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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui presentiamo un metodo affidabile per riprogrammare i fibroblasti embrionali primari in cardiomiociti funzionali tramite sovraespressione di GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) al fianco di inibizione di segnalazione di TGF-β. Il nostro protocollo genera pestaggio cardiomyocytes fin dal post-traduzionali di 7 giorni con fino a 60% efficienza.

Abstract

Trans-differenziazione di cellule somatiche un tipo in un altro ha un enorme potenziale per modellare e trattare malattie umane. Studi precedenti hanno dimostrato che il mouse embrionali, fibroblasti cutanei e cardiaci possono essere riprogrammati in funzionale indotta-cardiomyocyte-come le cellule (iCMs) tramite sovraespressione di fattori di trascrizione cardiogeno compreso GATA4, Hand2, Mef2c, e TBX5 sia in vitro che in vivo. Tuttavia, questi studi precedenti hanno dimostrato relativamente bassa efficienza. Al fine di ripristinare la funzione del cuore dopo la lesione, meccanismi che governano la riprogrammazione cardiaco devono essere delucidate per aumentare l'efficienza e la maturazione degli iCMs.

Precedentemente abbiamo dimostrato che l'inibizione di segnalazione pro-fibrotici drammaticamente aumenta l'efficienza di riprogrammazione. Qui, abbiamo dettaglio metodi a raggiungere un'efficienza riprogramma fino al 60%. Inoltre, si descrivono diversi metodi tra cui citometria a flusso, formazione immagine immunofluorescente e calcio imaging per quantificare la riprogrammazione l'efficienza e la maturazione dei fibroblasti riprogrammati. Utilizzando il protocollo dettagliato qui, studi meccanicistici possono essere intrapreso per determinare regolatori positivi e negativi della riprogrammazione cardiaco. Questi studi possono identificare vie di segnalazione che possono essere mirate per promuovere l'efficienza riprogrammante e maturazione, che potrebbe portare a cell novel terapie per trattare la malattia di cuore umana.

Introduzione

Cardiopatia ischemica è una causa principale di morte negli Stati Uniti1. Circa 800.000 americani esperienza un primo o ricorrente infarto miocardico (MI) per ogni anno1. In seguito MI, la morte dei cardiomiociti (CMs) e fibrosi cardiaca, depositati dai fibroblasti cardiaci attivati, compromettere cuore funzione2,3. Progressione dell'insufficienza cardiaca dopo MI è in gran parte irreversibile a causa la scarsa capacità rigenerativa di adulto CMs4,5. Mentre le terapie cliniche correnti rallentano la progressione di malattia e fare diminuire il rischio di eventi cardiaci futuri6,7,8,9, terapie non invertire la progressione della malattia dovuto l'incapacità di rigenerare il CMs post-infarto10. Terapie cellulari romanzo stanno emergendo per trattare pazienti che seguono MI. sembrto, sperimentazioni cliniche fornire cellule staminali nel cuore seguito finora MI hanno dimostrato inconcludente rigenerativa potenziali11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.

La generazione di cellule staminali pluripotenti indotte umano-derivato (hiPSCs) dai fibroblasti da sovraespressione di quattro fattori di trascrizione, in primo luogo ha dimostrato di Takahashi & Yamanaka, ha aperto la porta a nuovi progressi nella cella terapia19. Queste cellule possono differenziarsi in tutti i tre strati germinativi19, e diversi metodi altamente efficienti per la generazione di un numero elevato di CMs sono stati indicati in precedenza20,21. CMs HiPSC-derivato (fianchi-CMs) offre una potente piattaforma per lo studio cardiomiogenesi e può avere implicazioni importanti per la riparazione del cuore dopo la lesione. Tuttavia, fianchi-CMs attualmente affrontare ostacoli traslazionali dovuto le preoccupazioni di teratoma formazione22, e loro natura immaturo può essere pro-aritmogenica23. Riprogrammazione di fibroblasti in hiPSCs ha suscitato interesse direttamente riprogrammazione fibroblasti in altri tipi cellulari. Ieda et al hanno dimostrato che la sovraespressione di GATA4, Mef2c e Tbx5 (GMT) nei risultati di fibroblasti in riprogrammazione diretta per linea cardiaca, anche se a bassa efficienza24. Riprogrammazione di efficienza è stata migliorata con l'aggiunta di Hand2 (GHMT)25. Da questi primi studi, molte pubblicazioni hanno dimostrato che alterando il cocktail fattore riprogrammazione con trascrizione ulteriori fattori26,27,28,29, cromatina modificatori30,31, microRNA32,33o piccole molecole34 conduce ad una migliore riprogrammazione efficienza e/o maturazione indotta del cardiomyocyte-come delle cellule (iCMs ).

Qui forniamo un protocollo dettagliato per generare iCMs da fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) con alta efficienza. Precedentemente abbiamo indicato che il GHMT cocktail è notevolmente migliorata con l'aggiunta di miR-1 e miR-133 (GHMT2m) ed è stata ulteriormente migliorata quando vie tra cui trasformando la segnalazione di fattore di crescita β (TGF-β) di segnalazione pro-fibrotici o Rho-associati vie di segnalazione della proteina chinasi (ROCK) sono inibiti35. Usando questo protocollo, ci mostrano che circa il 60% delle cellule express cardiaco troponina T (cTnT), circa il 50% express α-actinina, e un elevato numero di celle di battitura può essere osservato più presto il giorno 11 dopo trasduzione di riprogrammazione fattori e trattamento con il TGF-β tipo inibitore del recettore A-83-01. Inoltre, questi iCMs esprimono proteine di giunzione divario tra cui connexin 43 ed esibiscono contrazione spontanea e transitori di calcio. Questo netto miglioramento nella riprogrammazione efficienza rispetto agli studi precedenti dimostra il potenziale per rigenerare CMs da popolazioni di cellule endogene che rimangono post-nell'infarto cuore.

Protocollo

Tutti gli esperimenti che richiedono gli animali sono stati approvati dal comitato di utilizzo presso la UC Denver Anschutz Medical Campus e istituzionali Animal Care.

1. isolamento di MEFs

  1. Acquistare C57BL/6 topi incinto a E13. Nave durante la notte.
  2. Eutanasia della madre secondo protocolli approvati IACUC (ex: ~1.3 L/min CO2 fino a quando l'animale appare morto seguita da dislocazione cervicale)
  3. Spruzzare la madre con etanolo al 70% e aprire la cavità addominale. Rimuovere il corno uterino contenenti embrioni e mettere in un piatto di 10 cm con PBS sterile.
  4. Praticare un'incisione nel sac di rilasciare embrione embrione. Trasferimento dell'embrione per pulire il piatto di 10 cm con PBS sterile. Sciacquare abbondantemente.
  5. Tagliare il corpo sotto il fegato e scartare la testa e la parte superiore del corpo. Rimuovere gli organi interni e scartare. Trasferire il tessuto restante ad un piatto pulito 10cm con PBS sterile e trasferire la piastra a un livello di biosicurezza 1 o 2 mobile. Combinare tessuti da tutti gli embrioni in un piatto pulito e asciutto 10cm e tritare in pezzi pregiati.
  6. Aggiungere 6 mL di 0,25% tripsina/1 mM EDTA agli embrioni macinati. Triturare più volte mediante pipetta per rompere il tessuto. Incubare per 40 min a 37 ˚ c con 5% CO2.
  7. Risospendere le cellule in coltura (tabella 1). Il volume dei media viene regolato in base al numero di embrioni raccolti. In generale, utilizzare un rapporto di media di sviluppo di circa 25 mL per 1,2 embrioni.
  8. Piastra 25 mL di sedimento cellule in un piatto di 15 cm. Dopo 24 h, aspirare i media e aggiungere 25 mL di terreno di coltura fresco a ogni piatto.
  9. Dopo 72 h, aggiungere 2 mL di 0,25% tripsina/1 mM EDTA ad ogni piatto di 15 cm. Quando le cellule si staccano dalla piastra di coltura, inattivare tripsina con 15 mL di terreno di crescita e raccogliere le cellule in provette coniche da 50 mL in polistirolo. Centrifugare le cellule per 3 min a 160 x g a temperatura ambiente. Risospendere il pellet cellulare in crescita media e filtro attraverso un colino di cella poro 70 µm.
  10. Contare le celle utilizzando un emocitometro e congelare MEFs in aliquote di 2 milioni di cellule nel mezzo di congelamento (10% DMSO, 25% FBS in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) / alto glucosio) a-80 ° C. Trasferire le cellule a azoto liquido dopo 24 h e negozio fino all'uso.
    Nota: Espressione genica globale in MEFs è stata profilata isolato usando questo protocollo mediante sequenziamento di RNA (RNA-seq) per garantire l'autenticazione delle cellule. RNA-seq dati dalle celle di codificare MEF sono stati scaricati da NIH Gene Expression Omnibus (GEO) con numero di accessione GSE93454. Dati di espressione genica di RNA-seq per MEFs da noi utilizzati sono stati depositati in NIH GEO con numero di accessione GSE71405. Questi due insiemi di dati sono state fuse secondo simboli comuni di gene. I dati di espressione quindi registro-sono stati trasformati ed un scatterplot dei dati di espressione per i nostri MEFs ed ENCODE MEFs erano generati e misura con una retta di regressione lineare (Figura 1A). MEFs isolati utilizzando questo protocollo sono molecolarmente simili a quelli isolati da altri laboratori.

2. produzione di Retrovirus e trasduzione di MEFs

Nota: Tutti i passaggi in questa sezione devono essere effettuati in un armadio di 2 livello di biosicurezza. Poiché questo protocollo utilizza trasduzione retrovirale, garantire che la sicurezza Precauzioni tra cui trattare che tutti i rifiuti contenenti mezzi di comunicazione virale con candeggina al 10% per almeno 20 min. fare riferimento alla Figura 1B per un diario per la riprogrammazione.

  1. Produzione di Retrovirus utilizzando la linea cellulare Platinum E (PE)
    1. Mantenere commercialmente disponibile PE le cellule in PE medio (tabella 1) contenenti Consciousness con puromicina Selezione indicatori e per garantire l'espressione della gag-pol ed env geni per la produzione efficiente delle particelle retrovirali36 . Cellule del passaggio 1:4 o 1:5 ogni due giorni. Fare attenzione a evitare il sovraffollamento delle cellule in quanto questo può ridurre le rese di produzione retrovirali.
    2. Il giorno -1, circa 5 x 106 cellule per ogni piatto di 10 cm nel terreno di crescita (tabella 1), h 16-20 di semi prima della trasfezione (Vedi tabella 2 per la placcatura di densità per altri formati di cella standard cultura piatto). Scuotere delicatamente piatti avanti e indietro diverse volte e posizionare con cura in un 37 ° C, 5% CO2 incubatore per garantire anche la distribuzione di placcatura (per densità di placcatura ottimale prima della trasfezione, vedere Figura 1 ).
      Nota: fare attenzione alle cellule di PE piatto nel mezzo libero di marcatori di selezione prima di transfezione per garantire supporto contenente particelle retrovirali generate non uccide MEFs.
    3. Il giorno 0, preparare il DNA per la transfezione. Per la transfezione di piatto di 10 cm, aggiungere 2 µ g di ogni fattore di riprogrammazione — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) — in una provetta da 1,5 mL.
      Nota: Fare riferimento alla tabella 2 per scalare la quantità di DNA necessaria a transfect altre dimensioni piatto cultura standard.
    4. In un tubo separato da 1,5 mL, aggiungere 360 µ l siero riduttore media. Quindi aggiungere 36 µ l di reagente di transfezione direttamente ai media di siero ridotto. Delicatamente flick il tubo e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
      Nota: Per evitare di transfezione ridotta efficienza, attentamente aggiungere Reagente di transfezione direttamente ai media riduttori del siero.
    5. Aggiungere siero riduttore media/transfezione reagente misto al DNA GHMT2m cocktail. Delicatamente flick il tubo e incubare a temperatura ambiente per 15 min. Non centrifugare.
    6. Aggiungere goccia a goccia la miscela di reazione alle celle di PE, delicatamente turbinio media per 10-15 s e posto in un 37 ° C, 5% CO2 incubator.
      Nota: Secondo il produttore, PE le cellule generano un titolo medio di 106 107 infettive unità/ml. Questo protocollo genera circa6 infezioni unità/mL da 24 h a 2 x 10 e 6 x 106 infezioni unità/mL di 48 h per una media MOI di 4. Transfezione di GFP/DsRed può essere utilizzata anche come un surrogato per efficienza di trasfezione/trasduzione se lo si desidera; efficienza di trasfezione dovrebbe superare il 90% di 48 h (Figura 1).
  2. Trasduzione di MEFs
    1. Il giorno 0, cappotto piatti a base di collagene e posto in un 37 ° C, 5% CO2 incubatore per almeno 2 h.
    2. Rimuovere MEFs dal disgelo e azoto liquido. Cellule di piastra 0.2 x 106 per ogni piatto di 60 mm nel mezzo di crescita. Delicatamente piastre di roccia per garantire anche la distribuzione di placcatura e collocare nell'incubatrice (Vedi Figura 1 per densità di placcatura ottimale e la tabella 2 per la placcatura di densità per altri formati di cella standard cultura piatto).
      Nota: Queste densità di placcatura sono state testate su più batch di isolato MEFs; a meno che MEFs display significativamente compromessa redditività, non è necessario regolare la densità di semina cellulare.
    3. Il giorno 1, post-trasfezione 24 h, è necessario utilizzare una siringa da 30 mL per raccogliere retrovirale medio generato dalle cellule di PE. Passare il mezzo attraverso un filtro di dimensioni dei pori 0,45 µm in una provetta conica da 50 mL. Aggiungere il reagente di transfezione di bromuro di hexadimethrine ad una concentrazione finale di 6 µ g/mL. Con attenzione aggiungere 10 mL di terreno di crescita fresco alle celle di PE da pipettaggio media sulla parete della piastra di coltura per impedire lo spostamento delle cellule.
    4. Aspirare il mezzo da MEFs e aggiungere 4 mL di terreno retrovirale appena raccolte ad ogni piatto. Ritorno MEFs nell'incubatore. Aggiungere candeggina al 10% a tutti i materiali a contatto con il fluido virale per neutralizzare le particelle retrovirali.
    5. Il giorno 2, post-trasfezione 48h, ripetere i passaggi da 2.2.2 e 2.2.3. Le cellule PE vengono scartate dopo la raccolta di 2nd del mezzo retrovirale.
      Nota: Aggiungere candeggina al 10% alle scartati PE celle per almeno 20 min neutralizzare i retrovirus indesiderati.
    6. Il giorno 3, aspirare medio da MEFs e ricostituire con 4 mL di terreno di iCM (tabella 1) contenente 0,5 µM A-83-01, un TGF-β tipo inibitore del recettore. Ricostituire il supporto di iCM che contiene A-83-01 ogni 2 giorni.
      Nota: Se usando GFP come un controllo di trasduzione, l'espressione è previsto per superare il 90% da questo punto di tempo (Figura 1).

3. flusso Cytometry per marcatori cardiaci

  1. Mezzo di aspirato da giorno 9 riprogrammato MEFs e lavaggio (1x) con PBS 1X per rimuovere i detriti e le cellule morte.
  2. Aggiungere 1 mL 0,25% tripsina/EDTA per 5 min a 37 ˚ c. Verifica celle utilizzando un microscopio chiaro e agitare piatto; Se le cellule rimangono attaccate, incubi più 5 min a 37 ° c fino a staccano le cellule.
  3. Lavare le cellule in 1X PBS contenente 5% di FBS e filtro attraverso un colino di cella poro 70 µm.
  4. Centrifugare a 160 x g per 3 min a temperatura ambiente e liquido aspirato dal pellet.
    Nota: Per aumentare il rendimento delle celle, lasciare liquido circa 50 µ l sopra il pellet cellulare.
  5. Lavare le cellule con 500 µ l 1X PBS contenente BSA 1%.
  6. Difficoltà cellule con 0,2 mL 1 milione cellule soluzione di fissaggio per 20 min sul ghiaccio.
  7. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio/perm ghiacciata di 1x.
    Nota: La soluzione del produttore è 10x.
  8. Centrifugare le cellule a 160 x g per 5 min a 4 ° C e aspirare il surnatante.
  9. Ripetere i passaggi da 3.7 e 3.8 un tempo supplementare. Dopo il lavaggio 2nd , procedere direttamente al passo successivo o mantenere le cellule a 4 ° C durante la notte.
  10. Bloccare con 100 µ l di siero di capra del 5% e siero di asino in perm/lavaggio 1X per 30 min a temperatura ambiente.
  11. Aggiungere 100 µ l di anticorpo primario diluito.
    Nota: Per questo protocollo, le celle sono state etichettate con mouse troponina T (1: 200) e del mouse α-actinina (1: 200) per quantificare la percentuale di cellule positive per componenti chiave del sarcomero cardiaco. Incubare anticorpo primario per 1 h a temperatura ambiente.
  12. Centrifugare le cellule a 160 x g per 5 m a 4 ° C, aspirare il surnatante e lavare 2x con tampone di lavaggio/Perm ' ghiacciata.
  13. Aggiungere 100 µ l di anticorpo secondario diluito.
    Nota: Per questo protocollo, le celle sono state etichettate con anti-topo 647 nm secondaria dell'anticorpo (1: 200). Incubare anticorpo secondario per 45 min a temperatura ambiente su un rotatore di over-fine tubo. Proteggere le cellule dalla luce avvolgendo i tubi in un foglio.
  14. Centrifugare le cellule a 160 x g per 5 min a 4 ° C, aspirare il surnatante e lavare 2x con tampone di lavaggio/Perm ' ghiacciata.
  15. Aggiungere 1 mL di 1% BSA in PBS ed eseguire FACS immediatamente.
    Nota: Generare un grafico a dispersione di forward scatter vs lato al cancello prima cellule vitali durante l'esecuzione di FACS. In alternativa, utilizzare una macchia delle cellule vive/morte commercialmente disponibile prima della posa di cellule per identificare dal vivo e morto popolazioni cellulari.

4. Immunostaining del MEFs riprogrammate

  1. Mezzo di aspirato da giorno 14 riprogrammato MEFs e lavaggio (1x) con 1 mL 1 x PBS ghiacciata.
    Nota: Per l'immunocolorazione, riprogrammazione è stato effettuato in 12 piastre a pozzetti per ridurre al minimo i volumi di soluzione di anticorpo. 24 piatti ben possono anche essere utilizzati; semplicemente metà tutto seguendo i volumi.
  2. Aspirare e fissare le cellule con 500 µ l 2% paraformaldeide per 10 min a temperatura ambiente.
  3. Aspirare e lavare le cellule 3 volte con 1 mL di PBS + 1X (5 min a lavaggio a temperatura ambiente).
  4. Permeabilize le cellule con 500 µ l 0,2% permeabilizzazione reagente in PBS per 15 min a temperatura ambiente.
  5. Aspirare e bloccare in 500 µ l 10% di siero equino in PBS per 30 min a temperatura ambiente.
  6. Aspirare e incubare con 500 µ l di anticorpo primario diluito per 1 h a temperatura ambiente.
    Nota: Per questo protocollo, le cellule erano etichettate con mouse troponina T o α-actinina (ogni 1: 400) e co-etichettate con Connexin 43 (1: 400) o della troponina I (1: 400).
  7. Anticorpo primario di aspirare e lavare tre volte con 1 mL di PBS + 1X (5 min a lavaggio a temperatura ambiente).
  8. Aspirare e incubare con anticorpo secondario diluito di 500 µ l per 1 ora a temperatura ambiente.
    Nota: Per questo protocollo, le celle sono state etichettate con anticorpo anti-topo 555 nm secondario (1: 800) riconoscere troponina T o α-actinina e anti-coniglio 488 nm anticorpo secondario (1: 800) riconoscere Connexin 43 o troponina I. Inoltre, i nuclei sono stati macchiati con Hoechst (01:10, 000). Proteggere le cellule dalla luce incubando nel buio.
  9. L'anticorpo secondario di aspirare e lavare tre volte con 1 mL di PBS + 1X (5 min a lavaggio a temperatura ambiente). Avvolgere la piastra in un foglio per proteggere le cellule dalla luce e conservare a 4 ° C.
  10. Immagine utilizzando tre canali epifluorescenza.

5. il calcio Imaging

Nota: Se imaging presso ingrandimento 10x, piastre e piastre di coltura cellulare standard sono adatti per l'imaging del calcio. La formazione immagine a maggiore ingrandimento richiede che le cellule piastrate su vetrini coprioggetti o piatti di vetro inferiore.

  1. Medio di aspirare e aggiungere 2 mL (per un 6 piastra bene) per volta soluzione di Tyrode (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1mm MgCl2, glucosio di 10 mM, 10 mM HEPES, BSA 0.1% e 1% piruvato, a pH 7,4) contenente 5 µM Fura-2 AM e 0,1% Pluronic F-127 a battere (D14 t iCMs o D20). Incubare per 30 minuti a 37 ° C.
    Nota: Proteggono le cellule dalla luce per evitare l'estinzione dell'indicatore fluorescente.
  2. Lavare le cellule in soluzione di Tyrode 2ml per 30 min a temperatura ambiente per permettere de-esterificazione del Fura-2 AM.
  3. Immagine con filatura la microscopia confocale disco a 340 nm e 380 nm utilizzando Slidebook 5.5 Ca2 + software di imaging. Eseguire l'imaging a temperatura ambiente.
  4. Transitori di calcio sono calcolati utilizzando il rapporto di intensità di fluorescenza a 340 nm sopra l'intensità di fluorescenza a 380 nm.
  5. Se lo si desidera, trattare iCMs con isoproterenolo µM 1 o 2 o 10 µM nifedipina per manipolare dopo formazione immagine transitori di calcio della linea di base di calcio. Aggiungere composti localmente alle cellule ed immagine.

Risultati

Utilizzando la riprogrammazione strategia delineata sopra e in Figura 1B, abbiamo generato iCMs con circa 70% delle cellule che esprimono cardiaco troponina T e circa il 55% delle cellule che esprimono cardiaco α-actinina, quantificato tramite flusso cytometry al giorno 9 seguito di trasduzione di GHMT2m (Figura 2A e B). Inoltre, la maggior parte delle cellule esprime troponina cardiaca T, troponina I e cardiaca...

Discussione

Il presente studio delinea una strategia ad alto rendimento per riprogrammare direttamente fibroblasti in iCMs funzionale tramite consegna di GHMT2m riprogrammazione fattori combinati con soppressione delle vie di segnalazione pro-fibrotici. Mediante citometria a flusso, imaging immunofluorescenti, calcio imaging e battendo i conteggi delle cellule, mostriamo la maggior parte delle cellule in questo protocollo subiscono successo riprogrammazione e adottare il destino del lignaggio di CM. Precedentemente abbiamo indicato ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata sostenuta dai fondi da programma della Fondazione Webb-Waring Boettcher Biomedical Research, American Heart Association scienziato Development Grant (13SDG17400031), Università del Colorado, dipartimento di medicina eccezionale carriera iniziale Programma di studioso, Università del Colorado divisione di cardiologia Barlow Nyle endowment e NIH R01HL133230 (di k. s). ASR è stata sostenuta da NIH/NCATS Colorado CTSA Grant numero TL1TR001081 e una borsa di studio pre-dottorato del Consorzio di Università del Colorado per fibrosi ricerca e traduzione (CFReT). Questa ricerca è stata sostenuta anche dal cancro centro supporto Grant (P30CA046934), la pelle malattie ricerca Core Grant (P30AR057212) e il nucleo di citometria a flusso presso l'Università del Colorado, Anschutz Medical Campus.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6 MiceCharles River's Laboratory027For MEF isolation
Platinum E (PE) CellsCell Biolabs, INCRV-101For retrovirus production
DMEM High GlucoseGibcoSH30022.FSComponent of iCM, PE, and Growth media
Medium 199Life Technologies11150-059Component of iCM media
Fetal Bovine SerumGemini100106Component of iCM, PE, and Growth media
Donor Horse SerumGemini100508 500Component of iCM media
MEM Essential Amino Acids, 50XLife Technologies11130051Component of iCM media
Sodium Pyruvate Solution, 100XLife Technologies11360070Component of iCM media and for calcium imaging
MEM Non-Essential Amino Acids, 100XLife Technologies11140050Component of iCM media
MEM Vitamin Solution, 100XLife Technologies11120-052Component of iCM media
Insulin-Transferrin-SeleniumGibco41400045Component of iCM media
B27Gibco17504-044Component of iCM media
Penicilin-StreptomycinGibco15140-122Component of iCM, PE, and Growth media
GlutaMAX (L-Glutamine Supplement)Gibco35050-061Component of iCM, PE, and Growth media
Blasticidin-HClLife TechnologiesA11139-03Component of PE media
Puromycin dihydrochlorideLife TechnologiesA11138-03Component of PE media
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200-056For detaching cells from culture dishes
A-83-01R&D Systems - Tocris2939/10Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM
DMSOThermo Scientific85190For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium
SureCoatCellutronSC-9035For coating dishes to plate MEFs
FuGENE 6 Transfection ReagentPromegaE2692Transfection Reagent
Opti-MEM Reduced Serum MediaGibco11058-021Transfection Reagent
pBabe-X Myc-GATA4Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Hand2Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Mef2cPlasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Tbx5Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-1Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-133Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X GFPPlasmid containing reprogramming factor
Polybrene (Hexadimethrine bromide)SigmaH9268-5GFor viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL
Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores)Nalgene 569-0020 For filtering media
SyringesBd Vacutainer Labware 309654For viral filtration
0.45 µm FiltersCelltreat229749For viral filtration
70 µm cell strainersFalcon 352350For MEF isolation and Flow Cytometry
Cytofix/Cytoperm SolutionBD554722For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry
perm/wash buffer BD554723For washing cells for flow cytometry
DPBS 1XGibco14190-250For washing cells
Bovine Serum AlbuminVWR0332-100gFor flow cytometry and calcium imaging
Goat SerumSigma G9023For blocking cells for Flow Cytometry
Donkey SerumSigmaD9663-10mgFor blocking cells for Flow Cytometry
Mouse Troponin TThermo Scientificms-295-p1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Mouse α-actininSigmaA7811L1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Rabbit Connexin 43Sigma C62191:400 IF
Rabbit Troponin IPhosphoSolutions2010-TNI1:400 IF
HoechstLife Technologies622491:10000 IF
Alexa 488, rabbitLife TechnologiesA-110341:800 IF
Alexa 555, mouseLife TechnologiesA-214221:800 IF
Alexa 647, mouseLife TechnologiesA-315711:200 Flow Cytometry
27-color ZE5 Flow Cytometer Bio-RADFor FACS
ParaformaldehydesigmaP6148-500mgFor fixing cells for IF
Triton X-100PromegaH5142For permeabilization of cells for IF
EVOS™ FL Color Imaging SystemThermo ScientificAMEFC4300For IF
NaClRPIS23020-5000For calcium imaging
KClVWR395For calcium imaging
CaCl2FisherC614-500For calcium imaging
MgCl2VWR97061-352For calcium imaging
glucosesigmaG7528-250gFor calcium imaging
HEPESsigmaH4034-500gFor calcium imaging
Fura-2 AMLife TechnologiesF1221For calcium imaging
Fluronic F-127SigmaP2443-250gFor calcium imaging
NifedipineSigmaN7634-1GFor disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM
IsoproterenolsigmaI6504-1gFor increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM
Marianas Spinning Disk Confocal microscope3iFor calcium imaging
ethanolDecon Laboratories2801
bleachClorox
50 mL conical tubesGREINER BIO-ONE227261
15 mL conical tubesGREINER BIO-ONE188271
15 cm cell culture dishesFalcon353025
10 cm cell culture dishesFalcon353003
60 mm cell culture dishesGREINER BIO-ONE628160
6 well cell culture platesGREINER BIO-ONE657160 
12 well cell culture platesGREINER BIO-ONE665180 
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Riferimenti

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