benzeri hücreler (ICMS) reprogrammed kardiyojenik transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere GATA4, Hand2, Mef2c, overexpression ve Tbx5 vitro ve içinde vivo. Ancak, bu önceki çalışmalar nispeten düşük verimlilik göstermiştir. Yaralanma aşağıdaki kalp işlevi geri yüklemek için kalp yeniden programlama yöneten mekanizmaları verimliliği ve olgunlaşma ICMS artırmak için aydınlatılmamıştır gerekir.

Biz daha önce büyük ölçüde pro-fibrotik sinyal inhibisyon programlama verimliliği artar gösterdi. Burada, biz % 60 kadar programlama verimliliğini elde etmek için yöntemleri ayrıntılı olarak. Ayrıca, akış sitometresi, immünfloresan görüntüleme ve kalsiyum görüntüleme programlama verimliliği ve programlanmış fibroblastlar olgunlaşma ölçmek için de dahil olmak üzere çeşitli yöntemler açıklanmaktadır. Burada ayrıntılı iletişim kuralını kullanarak, mekanik çalışmaları kalp yeniden programlama, pozitif ve negatif düzenleyiciler belirlemek için üstlenilen. Bu çalışmalar programlama verimliliği ve olgunlaşma, roman hücre tedavilere insan kalp hastalığı tedavi etmek için neden olabilir tanıtmak için hedef sinyal yolları tespit edebilir.

Giriş

İskemik kalp hastalığı, Amerika Birleşik Devletleri1ölüm önde gelen nedenidir. Yaklaşık 800.000 Amerikalılar bir ilk veya yineleyen miyokard infarktüsü (mı) başına yıl1deneyim. MI, ölüm cardiomyocytes (CMs) ve kardiyak fibrozis, aktif kardiyak fibroblastlar tarafından tevdi zarar kalp fonksiyonu2,3. Kalp yetmezliği MI takip ilerlemesini büyük ölçüde yetişkin CMs4,5zavallı yeniden üretim kapasitesi nedeniyle edilemez. Geçerli klinik Tedaviler hastalığın ilerlemesini yavaşlatmak ve gelecekteki kardiyak olaylar6,7,8,9tehlikesini azaltmak iken, hiçbir Tedaviler hastalığın ilerleme yetersizlik nedeniyle ters CMs sonrası infarktüsü10yeniden. Roman hücre tedavileri MI. Disappointingly takip hastaları tedavi etmek için ortaya çıkıyor, klinik kök hücre MI şu ana kadar takip kalp teslim sonuçsuz rejeneratif potansiyel11,12, göstermiştir 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.

İnsan kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSCs) fibroblastlar tarafından overexpression ilk Takahashi & Yamanaka, tarafından gösterilen dört transkripsiyon faktörlerin nesil hücre terapisi19' yeni buluşlar için kapıyı açtı. Bu hücreler tüm üç germ katmanları19ayırt edebilir ve daha önce20,21gösterilen CMs çok sayıda oluşturmak için çeşitli yüksek verimli Yöntemler. CMs (kalça-CMs) HiPSC elde edilen cardiomyogenesis çalışmak için güçlü bir platform sunmaktadır ve yaralanma aşağıdaki kalp onarmak için önemli etkileri olabilir. Ancak, kalça-CMs Şu anda translasyonel Engelli teratoma oluşumu22kaygılar nedeniyle yüz ve olgunlaşmamış doğaları pro-Aritmojenik23olabilir. Fibroblastlar hiPSCs yeniden şekillendirmek için doğrudan fibroblastlar diğer hücre türleri yeniden şekillendirmek için ilgi yol açtı. Ieda ve ark. düşük verimlilik24de olsa bu overexpression GATA4, Mef2c ve Tbx5 (GMT) doğrudan kalp soy, yeniden programlama içinde fibroblastlar sonuçlarında gösterdi. Verimliliği yeniden programlama Hand2 (GHMT)25eklenmesi ile geliştirildi. Beri erken bu çalışmalar, birçok yayın programlama faktörü kokteyl ek transkripsiyon ile değiştirme26,27,28,29faktörler göstermiştir, Kromatin değiştiriciler30,31, mikroRNA32,33veya34 geliştirilmiş yol açan küçük moleküller verimliliği ve/veya indüklenen cardiomyocyte benzeri hücreler (ICMS olgunlaşma yeniden programlama ).

Burada ICMS fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) ile yüksek verimlilik oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Biz daha önce kokteyl GHMT miR-1 ve miR-133 (GHMT2m) eklenmesi ile belirgin bir biçimde iyileştirilmiş ve daha fazla artırıldı pro-fibrotik büyüme faktörü β (TGF-β) sinyal dönüştürme de dahil olmak üzere yolları sinyal veya Rho ilişkili gösterdi Inhibe35protein kinaz (ROCK) sinyal yolları vardır. Bu iletişim kuralını kullanan, biz hücreleri yaklaşık % 60'ı kardiyak Troponin T (cTnT) hızlı, yaklaşık % 50 α-Aktinin hızlı ve dayak hücre sayısının yüksek olduğu gün 11 faktörler ve tedavi yeniden programlama, iletim takip erken görülebilir göstermek TGF-β ile ben reseptör inhibitörü A-83-01 yazın. Ayrıca, bu ICMS gap junction proteinler connexin 43 de dahil olmak üzere hızlı ve kendiliğinden kasılma ve kalsiyum geçişler sergilemek. Bu önceki çalışmalara göre verimliliği yeniden programlama düzelme işaretlenmiş CMs kalp sonrası infarktüsü kalır endojen hücre popülasyonlarının üzerinden yeniden oluşturmak için potansiyel gösteriyor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm deneylerin hayvanlar gerektiren kurumsal hayvan bakım ve UC Denver Anschutz tıbbi kampüs kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.

1. MEFs yalıtım

  1. C57BL/6 hamile fareler E13, Satın almak. Gecede gemi.
  2. Onaylı IACUC protokolleri göre anne ötenazi (ex: ~1.3 hayvan ölü görünene kadar L/dak CO2 izledi tarafından servikal çıkığı)
  3. Annesi % 70 etanol ile sprey ve karın boşluğu açın. Embriyo içeren rahim boynuz kaldırmak ve steril PBS ile 10 cm çanak yerleştirin.
  4. Bir kesik embriyo embriyo serbest bırakmak için sac içinde olun. Steril PBS ile 10 cm çanak temizlemek için embriyo transferi. İyice durulayın.
  5. Karaciğer aşağıda vücut ve kafa ve üst vücut atın. İç organları çıkarmak ve atın. Biyogüvenlik seviye 1 ya da 2 kabine plaka aktarmak ve kalan doku steril PBS ile temiz 10 cm çanak transfer. Temiz, Kuru 10 cm çanak tüm embriyoların dokulardan birleştirin ve ince parçalar halinde kıyma.
  6. 6 mL % 0.25 tripsin/1 mM EDTA kıyılmış embriyolar için ekleyin. Doku kırmaya pipet tarafından birkaç kez triturate. 40 dk az % 5 CO237 ˚C için kuluçkaya.
  7. Büyüme orta (Tablo 1) hücrelerde resuspend. Medya hacmi hasat embriyo sayısına göre ayarlanır. Genel olarak, yaklaşık 25 mL büyüme medya 1.2 embriyo başına oranında kullanılır.
  8. Plaka 15 cm çanak resuspended hücrelerinin 25 mL. 24 saat sonra medya Aspire edin ve 25 mL taze büyüme ortamının her plaka için ekleyin.
  9. 72 saat sonra 2 mL % 0.25 tripsin/1 mm EDTA her 15 cm çanak ekleyin. Hücre kültür çanak ayırdığınızda, tripsin 15 mL büyüme orta ile devre dışı bırakın ve 50 mL polistren konik tüpler hücrelerde toplamak. Hücreler için 160 x g oda sıcaklığında, 3 dk santrifüj kapasitesi. Hücre Pelet büyüme orta ve filtre 70 µm gözenek hücre süzgeç aracılığıyla resuspend.
  10. Saymak bir hemasitometre kullanarak hücreleri ve 2 milyon hücre aliquots donma orta MEFs dondurmak (% 10 DMSO, %25 FBS içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) / yüksek glikoz)-80 ° C'de Hücreler için sıvı azot transfer 24 h ve mağaza sonra kullanıma hazır kadar.
    Not: Bu iletişim kuralını kullanan RNA-sıralama tarafından izole MEFs küresel gen ifadesinde profilli (RNA-seq) hücre kimlik doğrulaması sağlamak için. MEF kodlamak hücrelerden RNA-seq veri NIH gen ifade Omnibus (GEO) katılım numarası GSE93454 ile indirilmiş. RNA-seq gen ifadesi verileri için bize tarafından kullanılan MEFs NIH GEO katılım numarası GSE71405 ile tevdi. Bu iki veri kümesi sık kullanılan gen simgeleri göre birleştirildi. İfade veri sonra günlük-dönüştürülmüş ve bizim MEFs ve kodla MEFs için ifade veri scatterplot oluşturulan ve bir doğrusal regresyon çizgisinin (Şekil 1A) ile uygun. Bu iletişim kuralını kullanan izole MEFs tatlı diğer labs tarafından izole benzer.

2. retrovirüsü ve MEFs iletim imalatı

Not: Bir Biyogüvenlik düzeyi 2 dolapta bu bölümdeki tüm adımlar yapılmalıdır. Bu iletişim kuralı retroviral iletim kullanır beri tüm için en az 20 dk. Şekil 1B bakın yeniden programlama için bir zaman çizelgesi için % 10 çamaşır suyu ile viral medya içeren atık tedavi de dahil olmak üzere önlemler alınır o güvenliğini sağlamak.

  1. Platin E (PE) hücre satırı kullanarak retrovirüsü imalatı
    1. Gag- ifade sağlamak için PE Orta (Tablo 1) içeren blasticidin ve puromisindir seçim işaretleri piyasada bulunan PE hücreleri korumak için verimli retroviral parçacık üretim36pol ve env gen . Her iki günde 1:4 ya da 1:5 geçiş hücreleri. Bu retroviral üretim verimleri azaltabilir gibi hücrelerinin aşırı kalabalık önlemek için dikkat ediniz.
    2. Gün -1, transfection önce yaklaşık 10 cm çanak büyüme orta (Tablo 1) 16-20 h başına 5 x 106 hücre tohum ( Tablo 2 yoğunluğu diğer standart hücre kültür çanak boyutları için kaplama için bakınız). Yavaşça ileri geri birkaç kez yemekleri rock ve dikkatle bir 37 ° C, % 5 CO2 kuluçka makinesi bile kaplama dağıtım sağlamak için yer ( Şekil 1 c en uygun kaplama yoğunluk transfection önce için bakınız).
      Not: plaka PE hücreleri Orta seçim işaretlerinin transfection oluşturulan retroviral parçacıkları içeren orta MEFs öldürmek değil emin olmak için önce ücretsiz için dikkat ediniz.
    3. Gün 0, DNA transfection için hazır olun. 10 cm çanak transfection için programlama her faktör 2 µg Ekle — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 ve miR-133 (GHMT2m) — bir 1,5 mL tüp için.
      Not: diğer standart hücre kültür çanak boyutları transfect için gereken DNA miktarını ölçmektir Tablo 2 için bakın.
    4. Bir ayrı 1,5 mL tüp içinde 360 µL düşük serum medya ekleyin. O zaman 36 µL transfection reaktif doğrudan düşük serum ortamına Ekle. Yavaşça tüp fiske ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
      Not: azaltılmış transfection verimliliği önlemek için dikkatli bir şekilde transfection reaktif doğrudan düşük serum medya ekleyin.
    5. İndirimli serum medya/transfection reaktif karışımı GHMT2m DNA kokteyl ekleyin. Yavaşça tüp fiske ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Değil girdap yapmak.
    6. Reaksiyon karışımı dropwise PE hücrelere ekleme, yavaşça medya için 10-15 s girdap ve bir 37 ° C, % 5 CO2 kuluçka yerleştirin.
      Not: üreticiye göre ortalama bir titresi 10 PE hücreler üretmek6 -107 bulaşıcı adet/mL. Bu iletişim kuralı yaklaşık 2 x 106 adet enfeksiyondan adet/mL 24 saat ve 6 x 106 adet enfeksiyondan birimleri/mL ortalama 4 MOI 48 h oluşturur. GFP/DsRed transfection, istenirse transfection/iletim verimliliği için bir vekil olarak da kullanılabilir; transfection verimliliği % 90 48 h (Şekil 1 c) aşması bekleniyor.
  2. MEFs iletim
    1. Gün 0, yemekleri kollajen ve yer bir 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka için en az 2 h ile kat.
    2. MEFs sıvı azot ve tezcan çıkarın. 60 mm çanak büyüme orta başına plaka 0.2 x 106 hücre. Yavaşça emin olmak için rock plakaları bile kaplama dağıtım ve yer da kuluçka makinesine ( Şekil 1 c en uygun kaplama yoğunluğu ve Tablo 2 için yoğunluğu diğer standart hücre kültür çanak boyutları için kaplama için bakınız).
      Not: Bu kaplama yoğunlukları izole MEFs birden çok toplu işlem üzerinde test edilmiştir; MEFs görüntü önemli ölçüde canlılık tehlikeye sürece hücre yoğunluğu tohum ayarlama gerekli değildir.
    3. 1 gün, 24 saat sonrası transfection, bir 30 mL şırınga retroviral orta PE hücreleri tarafından oluşturulan toplamak için kullanın. Orta 50 mL konik tüp içine 0,45 µm gözenek boyutu filtreden geçmek. Hexadimethrine bromür transfection reaktif 6 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Dikkatle 10 mL taze büyüme orta duvar deplasman hücre önlemek için kültür yemeğin üzerine pipetting medya tarafından PE hücrelere ekleme.
    4. MEFs ortamından Aspire edin ve 4 mL taze hasat retroviral orta her yemek için ekleyin. MEFs Kuluçka Gelişim makinesi için dönmek. Retroviral parçacıklar nötrleştirmek için viral orta temas tüm malzemeler için % 10 çamaşır suyu ekleyin.
    5. Günde 2, 48 saat sonrası transfection, 2.2.2 ve 2.2.3 adımları yineleyin. PE hücreleri retroviral Orta 2nd topluluğu takip atılır.
      Not: atılan PE hücreler için istenmeyen retrovirüsü nötralize etmek en az 20 dk % 10 çamaşır suyu ekleyin.
    6. Gün 3, orta MEFs gelen Aspire edin ve doldurmak 0.5 µM içeren 4 mL ICM ile orta (Tablo 1) A-83-01, TGF-β tip ı reseptör inhibitörü. A-83-01 2 günde içeren ICM orta doldurmak.
      Not: GFP iletim denetimi olarak kullanılıyorsa, ifade % 90'ı aşan bu zaman noktası (Şekil 1 c) tarafından bekleniyor.

3. akış sitometresi kalp işaretleri

  1. Aspiratı orta gün 9 MEFs ve yıkama (1 x) 1 x PBS ile ölü hücreleri ve enkaz kaldırmak için programladım.
  2. 1 mL % 0.25 tripsin/EDTA 5 min için 37 ˚C ekleyin. Hafif bir mikroskop kullanarak hücreleri denetleyin ve çanak sallamak; hücreleri bağlı kalırsa, hücreleri ayırmak kadar 5 daha fazla dk 37 ˚C az kuluçkaya.
  3. 1 x PBS %5 FBS ve filtre 70 µm gözenek hücre süzgeç aracılığıyla içeren hücrelerde yıkayın.
  4. 160 x g 3 dakika oda sıcaklığında ve Pelet aspiratı sıvı, santrifüj kapasitesi.
    Not: hücre verim artışı yaklaşık 50 µL sıvı hücre Pelet yukarıda bırakın.
  5. Hücreleri % 1 BSA içeren 500 µL 1 x PBS ile yıkayın.
  6. 0.2 mL/1 milyon hücrelerle hücreler fiksasyon çözüm 20 dk için buza düzeltmek.
  7. 1 mL 1 x buz gibi perma/yıkama arabellek ekleyin.
    Not: Üreticinin 10 x çözümdür.
  8. Hücreleri, 160 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.
  9. Ek bir süre 3,7 ve 3,8 adımları yineleyin. 2nd yıkama sonra doğrudan bir sonraki adıma geçin veya gecede 4 ° C'de hücreler tutmak.
  10. 100 µL % 5 keçi serum ve eşek serum perma/yıkama arabellek, oda sıcaklığında 30 dakika x 1 ile engelleyin.
  11. Seyreltilmiş birincil antikor 100 µL ekleyin.
    Not: Bu iletişim kuralı için fare ile Troponin T (1: 200) hücreleri etiketli ve kardiyak sarcomere temel bileşenleri için olumlu fare α-yüzdesini ölçmek için Aktinin (1: 200) hücreleri. Oda sıcaklığında 1 h için birincil antikor kuluçkaya.
  12. 160 x g 4 ° C'de 5 m için hücreleri santrifüj kapasitesi, süpernatant Aspire edin ve 2 x buz gibi perma/yıkama arabellek ile yıkayın.
  13. Seyreltilmiş ikincil antikor 100 µL ekleyin.
    Not: Bu iletişim kuralı için anti-fare 647 nm ikincil antikor ile (1: 200) hücreleri etiketli. Üzerinde bir sıra üzerinde tüp rotator oda sıcaklığında 45 dk için ikincil antikor kuluçkaya. Hücreleri ışıktan tüpler folyo sarma tarafından korumak.
  14. Hücreleri, 160 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi, süpernatant Aspire edin ve 2 x buz gibi perma/yıkama arabellek ile yıkayın.
  15. 1 mL %1 BSA PBS içinde ekleyin ve FACS hemen gerçekleştirin.
    Not: hücrelerin ilk FACS gerçekleştirirken kapı için ileri dağılım vs yan dağılım çizim oluşturur. Alternatif olarak, hücre sabitleme önce piyasada bulunan canlı/ölü hücre leke canlı tanımlamak ve ölü hücre nüfus için kullanın.

4. programlanmış MEFs Immunostaining

  1. Gün 14 aspiratı ortamından MEFs ve yıkama (1 x) ile 1 mL 1 x buz gibi PBS programladım.
    Not: immunostaining için yeniden programlama antikor çözüm birimleri en aza indirmek için 12 iyi levha gerçekleştirildi. 24 iyi tabaklar da kullanılabilir; sadece yarısı tüm birimleri takip.
  2. Aspire hücreleri ile ve 500 µL % 2 paraformaldehyde oda sıcaklığında 10 dakika için düzeltin.
  3. Aspire edin ve hücreleri 3 kez 1 mL 1 x PBS (yıkama, oda sıcaklığında başına 5 dk) ile yıkayın.
  4. Hücreleri 500 µL % 0,2 permeabilization reaktif PBS içinde oda sıcaklığında 15 dakika ile permeabilize.
  5. Aspire edin ve serumda 500 µL % 10 at PBS içinde oda sıcaklığında 30 dk için blok.
  6. Aspire edin ve oda sıcaklığında 1 h için seyreltilmiş birincil antikor 500 µL ile kuluçkaya.
    Not: Bu iletişim kuralı için hücreleri fare Troponin T veya α-Aktinin (her 1: 400) ile etiketli ve ben (1: 400) Co etiketli Connexin 43 (1: 400) ya da Troponin ile.
  7. Birincil antikor Aspire edin ve 1 mL 1 x PBS (yıkama, oda sıcaklığında başına 5 dk) ile üç kez yıkayın.
  8. Aspire edin ve oda sıcaklığında 1 saat 500 µL seyreltilmiş ikincil antikor kuluçkaya.
    Not: Troponin T veya α-Aktinin tanımak için anti-fare 555 nm ikincil antikor (1:800) ve Connexin 43 ya da Troponin ı. Ayrıca tanımak için anti-tavşan 488 nm ikincil antikor (1:800) ile hücreleri bu iletişim kuralı için etiketli, çekirdekleri ile lekeli Höchst (1:10, 000). Hücreleri ışık karanlıkta kuluçka tarafından korumak.
  9. İkincil antikor Aspire edin ve 1 mL 1 x PBS (yıkama, oda sıcaklığında başına 5 dk) ile üç kez yıkayın. Plaka folyo ışıktan hücreleri korumak ve 4 ° C'de depolamak için şal
  10. Üç kanallı epifluorescence mikroskobu kullanarak görüntü.

5. kalsiyum görüntüleme

Not: 10 X büyütme oranında Imaging, standart hücre kültür yemekleri ve plakaları kalsiyum görüntüleme için uygundur. Görüntüleme yüksek büyütmede hücreleri cam coverslips ya da cam alt yemekleri üzerinde kaplama gerekir.

  1. Orta Aspire edin ve 2 mL (6 de plaka için) değişiklik Tyrode'nın çözüm (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glikoz, 10 mM HEPES, % 0,1 BSA ve % 1 pyruvate, pH 7,4) eklemek 5 mikron içeren AM Fura-2 ve % 0,1 Pluronic (D14 t dayak için F-127 o D20) ICMS. 37 ° C'de 30 dakika kuluçkaya
    Not: hücreleri floresan göstergesi Şoklama önlemek için ışıktan korumak.
  2. Hücreler 2 mL Tyrode'nın çözüm Fura-2 de-esterleşme izin vermek için oda sıcaklığında 30 dakika içinde yıkayın AM.
  3. Disk confocal mikroskobu, 340 iplik ile görüntünün nm ve 380 nm düşsel bilgisayar yazılımı Slidebook 5.5 Ca2 + kullanarak. Oda sıcaklığında görüntüleme gerçekleştirmek.
  4. Kalsiyum geçişler 340 floresan yoğunluğu oranı kullanılarak hesaplanır nm 380 floresans yoğunlukta üzerinde nm.
  5. İstenirse, ICMS 1 veya 2 µM isoproterenol veya 10 µM ile tedavi nifedipin temel kalsiyum geçişler görüntüleme sonra işleme kalsiyum işlemek için. Bileşenleri yerel olarak hücreleri ve görüntü ekleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yukarıda ve Şekil 1Bözetlenen programlama stratejisi kullanarak, biz ICMS yaklaşık %70 kardiyak Troponin T ifade hücre ve kardiyak α-Aktinin, akış sitometresi gün 9 tarafından sayısal ifade hücreleri yaklaşık % 55'i ile oluşturulan GHMT2m iletim takip (Şekil 2A ve B). Ayrıca, Hızlı hücre çoğunluğu kardiyak Troponin T, Troponin ı ve kardiyak α-Aktinin yanı sıra gün 14 iletim (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu da çalışmanın doğrudan fibroblastlar teslim GHMT2m pro-fibrotik sinyal yolları bastırılması ile kombine faktörlerin yeniden programlama yoluyla fonksiyonel ICMS içine yeniden programlamak için yüksek verimli strateji özetliyor. Kullanarak akış sitometresi, immünfloresan görüntüleme, görüntüleme ve hücre sayımları, bu protokol için hücreleri çoğunluğu gösterdiğimiz yenerek kalsiyum başarılı yeniden programlama gösterip CM lineage kader. Biz daha önce anti-fibrotik ek maddeler ve bi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu araştırma fonları programdan Boettcher Vakfı'nın Webb Waring Biyomedikal araştırma, Amerikan Kalp Derneği Bilim adamı kalkınma hibe (13SDG17400031), Colorado Üniversitesi Tıp üstün erken kariyer bölümü tarafından desteklenen Akademik Program, University of Colorado bölümü Kardiyoloji Barlow Nyle bağış ve NIH R01HL133230 (KS için). Fibrozis araştırma ve çeviri (CFReT) için A.S.R NIH/NCATS Colorado CTSA Grant numarası TL1TR001081 ve Colorado Üniversitesi Konsorsiyumu bir önceden Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma da kanser merkezi destek Grant (P30CA046934), cilt hastalıkları araştırma çekirdek Grant (P30AR057212) ve akış sitometresi özünde Colorado Üniversitesi Anschutz tıbbi kampüs tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6 MiceCharles River's Laboratory027For MEF isolation
Platinum E (PE) CellsCell Biolabs, INCRV-101For retrovirus production
DMEM High GlucoseGibcoSH30022.FSComponent of iCM, PE, and Growth media
Medium 199Life Technologies11150-059Component of iCM media
Fetal Bovine SerumGemini100106Component of iCM, PE, and Growth media
Donor Horse SerumGemini100508 500Component of iCM media
MEM Essential Amino Acids, 50XLife Technologies11130051Component of iCM media
Sodium Pyruvate Solution, 100XLife Technologies11360070Component of iCM media and for calcium imaging
MEM Non-Essential Amino Acids, 100XLife Technologies11140050Component of iCM media
MEM Vitamin Solution, 100XLife Technologies11120-052Component of iCM media
Insulin-Transferrin-SeleniumGibco41400045Component of iCM media
B27Gibco17504-044Component of iCM media
Penicilin-StreptomycinGibco15140-122Component of iCM, PE, and Growth media
GlutaMAX (L-Glutamine Supplement)Gibco35050-061Component of iCM, PE, and Growth media
Blasticidin-HClLife TechnologiesA11139-03Component of PE media
Puromycin dihydrochlorideLife TechnologiesA11138-03Component of PE media
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200-056For detaching cells from culture dishes
A-83-01R&D Systems - Tocris2939/10Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM
DMSOThermo Scientific85190For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium
SureCoatCellutronSC-9035For coating dishes to plate MEFs
FuGENE 6 Transfection ReagentPromegaE2692Transfection Reagent
Opti-MEM Reduced Serum MediaGibco11058-021Transfection Reagent
pBabe-X Myc-GATA4Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Hand2Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Mef2cPlasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Tbx5Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-1Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-133Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X GFPPlasmid containing reprogramming factor
Polybrene (Hexadimethrine bromide)SigmaH9268-5GFor viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL
Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores)Nalgene 569-0020 For filtering media
SyringesBd Vacutainer Labware 309654For viral filtration
0.45 µm FiltersCelltreat229749For viral filtration
70 µm cell strainersFalcon 352350For MEF isolation and Flow Cytometry
Cytofix/Cytoperm SolutionBD554722For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry
perm/wash buffer BD554723For washing cells for flow cytometry
DPBS 1XGibco14190-250For washing cells
Bovine Serum AlbuminVWR0332-100gFor flow cytometry and calcium imaging
Goat SerumSigma G9023For blocking cells for Flow Cytometry
Donkey SerumSigmaD9663-10mgFor blocking cells for Flow Cytometry
Mouse Troponin TThermo Scientificms-295-p1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Mouse α-actininSigmaA7811L1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Rabbit Connexin 43Sigma C62191:400 IF
Rabbit Troponin IPhosphoSolutions2010-TNI1:400 IF
HoechstLife Technologies622491:10000 IF
Alexa 488, rabbitLife TechnologiesA-110341:800 IF
Alexa 555, mouseLife TechnologiesA-214221:800 IF
Alexa 647, mouseLife TechnologiesA-315711:200 Flow Cytometry
27-color ZE5 Flow Cytometer Bio-RADFor FACS
ParaformaldehydesigmaP6148-500mgFor fixing cells for IF
Triton X-100PromegaH5142For permeabilization of cells for IF
EVOS™ FL Color Imaging SystemThermo ScientificAMEFC4300For IF
NaClRPIS23020-5000For calcium imaging
KClVWR395For calcium imaging
CaCl2FisherC614-500For calcium imaging
MgCl2VWR97061-352For calcium imaging
glucosesigmaG7528-250gFor calcium imaging
HEPESsigmaH4034-500gFor calcium imaging
Fura-2 AMLife TechnologiesF1221For calcium imaging
Fluronic F-127SigmaP2443-250gFor calcium imaging
NifedipineSigmaN7634-1GFor disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM
IsoproterenolsigmaI6504-1gFor increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM
Marianas Spinning Disk Confocal microscope3iFor calcium imaging
ethanolDecon Laboratories2801
bleachClorox
50 mL conical tubesGREINER BIO-ONE227261
15 mL conical tubesGREINER BIO-ONE188271
15 cm cell culture dishesFalcon353025
10 cm cell culture dishesFalcon353003
60 mm cell culture dishesGREINER BIO-ONE628160
6 well cell culture platesGREINER BIO-ONE657160 
12 well cell culture platesGREINER BIO-ONE665180 
24 well cell culture platesGREINER BIO-ONE662160 

Referanslar

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
  3. Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
  7. Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
  8. The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
  9. Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
  10. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
  11. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  12. Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
  13. Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
  14. Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
  15. Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
  16. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
  17. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  18. Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
  19. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  20. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  21. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
  23. Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
  24. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
  25. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  26. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
  27. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  28. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  29. Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678(2014).
  30. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  31. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577(2013).
  32. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
  33. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
  34. Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
  36. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
  37. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  38. Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
  39. Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
  40. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  41. Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im biyolojisisay 136kalptranskripsiyon fakt rleriyeniden programlama mikroRNApro fibrotik sinyalbile ikTGF resept r 1 inhibit r

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır