شاشة 2-هجين خميرة في دفعة المقارنة بين تفاعلات البروتين

Summary

تجهيز دفعة من الخميرة 2-الهجين شاشات تسمح بالمقارنة المباشرة لملامح متعددة الطعم البروتينات التفاعل مع مجموعة معقدة جداً من البروتينات الانصهار فريسة. هنا، يمكننا وصف الأساليب المكررة، الكواشف الجديدة، وكيفية تطبيق استخدامها لهذه الشاشات.

Abstract

الفحص لتفاعلات البروتين البروتين باستخدام مقايسة 2-الهجين الخميرة منذ فترة طويلة أداة فعالة، ولكن إلى حد كبير استخدام محدود لاكتشاف التمثيلات النسب العالية التي يتم التخصيب في مكتبة المرشحين المتفاعلة. في تنسيق تقليدية، يمكن أن تسفر عن التحليل 2-الهجين الخميرة مستعمرات كثيرة جداً لتحليل عندما أجرت في صرامة منخفضة حيث يمكن العثور على التمثيلات تقارب منخفضة. وعلاوة على ذلك، دون استجواب شاملة وكاملة من المكتبة نفسها ضد والبلازميدات الطعم مختلفة، لا يمكن تحقيق إجراء تحليل مقارن. على الرغم من أن بعض هذه المشاكل يمكن معالجتها استخدام مكتبات صفت فريسة، التكلفة والبنية التحتية اللازمة لتشغيل هذه الشاشات يمكن أن تكون باهظة. كبديل لذلك، ونحن قد تكيفت المقايسة 2-الهجين الخميرة في الوقت نفسه كشف العشرات من عابرة وتفاعلات البروتين ثابتة داخل شاشة واحدة استخدام استراتيجية وصف ديبن (التخصيب الحيوي لشبكات التقييم البروتين)، التي ويتضمن تسلسل الحمض النووي الفائق وحساب متابعة تطور عدد سكانها والبلازميدات ترميز الشركاء متفاعلة فيما بينها. وهنا يصف لنا الكواشف مخصصة والبروتوكولات التي تسمح شاشة ديبن ليتم تنفيذها بسهولة وفعالية من حيث التكلفة.

Introduction

فهم كامل للعمليات البيولوجية الخلية يعتمد على إيجاد شبكات التفاعل البروتين التي تكمن وراء تلك الآليات الجزيئية. يتمثل أحد النهج لتحديد تفاعلات البروتين المقايسة الخميرة 2-هجين (Y2H)، الذي يعمل عن طريق تجميع عامل نسخ تشيميريك تعمل بمجرد ربط بين البروتين المجالات ذات الاهتمام ببعضها¹. شاشة Y2H نموذجية يتم عن طريق إنشاء عدد أن خميرة التي يضم كل مكتبة من البلازميدات ترميز البروتينات المتفاعلة التي تنصهر فيها منشط النسخي (مثلاً.، 'فريسة' البروتين الانصهار) وبلازميد معين 'طعم' تتألف من البروتين من مصلحة تنصهر إلى مجال ربط الحمض النووي (مثلاً، Gal4 الحمض النووي ملزم المجال الذي يربط إلى تسلسل تفعيل Gal4 المنبع). واحدة من المزايا الرئيسية للنهج الذي Y2H هو أن من السهل نسبيا وغير مكلفة لقواعد السلوك في مختبر نموذجية مجهزة للعمل الروتيني البيولوجية الجزيئية². ومع ذلك، عندما تؤدي تقليديا، عينات مستخدم المستعمرات الفردية التي تنشأ عند التحديد لتفاعل إيجابي Y2H. وهذا يحد بشدة من عدد النسخ 'فريسة' المكتبة التي يمكن أن تجري دراسة استقصائية. وتتفاقم هذه المشكلة عند وفرة فريسة متفاعلة خاصة مرتفع جداً بالنسبة للآخرين، تتضاءل فرصة للكشف عن التفاعل من وفرة منخفضة فريسة والبلازميدات.

هو حل واحد لاستخدام مبدأ Y2H في تغطية شاملة للبروتين استخدام نهج المهيأة باستخدام مصفوفة حيث يمكن استجوابهم صفيف يحتوي على البلازميدات فريسة الفردية المعروفة رقمياً. ومع ذلك، يتطلب هذا نهج البنية أساسية التي لا يسهل موجوداً أو فعالة من حيث التكلفة للمحققين الأفراد الذين يرغبون في تحديد إينتيراكتومي لعدد قليل من البروتينات أو المجالات³. وباﻹضافة إلى ذلك، ستوسع المكتبات فريسة المعقدة جداً التي قد ترميز أجزاء متعددة من البروتينات المتفاعلة حجم هذه المصفوفات مصفوفة لأحجام غير عملي. وبديل هو إجراء فحوصات مع مكتبات المعقدة على دفعات وتقييم وجود المتفاعلة الحيوانات المستنسخة باستخدام التسلسل الفائق المتوازية الضخمة⁴. وهذا يمكن تطبيقه على الاعتداء وجود والبلازميدات الجارحة التي تنشأ في مستعمرات متعددة باستخدام نموذجي Y2H نهج يسمح لتنمو على^5،لوحة⁶خلايا الإسكان على زوج متفاعلة من البروتينات الانصهار في الخميرة التي تمت تهيئتها. يمكن أن تتفاقم هذه الفكرة العامة لزيادة الاستعلام من كلا الطعم متعددة وفريسة المكونات في نفس الوقت^7،8.

لا يزال العديد من التحقيقات تتطلب أسهل بعد أكثر تركيزاً الجهد على عدد قليل من البروتين 'الطعم' ويمكن أن تستفيد أكثر من استعلام حصرية وشبه كمي لمكتبة واحدة فريسة المعقدة. لدينا نمواً والتحقق من صحة نهج لإجراء دراسات التفاعل البروتين على نطاق واسع باستخدام مبدأ Y2H في دفعة الشكل⁴. هذا يستخدم معدل التوسع بلازميد فريسة معينة كوكيل للقوة النسبية ل التفاعل Y2H⁹. التسلسل العميق لجميع البلازميدات داخل مجموعة من سكان يتعرضون للنمو الطبيعي أو ظروف النمو الانتقائي وتنتج خريطة كاملة للحيوانات المستنسخة التي تسفر عن التفاعلات Y2H القوية والضعيفة. ويمكن الحصول على المرجع للتمثيلات ومقارنة مباشرة عبر متعددة الطعم والبلازميدات. وبالتالي يمكن استخدام سير العمل الناتجة عن وصف ديبن (التخصيب الحيوي لشبكات التقييم البروتين) لتحديد إينتيراكتوميس التفاضلية من نفس مكتبات فريسة لتحديد البروتينات، مما يتيح المقارنة بين بروتين واحد مقابل آخر.

وهنا نبدي ديبن وإدخال التحسينات في أساليب المختبرات التي يسهل استخدامها، الذي يرد في الشكل 1. تتضمن التحسينات الهامة:

جيل سكان فريسة الخميرة. أحد المتطلبات الرئيسية ديبن يولد سكان خميرة مع البلازميدات الطعم المختلفة التي لها نفس التوزيع للمكتبات فريسة بلازميد. السكان يعادل خط الأساس للمكتبة بلازميد فريسة ضرورية لإجراء مقارنات دقيقة بين إينتيراكتوميس الطعوم المختلفة. وهذا يتحقق على أفضل وجه عندما يقع بلازميد مكتبة الفعل في عدد سكان فرداني خميرة وتتحرك بلازميد طعم معطى إلى أن السكان يتحقق عن طريق التزاوج لإنتاج من مثنوية. وهنا، نحن نقدم دليل واضح في كيفية جعل هؤلاء السكان باستخدام المكتبات التجارية في الخميرة فرداني. على الرغم من أن نجد أساليب توليد عدد كبير من ديبلويدس، وكفاءة التزاوج عموما من هذه السلالات التجارية الخميرة التي تحتوي على مكتبة كان منخفضا. ولذلك، نحن شيدت سلالة جديدة التي يمكن البيت فريسة المكتبات التي تعطي ديبلويدس أكثر بكثير من كل رد فعل التزاوج.

مجموعة جديدة من الطعم والبلازميدات. العديد من البلازميدات الحالية التي تعبر عن 'الطعم' الانصهار البروتينات تتألف من البروتين الفائدة ومجال الحمض النووي ملزم تقوم على أساس 2µ، السماح لهم بتضخيم عدد النسخ. يمكن هذا الرقم نسخة متغير تماما في عدد السكان ويؤدي إلى تباين في استجابة النسخي Y2H. وهذا بدوره يمكن أن تحرف القدرة على قياس قوة تفاعل بروتين معين استناداً إلى استجابة نمو الخلايا ضمن التحديد. يمكن أن يكون هذا جزئيا إلى عنوان باستخدام بلازميد نسخة منخفضة، البعض منها قد وصفت سابقا مثل pDEST32 المتاحة تجارياً¹⁰. نحن شيدت بلازميد طعم جديد (بتيف-اختطارها) التي تنتج Gal4-الحمض النووي-ملزمة المجال الانصهار البروتينات داخل بلازميد نسخة منخفضة على أساس السنترومير TRP1 تحمل الجينات المقاومة كانر أن يسمح أيضا باستنساخ الأجزاء الطعم المنبع و المتلقين للمعلومات في المجال Gal4 الحمض النووي ملزم.

مكتبة بلغة جديدة الكثافة Y2H. شيدت بلازميد جديد إلى البيت Y2H فريسة المكتبات، وأنها تستخدم لبناء مكتبة Y2H معقدة للغاية مصنوع من شظايا المنفصمة عشوائياً من الحمض النووي من Saccharomyces cerevisiae. أظهر تحليل تسلسل أن مكتبة هذه العناصر المختلفة ما يزيد على 1 مليون، الآن أكثر تعقيداً من الخميرة هو موضح سابقا المجينية Y2H بلازميد المكتبات¹¹. مع هذه المكتبة الجديدة، كنا قادرين على إظهار أن يكون سير العمل ديبن قوية بما يكفي لاستيعاب مكتبات معقدة مع العديد من البلازميدات مختلفة على نحو يعول عليه وقابل لإعادة الإنتاج.

Protocol

1-إعداد وسائل الإعلام ولوحات

ملاحظة: جميع لوحات تحتاج إلى بذل الحد الأدنى 2 أيام قبل البدء بالبروتوكول. ويمكن إجراء وسائل الإعلام عند أي نقطة. ومع ذلك، استخراج الخميرة مخزنة ببتون الدكستروز الأدنين (بيبدا) يحتاج إلى بذل في اليوم الذي سيتم استخدامه. بعض وسائل الإعلام باستخدام مزيج ملحق التي تحتوي على مستوى الأدنين أكبر من ما يستخدم بشكل عام. تحديد معظم وسائل الإعلام الحد الأدنى ملاحق الأدنين 10 مغ/لتر. المكملات المسماة '+ 40Ade' تحديد مجموع الأدنين 40 مغ/لتر.

1. إعداد "الحل الجلوكوز" (50% w/v). 1 للأم، حل 500 غ د-(+)-الجلوكوز في 800 مل ماء المقطر في كوب مل 1,000. ضبط حجم الصوت لمل 1,000 لاستخدام اسطوانة وتصفية من خلال عامل تصفية عقيمة 0.2 ميكرون في زجاجة تخزين وسائط مل 1,000 عقيمة.
2. إعداد الخميرة استخراج لوحات ببتون سكر العنب (YPD). 1 للأم، حل 20 غراما من ببتون و 10 جرام من "خميرة استخراج" في 800 مل ماء المقطر في كوب مل 1,000. تتدفق اسطوانة، وملء يصل إلى 960 مل بالماء المقطر. صب مل 2,000 قارورة Erlenmeyer وإضافة 15 غم أجار. اﻷوتوكﻻف وباردة في حمام الماء 37 درجة مئوية حتى قد تبريد درجة حرارة حمام الماء إلى ما يقرب من 42-50 درجة مئوية. استخدام ماصة إضافة 40 مل جلوكوز 50%. مزيج جيد من دوامات.
   1. من أجل سلسلة من لوحات 100 ملم مع 20 مل من وسائل الإعلام ماصة.
3. تحضير الوسائط الحد الأدنى الاصطناعية الكاملة (المجلس الأعلى للقضاء)-لوحات الراديكالي. 1 للأم، حل ز 6.7 من "قاعدة النيتروجين الخميرة" دون الأحماض الأمينية إلى 800 مل ماء المقطر في كوب مل 1,000. صب اسطوانة، وملء يصل إلى 960 مل من الماء المقطر. صب مل 2,000 من قارورة Erlenmeyer وإضافة ز 0.7-الحزب-اجتمع مزيج التسرب، 20 ملغ من الميثيونين وز 15 من أجار. اﻷوتوكﻻف وباردة في حمام الماء 37 درجة مئوية حتى قد تبريد درجة حرارة حمام الماء إلى ما يقرب من 42-50 درجة مئوية. استخدام ماصة إضافة 40 مل جلوكوز 50%. مزيج جيد من دوامات.
   1. من أجل سلسلة من لوحات 100 ملم مع 20 مل من وسائل الإعلام ماصة.
4. إعداد لوحات اجتمع المجلس الأعلى للقضاء-لوي. 1 للأم، حل ز 10.05 قاعدة النيتروجين الخميرة دون الأحماض الأمينية إلى 800 مل ماء المقطر في كوب مل 1,000. صب اسطوانة وشغل تصل إلى 940 مل من الماء المقطر. صب مل 2,000 من قارورة Erlenmeyer وإضافة 1.005 ز من-لوي-اجتمع ميكس التسرب و 15 غرام من أجار. اﻷوتوكﻻف وباردة في حمام الماء 37 درجة مئوية حتى قد تبريد درجة حرارة حمام الماء إلى ما يقرب من 42-50 درجة مئوية. استخدام ماصة إضافة 60 مل جلوكوز 50%. مزيج جيد من دوامات.
   1. من أجل سلسلة من لوحات 100 ملم مع 20 مل من وسائل الإعلام ماصة.
5. إعداد لوحات المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الراديكالي. 1 للأم، حل ز 10.05 قاعدة النيتروجين الخميرة دون الأحماض الأمينية إلى 800 مل ماء المقطر في كوب مل 1,000. صب اسطوانة، وملء تصل إلى 940 مل من الماء المقطر. صب مل 2,000 من قارورة Erlenmeyer وإضافة 1.005 ز-الحزب-لوي + ميكس التسرب 40Ade و 240 ملغ من الأدنين ز 15 من أجار. اﻷوتوكﻻف وباردة في حمام الماء 37 درجة مئوية حتى قد تبريد درجة حرارة حمام الماء إلى ما يقرب من 42-50 درجة مئوية. استخدام ماصة إضافة 60 مل جلوكوز 50%. مزيج جيد من دوامات.
   1. من أجل سلسلة من لوحات 100 ملم مع 20 مل من وسائل الإعلام ماصة.
6. يعد المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-صاحب اللوحات. 1 للأم، حل ز 10.05 قاعدة النيتروجين الخميرة دون الأحماض الأمينية إلى 800 مل ماء المقطر في كوب مل 1,000. صب اسطوانة، وملء تصل إلى 940 مل من الماء المقطر. صب مل 2,000 من قارورة Erlenmeyer وإضافة من 0.975 ز-الحزب-لوي-له + ميكس التسرب 40Ade 240 ملغ من الأدنين وز 15 من أجار. اﻷوتوكﻻف وباردة في حمام الماء 37 درجة مئوية حتى قد تبريد درجة حرارة حمام الماء إلى ما يقرب من 42-50 درجة مئوية. استخدام ماصة إضافة 60 مل جلوكوز 50%. مزيج جيد من دوامات.
   1. من أجل سلسلة من لوحات 100 ملم مع 20 مل من وسائل الإعلام ماصة.
7. يعد المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-صاحب-3AT لوحات. 1 للأم، حل ز 10.05 قاعدة النيتروجين الخميرة دون الأحماض الأمينية إلى 800 مل ماء المقطر في كوب مل 1,000. صب اسطوانة، وملء تصل إلى 940 مل من الماء المقطر. صب مل 2,000 من قارورة Erlenmeyer وإضافة من 0.975 ز-الحزب-لوي-له + ميكس التسرب 40Ade 240 ملغ من الأدنين وز 15 من أجار. اﻷوتوكﻻف وباردة في حمام الماء 37 درجة مئوية حتى قد تبريد درجة حرارة حمام الماء إلى ما يقرب من 42-50 درجة مئوية. استخدام ماصة إضافة 60 مل جلوكوز 50%. في 100 ميليلتر مخزون العقيمة م 1 من 3-الأمينية 1,2,4 تريازولي (3AT) مزيج من دوامات.
   1. من أجل سلسلة من لوحات 100 ملم مع 20 مل من وسائل الإعلام ماصة.
8. إعداد لوحات كانر رطل. 1 للأم، استخراج حل 10 جرام تريبتوني، 5 غ خميرة و 10 جرام من كلوريد الصوديوم في 800 مل من الماء في كوب مل 1,000 المقطر. صب اسطوانة، وملء يصل إلى 1,000 مل من الماء المقطر. صب مل 2,000 من قارورة Erlenmeyer وإضافة 15 غم أجار. اﻷوتوكﻻف وباردة في حمام الماء 37 درجة مئوية حتى قد تبريد درجة حرارة حمام الماء إلى ما يقرب من 42-50 درجة مئوية. إضافة 50 ملغ كاناميسين ومزيج من دوامات.
   1. من أجل سلسلة من لوحات 100 ملم مع 20 مل من وسائل الإعلام ماصة.
9. إعداد YPD، المجلس الأعلى للقضاء-لوي التقى، المجلس الأعلى للقضاء-الحزب الراديكالي-لوي-المجلس الأعلى للقضاء والمجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-صاحب وسائل الإعلام. استخدم الإجراء أعلاه للوحات ما عدا بدلاً من سكب قارورة Erlenmeyer، صب في زجاجة تخزين وسائل الإعلام وتجاهل أجار.
10. إعداد بيبدا (ايبدا مخزنة بشكل مؤقت). تأخذ وسائل الإعلام YPD العقيمة وإضافة الأدنين 200 مغ/لتر في الماء المقطر المعقم. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 3.7 مع HCl. التصفية من خلال عامل تصفية عقيمة 0.2 ميكرون في زجاجة معقمة.
11. إعداد المخزن المؤقت للتحول: السوربيتول م 2، ثنائي هيدرات خلات الليثيوم م 1، 10 مم تريس درجة الحموضة 7.6، 0.5 مم يدتا، 0.2 مم كلوريد الكالسيوم في الماء المقطر. التصفية من خلال فلتر 0.2 ميكرون معقمة في زجاجة معقمة.
12. إعداد الحل شماعة: 70% w/v البولي إثيلين غليكول 3350 في الماء المقطر. تعقيم اﻷوتوكﻻف.
13. إعداد برم: م 8 اليوريا، 4% w/v الحزب الديمقراطي الصربي، 50 مم تريس الأس الهيدروجيني 6.8، 10% v/v والغليسيرول، 0.02% w/v بروموفينول الأزرق في تعقيم ماء مقطر.
14. إعداد الظريف (TE قوية): 50 مم تريس، 20 مم يدتا، pH 8.0 في الماء المقطر. التصفية من خلال فلتر 0.2 ميكرون معقمة في زجاجة معقمة.
15. إعداد حل زيمولاسي الأسهم: 10 ملغ/مل زيمولاسي 100T في 50 مم بوتاسيوم فوسفات مائي pH 7.5، المقطر 50% v/v والغليسيرول المخزن المؤقت في تعقيم المياه (المخزنة في-20 درجة مئوية).

2-الاستنساخ وتحقق البلازميدات الطعم

ملاحظة: بناء Gal4-الحمض النووي-ملزمة المجال والبلازميدات. حاليا، هناك مجموعة متنوعة من نظم Y2H المتاحة تجارياً واكاديميا المتاحة. ديبن يمكن أن تستوعب العديد من هذه شريطة أن يكون بلازميد الطعم معربا عن بروتين الفائدة التي تنصهر فيها إلى مجال الحمض النووي ملزم TRP1--التي تحتوي على بلازميد. متطلبات المتلقين للمعلومات الأخرى هي أن التسلسل على الفور مكتبة فريسة المعروف إدراج المنبع والتي يمكن أن سجل Y2H تفاعل إيجابي من إنتاج His3 يسمح بالتحديد في وسائل الإعلام التي تفتقر إلى الحامض الأميني. هنا ونحن سوف تصف استخدام بلازميد الطعم Y2H الجديد (بتيف-اختطارها، الشكل 2)، ومع ذلك، يمكن أن تستخدم والبلازميدات الطعم Y2H الأخرى بما في ذلك pGBKT7 كذلك. للبناء وتقييم والبلازميدات الطعم، ونحن سوف تصف استخدام اختطارها بتيف. وكملاحظة عامة، نوصي بتوليف الجينات لإنتاج إطار القراءة المفتوحة التي تتمسك بالتحيز كودون الخميرة للمساعدة على ضمان التعبير الجيد وسهولة مع الاستنساخ. ضمان أن نظام الاستنساخ يسمح للطعم في الإطار مع المجال Gal4 الحمض النووي ملزم وأن عند الاستنساخ في الموقع 3 '، يتبع كودون توقف منطقة الطعم الترميز.

1. إعداد ناقلات بلازميد. بلازميد بتيف-اختطارها يسمح باستنساخ جزء ترميز بروتين الفائدة 5 'أو 3' منطقة ترميز المجال Gal4 الحمض النووي ملزم باستخدام أسلوب التجميع سريع. للإدراج في 5 'موقع هضم ميكروغرام 3 من اختطارها بتيف مع الرابطة واكوري أو هضم للإدراج في الموقع 3'، مع بامهي وزهوي حاء – 2-4 نموذج اليكتروفوريسي في 1% الحمض النووي [اغروس] هلام يحتوي على 0.2-0.5 ميكروغرام/مل اثيديوم بروميد (أتبر) في 100 ف المكوس bp قص 5,630 اختطارها TEF وتنقية باستخدام مجموعة أدوات استخراج هلام الحمض النووي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة وتحديدها كمياً الحمض النووي بامتصاص في 260 nm جهاز المطياف الضوئي¹².
   ملاحظة: جيل إدراج الترميز الطعم. الحمض النووي وشظايا البروتينات ترميز أو شظايا البروتين من الفائدة يمكن أن يكون جعلت استخدام التوليف الجيني والمتاحة كأجزاء أونكلونيد. من المستحسن أن codons هي الأمثل للتعبير في Saccharomyces cerevisiae وأدوات الإنترنت للتحسين كودون مدرجة في قائمة المواد.
2. 5 'الإدخال، الجناح جزء الحمض النووي على ترميز كودون بدء ATG واسطة 5'-تاجااااكااكتجتاكجاتك-3 'و 5'-جكجككتاتجتجتجاكاااجكتات-3 '، على التوالي. 3 'إدراجها في الإطار مع المجال ملزمة Gal4 الحمض النووي، الجناح بلغة الترميز قبل 5'-كتجكاتاتجككاتجاجككجا-3 'و 5'-تاجتاكتاجكاتاككككتجججكك-3 '.
3. بلازميد البناء، استخدام أسلوب التجميع السريع كما هو محدد في إرشادات الشركة المصنعة للشظايا الاستنساخ إلى قطع بتيف-اختطارها.
   1. لوحة كل ما حولت كولاي على لوحات كانر رطل واحتضانها ح 16-20 عند 37 درجة مئوية. يمكن تحديد المستعمرات السكنية اختطارها بتيف مع إدراج المطلوب [بكر] تضخيم استخدام النوكليوتيد: 5 '-كجتكتكاتتكتكاجتتكاج-3' و 5 '-جاجتاكجاكاتكككاجتجتك-3' 5 'إدراج و 5'-كاككجتاتتكتجككاككتكتكك-3 ' و --جكاككجكاكتاتتجاجكجكتج 5 '-3' ل 3 ' إدراج. هذه النوكليوتيد أيضا بمثابة كبسولة تفجير لترتيب الإدراج.
   2. خطة بشأن إعداد > 10 ميكروغرام كل مشتق بتيف اختطارها واختطارها بتيف وحدها لتوفير المواد للتحولات التسلسل والخميرة.
   3. استخدام PCR الشروط التالية: 3 دقيقة عند 98 درجة مئوية، تليها دورات 25 من 30 ثانية عند 98 درجة مئوية، 30 s في 55 درجة مئوية، و 2 دقيقة في 72 درجة مئوية، تليها 5 دقائق عند 72 درجة مئوية باستخدام المخزن مؤقت الذي يحتوي على 2.5 مم مجكل₂ ، 0.5 U/100 ميليلتر دنا بوليميريز، وملكية المخزن المؤقت.

3-التعبير عن المجال Gal4-الحمض النووي-ملزم البروتينات الانصهار

1. جعل الخميرة المختصة.
   1. خط من الخميرة PJ69-4A على صفيحة YPD بأخذ قضيب خشبي عقيمة، إلغاء 1 مم³ -80 درجة مئوية تجميد الأسهم وفرك عليه بلطف عبر لوحة YPD. نقل قضيب خشبي أسفل اللوحة بحيث يذهب كل مرور عبر جزء متأثر من سطح وسائط الإعلام. احتضان لوحة YPD في 30 درجة مئوية لمدة يومين أو حتى مستعمرات واحدة مرئية. جعل الأسهم المجمدة من الخميرة PJ69-4A بتعليق الخميرة في الماء أو نمو وسائل الإعلام والمكمل مع [دمس] إلى 7%، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
   2. تطعيم مستعمرة واحدة في 5 مل ثقافة YPD في أنبوب ثقافة 20 مم × 150 مم باستخدام قضيب خشبي عقيمة وتنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في حاضنة تهز 200 لفة في الدقيقة.
   3. تلقيح 50 مل YPD في 250 مل قارورة Erlenmeyer العقيمة مع 4 مل ثقافة بين عشية وضحاها من سلالة الخميرة PJ69-4A. تنمو في حاضنة تهتز عند 30 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لكثافة بصرية (OD₆₀₀) لما يقرب من 1.2، كما يحددها كانت مع مسار ضوء قياسية 1 سم. وعادة ما يستغرق نمو ح 5-7.
   4. عزل الخميرة بالترسب في 50 مل أنبوب مخروطي في 4,696 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في أجهزة الطرد مركزي benchtop. تجاهل المادة طافية بإغراق النفايات السائلة. استخدام ماصة، ريسوسبيند بيليه في 5 مل من المخزن المؤقت للتحول ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي. ريسيديمينت تجاهل المادة طافية، وريسوسبيند الخميرة في 1 مل حجم المخزن المؤقت للتحول مع ماصة 1000 ميليلتر النهائي.
   5. احتضان خلايا الخميرة لمدة 60 دقيقة في 30 درجة مئوية بينما تهز 200 لفة في الدقيقة ومن ثم ضع على الجليد لمدة 30-90 دقيقة.
2. التحول بلازميد الخميرة.
   1. في 1.5 مل أنبوب ميكروسينتريفوجي العقيمة، إضافة 1 ميكروغرام من بلازميد المستندة إلى اختطارها بتيف و 5 ميليلتر من 10 ملغ/مل الحيوانات المنوية السلمون الناقل حل الحمض النووي. وتشمل أيضا أنبوب يحتوي على الحيوانات المنوية السلمون الناقل الحمض فقط كعنصر تحكم تحول سلبي. إضافة 100 ميليلتر من تعليق خلية الخميرة المثلج إلى كل أنبوب ماصة. إضافة 100 ميليلتر من 70% الحل الوتد مع ماصة 1000 ميليلتر والمزيج بلطف بالتحريك الأنبوب 5-10 مرات (لا دوامة).
   2. احتضان عند 30 درجة مئوية، في حاضنة تهز 200 لفة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة.
   3. صدمة الحرارة في 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   4. الرواسب في ميكروسينتريفوجي في 845 g x لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة، "الماصة؛" إيقاف وتجاهل المادة طافية، ريسوسبيند بيليه في 150 ميليلتر من الماء المعقم من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، وتنتشر على سطح صفيحة الحزب المجلس الأعلى للقضاء.
   5. ضع الجانب الأيمن لوحات أعلى في حاضنة 30 درجة مئوية واحتضان لمدة 2-3 أيام حتى مستعمرات مرئية. لوحات قد يكون رأسا لتجنب التكثيف على سطح لوحة بعد الحضانة عند 30 درجة مئوية ح 6-12.
   6. تأخذ 2-3 مستعمرات للتحول والانتصارات كتصحيح على لوح الحزب المجلس الأعلى للقضاء استخدام مسواك عقيمة. واسمحوا أن تنمو على ح 24 في 30 درجة مئوية.
3. جعل ليساتيس للتعبير البروتين.
   1. تطعيم 3 مل من المجلس الأعلى للقضاء-الراديكالي السائل وسائل الإعلام مع مباراة-رئيس--حجم الخميرة من التصحيح وتنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في أنبوب ثقافة 20 مم × 150 مم، بينما تهز 200 لفة في الدقيقة. جعل ثقافتين بين عشية وضحاها كل الطعم وناقلات اختطارها بتيف فارغة.
   2. أضف 1 مل YPD لكل مل 3 من المجلس الأعلى للقضاء-الراديكالي الثقافة بين عشية وضحاها. تنمو على ح 1 عند 30 درجة مئوية، بينما تهز 200 لفة في الدقيقة. تحقق التطوير التنظيمي للخلايا بواسطة جهاز المطياف الضوئي.
   3. الرواسب عدد مساو من خلايا، تطبيع وفقا للتوجيه التشغيلي. استخدام معقم 1.5 مل من أنابيب ميكروسينتريفوجي مع 5 دقيقة تدور في 2,348 س ز في درجة حرارة الغرفة في ميكروسينتريفوجي. استخدام ماصة لتجاهل المادة طافية. المخزون النهائي يتوافق مع الحد ني 2.1 OD.
      ملاحظة: عند حساب عدد مساو من خلايا، فإنه يمكن أن يحدث أن أحجام مختلفة قد يكون مطلوباً من كل ثقافة بين عشية وضحاها تحقيق OD 2.1 الحد الأدنى.
   4. ريسوسبيند بيليه في 450 ميليلتر من 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ريسينتريفوجي الخلايا لمدة 2 دقيقة في 2,348 س ز في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل المادة طافية بواسطة ماصة.
   5. ريسوسبيند بيليه مع 50 ميليلتر من المخزن المؤقت للدوامة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً بعناية فيما يتعلق بعدم جعل الفقاعات. عينة الحرارة لمدة 5 دقائق في 70 درجة مئوية.
4. التحقق من وجود تعبير البروتين من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
   1. استخدام هلام تدرج من 4-20% لضمان مجموعة كبيرة من الأوزان الجزيئية يمكن حلها. تحميل ما يعادل مبلغ (نفس OD) عينات في الحزب الديمقراطي الصربي-صفحة جل وتأكد من تضمين نموذج واحد على الأقل يحتوي على^14،،من¹³متجه اختطارها بتيف غير معدلة¹⁵.
   2. بعد فصل الغرواني الكهربي، نقل جل النيتروسليلوز وإيمونوبلوت باستخدام حركة مضادة أجسام [مونوكلونل] أو [بولكلونل] ويصدرون الكشف عن الحل (الشكل 3).

4-التنشيط الذاتي اختبار

1. متواصلة من الخميرة ماتالفا من المخزون-80 درجة مئوية المقابلة لسلالة الإسكان المكتبة فريسة للفائدة على طبق من ذهب YPD بأخذ قضيب خشبي عقيمة وإلغاء كمية صغيرة من الخميرة من القنينة و streaking أنه عبر لوحة YPD. احتضان لوحة YPD في 30 درجة مئوية لمدة يومين أو حتى مستعمرات واحدة مرئية. تصحيح بضع مستعمرات واحد على لوحة YPD واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
   ملاحظة: هو سلالة جديدة وضعت هنا لمكتبة البيت فريسة PLY5725 بينما يتم إيواء بعض المكتبات Y2H المتاحة تجارياً متوافقة في Y187.
2. اتبع الإجراءات المذكورة في 3.3.1-3.3.4 لتحويل PLY5725 مع LEU2--على أساس بلازميد تستخدم لإيواء المكتبة الفريسة المنشودة. للمكتبات التي وضعت هنا، هو بلازميد المقابلة pGal4AD (pPL6343). لاسترداد الخميرة ترانسفورمانتس، طبق على لوحات اجتمع المجلس الأعلى للقضاء-لوي. بعد المستعمرات تنشأ، متواصلة كبقع على صفيحة اجتمع المجلس الأعلى للقضاء-لوي واحتضانها ح 24 في 30 درجة مئوية.
3. يتبع البروتوكول في 3-4 لتأكيد التعبير عن pPL6343 باستخدام ناقلات فارغة لمكافحة--ها أجسام [مونوكلونل] أو [بولكلونل] ويصدرون الكشف عن الحل.
4. خط كل من الخميرة PJ69-4A تحول في نمط صليب مع PLY5725 بنيات على لوحة YPD التي تأكدت في التعبير عن البروتين في البروتوكول القسم 3-4 و 4.3 واحتضان عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. فصل تأخذ 1 مم³ للخلايا حيث نمت معا سلالات اثنين والتصحيح على المجلس الأعلى للقضاء-لوي التقى، الحزب المجلس الأعلى للقضاء والمجلس الأعلى للقضاء-الحزب-لوي ألواح وتنمو ح 24.
   ملاحظة: سوف تنمو diploids المرجوة على لوحات لوي-الحزب-المجلس الأعلى للقضاء. النمو في المجلس الأعلى للقضاء-لوي-اجتمع ولوحات الحزب المجلس الأعلى للقضاء بمثابة عنصر إيجابي لنمو الخميرة.
5. ينمو ديبلويدس في 1 مل من المجلس الأعلى للقضاء-الحزب-لوي الوسائط بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. أنبوب الرواسب 500 ميليلتر الخلايا في 1.5 مل ميكروسينتريفوجي في س 2,348 ز، 3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في ميكروسينتريفوجي. تجاهل المادة طافية بواسطة ماصة. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل الماء المعقم وكرر الترسب واستثارة. تحقق OD₆₀₀ من الخلايا.
6. جعل سلسلة من 01:10 تخفيف المسلسل لكل تعليق خلية باستخدام الماء المعقم مع بدء معظم يتركز الحل لكل منهما في التطوير التنظيمي 0.5. بقعة 5 ميليلتر لتمييع كل على طبق من المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب وطبق من المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-صاحب ومن المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-3AT لوحة له +. احتضان عند 30 درجة مئوية وتفتيشها للنمو يوميا على مدى 3 أيام (الشكل 4).
   ملاحظة: بالنسبة 01:10 إضعاف المسلسل، "الماصة؛" 10 ميليلتر من الأنبوب الذي يحتوي على OD 0.5 إلى 90 ميليلتر من الماء ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تواصل بذل 01:10 تخفيف تسلسلي حتى يتوفر ما مجموعة ستة تركيزات مختلفة على الفور.

5-إنشاء السكان الخميرة مع الطعم ومكتبة فريسة

ملاحظة: لا رفيقه سلالة Y187 الذي يضم والبلازميدات مكتبة فريسة التجارية أيضا. وهكذا، أن الشروط الأمثل التالية مطلوبة للحفاظ على الطابع المعقد للمكتبة. PLY5725 سلالة فريسة Y2H التي تحتوي على مكتبات الأصحاب أفضل، ويمكن استخدام نفس الإجراء التزاوج مع هذه السلالة (الشكل 5).

1. تلقيح مل 3 من الثقافات من كل من ترانسفورمانتس PJ69-4A تحمل مختلف TRP1-تتضمن اختطارها بتيف الطعم بلازميد في وسائل الإعلام الراديكالي المجلس الأعلى للقضاء في أنبوب ثقافة. وتشمل ثقافتين منفصلة تحتوي على بلازميد ناقل اختطارها بتيف وحدها لتكون بمثابة الضوابط الإجرائية. احتضان الثقافات عند 30 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة ح 6 وتمييع ثم إلى 25 مل ثقافة في قارورة Erlenmeyer عقيمة للنمو بين عشية وضحاها.
2. ذوبان الجليد قنينة المجمدة (-80 درجة مئوية) من الخلايا التي تحتوي على LEU2ماتالفا-تحمل "فريسة" مكتبة في درجة حرارة الغرفة. تلقيح 125 مل وسائط المجلس الأعلى للقضاء-لوي-اجتمع في قارورة Erlenmeyer عقيمة مع القنينة كاملة المذابة. تنمو جميع الثقافات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة.
   ملاحظة: يلزم OD₆₀₀ الثقافات بين عشية وضحاها تتراوح ما بين 1.0 إلى 1.5 قبل الانتقال إلى الخطوات التالية.
3. الطرد المركزي 21 OD مكافئات لكل الثقافات ترانسفورمانت PJ69-4A مع 5 دقيقة تدور في 4,696 س ز في درجة حرارة الغرفة. لكل 10 ردود فعل التزاوج المطلوب، بيليه 39 OD₆₀₀ مكافئات من سلالة ماتالفا تحمل والبلازميدات مكتبة منفصلة 50 مل من أنابيب مخروطية الشكل.
   1. ريسوسبيند الخلايا في 10 مل الماء المعقم وإعادة بيليه في الجديدة 50 مل من أنبوب مخروطي 4,696 س ز 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في أجهزة الطرد مركزي benchtop. استخدام ماصة، إزالة المادة طافية بلطف دون تعطيل الخلايا الأعلاف.
   2. ريسوسبيند الكريات الخلايا PJ69-4A في 4 مل من والخلايا PLY5725 في 10 مل بيبدا (3.7 درجة الحموضة).
4. لإنشاء إضافة ردود فعل التزاوج، 1 مل من PJ69-4A تحول الخلايا ومل 1 من الخلايا التي تحتوي على مكتبة ماتالفا 1 مل من بيبدا الأس الهيدروجيني 3.7 إلى 50 مل جديدة من أنابيب مخروطية الشكل. احتضان عند 30 درجة مئوية مع الانفعالات مداري لطيف (100-130 لفة في الدقيقة) لمدة 90 دقيقة.
   1. الطرد المركزي خلايا لمدة 5 دقائق في 4,696 س ز، في درجة حرارة الغرفة في أجهزة الطرد مركزي benchtop. إزالة المادة طافية ماصة وريسوسبيند بيليه في 2 مل bYPDA:YPD 1:1. لوحة كل 2 مل من على لوحة YPD 100 ملم ماصة، واحتضان عند 30 درجة مئوية لحوالي 20 ح.
5. حصاد الخلايا من لوحات YPD باستخدام مكشطة خلية إزاحة الخلايا إلى 2-3 مل من المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب وسائل الإعلام. خلايا ماصة فكها إلى 50 مل أنبوب مخروطي. شطف لوحات 4-5 مرات مع 2-3 مل من المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب وسائل الإعلام بيبيتينج حتى وسائل الإعلام استخدام 1000 ميليلتر "الماصة؛" وإخراج الوسائط بلطف عبر سطح لوحة YPD.
   1. الطرد المركزي خلايا لمدة 5 دقائق في 4,696 س ز في درجة حرارة الغرفة في أجهزة الطرد مركزي benchtop. تجاهل المادة طافية بواسطة ماصة وريسوسبيند الخلايا في 40 مل من المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب وسائل الإعلام من بيبيتينج صعودا وهبوطاً (دو لا دوامة).
6. لتقدير عدد الخلايا ضعفاني شكلت، يضعف 4 ميليلتر من خليط النباتات إلى 200 ميليلتر والإعلام المجلس الأعلى للقضاء-الحزب-لوي ميليلتر 2000. لوحة 200 ميليلتر لتمييع كل على طبق من ذهب المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الراديكالي.
   ملاحظة: تمثل لوحات اثنين إضعاف إضعاف المضيفين و 1: 100.000 رصيد diploids المقطوع والغلة مستعمرات المتوقعة ~ 9,000-27,000 على لوحة تمييع المضيفين بعد الحضانة عند 30 درجة مئوية ل h. 36-40 لوحات الاختيار بعد الخطوة 5، 7. مطلوب عدد أدنى من المستعمرات 200 لوحة تمييع المضيفين المضي قدما إلى الخطوة 5، 8
7. أخذ ما تبقى من كل 40 مل من استثارة الخلية على الفور وتلقيح مل 1,000 من قارورة Erlenmeyer الذي يحتوي على 500 مل من المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب وسائل الإعلام. تأخذ التطوير التنظيمي أولى₆₀₀. احتضان هذه قوارير عند 30 درجة مئوية مع الهز 180 لفة في الدقيقة حتى تصل إلى الإشباع (~2.0 OD/mL). هذا يستغرق عادة حوالي 36-40 h. رصد النمو في 24 ساعة ثم مرة أخرى في ح 36 من OD₆₀₀.
8. استخدام ماصة، إزالة 20 مل مختبرين من كل من 500 مل مشبعة للثقافات وتطعيم مل 2,000 من قوارير Erlenmeyer، واحدة تحتوي على 750 مل من المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب وسائل الإعلام وفي الثانية تحتوي على 750 مل من المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-صاحب مع أدنى مستوى من 3AT أن يزيل الخلفية (قرر سابقا في القسم 4-5). مزيج الثقافات الجديدة (770 مل) جيدا بدوامات وتأخذ التطوير التنظيمي أولى₆₀₀.
9. احتضان الثقافات عند 30 درجة مئوية بينما تهز 180 لفة في الدقيقة حتى وصلت إلى التشبع، والذي عادة ما يحدث خلال 24 ساعة للثقافة المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الراديكالي غير محددة ويمكن أن يستغرق أكثر من 70 ح للثقافات ضمن التحديد للتفاعلات Y2H.
10. متى وصلت الثقافات تشبع (OD ~ 2.0)، إزالة 11 مل من ماصة، الرواسب الخلايا مع 5 دقيقة تدور في س 4,696 ز في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل المادة طافية بواسطة ماصة، وتجميد في-20 درجة مئوية أو تستمر على استخراج الحمض النووي. عينات مختارة وغير محددة سواء ستستخدم لتسلسل عميق.

6-نموذج إعداد "تسلسل عميق ديبن"

1. استخراج الحمض النووي.
   1. استخدام ماصة إلى ريسوسبيند الكريات الخلية من قسم البروتوكول 5.7 في 500 ميليلتر صق المخزن المؤقت ونقل إلى 1.5 مل أنبوب ميكروسينتريفوجي. إضافة 3 ميليلتر من بيتاميركابتوثانول و 10 ميليلتر للأوراق المالية زيمولاسي. يخلط جيدا واحتضانها في الحاضنات 37 درجة مئوية ح 24-36.
   2. استخراج العينة مرتين مع 500 ميليلتر الفينول/كلوروفورم/إيسواميل الكحول أثناء استخدام غطاء دخان¹⁶.
   3. إضافة ميليلتر 7 من 4 م كلوريد الصوديوم، ميليلتر 900 الجليد الباردة 100% إيثانول (ETOH)، ومزيج من انعكاس وأما تجميد-20 درجة مئوية، أو تواصل الرواسب الحمض النووي من الغزل في 21,130 س ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في ميكروسينتريفوجي.
   4. تجاهل المادة طافية بواسطة ماصة. أغسل بيليه ثلاث مرات مع ميليلتر 900 70% ETOH.
   5. بيليه 21,130 س ز 2 دقيقة الترسبات وإزالة بقايا ETOH الغسيل بواسطة ماصة. بيليه الجافة لمدة 7 دقائق في 42 درجة مئوية.
   6. ريسوسبيند بيليه في 120 ميليلتر من صق 0.1 x في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، ونفض الغبار أنابيب لخلط كل 30 دقيقة.
   7. "الماصة؛" 60 ميليلتر من الحمض النووي المستخرج في معقم 1.5 مل من أنبوب ميكروسينتريفوجي. إضافة 120 ميليلتر من الظريف، 3.5 ميليلتر رناسي بالمساكن، ونفض الغبار لخلط واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
   8. لكن استخدام الإيثانول متسرعا كما سبق القيام به في قسم 6.1.3-6.1.5، ميليلتر 7 من خلات الأمونيوم م 5 بدلاً من 4 م كلوريد الصوديوم.
   9. ريسوسبيند رناسي تعامل بالحمض النووي في 55 ميليلتر من صق 0.1 x في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، ونفض الغبار أنابيب لخلط كل 30 دقيقة من الحمض النووي كوانتيفي بامتصاص في 260 nm على جهاز المطياف الضوئي.
2. إدراج كدنا PCR.
   1. أداء اثنين، 50 ميليلتر بكر ردود فعل كل عينة الحمض النووي. كل رد يحتوي على 25 بمول لكل إلى الأمام وعكس التمهيدي مطابقة بلازميد فريسة-مكتبة (انظر المواد). ردود الفعل أيضا تحتوي على 25 ميليلتر من x PCR عالية الدقة 2 ميكس ماجستير، 5 ميكروغرام من عينات الحمض النووي، والمياه تصل إلى 50 ميليلتر. أسهب ردود الفعل لدورات 25 مع تمديد أوقات 3 دقيقة في 72 درجة مئوية، ودرجة حرارة أنيل من 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ويشوه عند 98 درجة مئوية يسبق س. 10 ركوب الدراجات جانب تمسخ s 30 98 درجة مئوية والمتابعة مع حضانة 5 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
   2. تحليل 4 ميليلتر بكر كل فعل 1% الحمض النووي [اغروس] هلام التفريد مع الحمض النووي [اغروس] هلام المحتوية على 0.2-0.5 ميكروغرام/مل أتبر¹⁷. تصور عينة الحمض النووي التي تضوء الأشعة فوق البنفسجية. وسوف تظهر عينات مختارة تشويه للحمض النووي حوالي 1-3 كيلو بايت، حيث يمكن إيجاد نمط النطاقات للعينات حيث كان هناك تفاعل Y2H (الشكل 6).
   3. الجمع بين مكررة PCR عينات وتنقية باستخدام أدوات تنقية PCR وفقا لإرشادات الشركة المصنعة وتحديدها كمياً الحمض النووي بامتصاص في 260 nm على جهاز المطياف الضوئي.

7-عمق التسلسل

ملاحظة: إعداد العينة وتعاقب على منصة تسلسل عميق متاح عادة في المرافق الأساسية تسلسل الحمض النووي التجارية والأكاديمية.

1. نغ القص 600 منتج PCR باستخدام الترا عالية أداء-سونيكاتور لإعطاء الشظايا بطول ~ 300 شركة بريتيش بتروليوم.
2. إنشاء تسلسل مفهرس المكتبات باستخدام مجموعة أدوات إعداد لتسلسل العميق أن يضيف linkers ترميز الرموز الشريطية، فتيلة المواقع، والتقاط تسلسل شكل غير متماثل على طرفي الشظايا من الحمض النووي.
3. القيام بإعداد المكتبة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. تجمع فهرسة المكتبات والتسلسل كما يقرأ إقران نهاية فترة طويلة على منصة تسلسل عميق (مثلاً، 2 × 150 ما يلي: بي بي بي). العدد المطلوب من القراءات الموجهة لكل عينة ما بين 10 و 40 مليون، مع أكثر القراءات المطلوبة للسكان غير المحددة التي تكون عادة أكثر تعقيداً. نوصي بما يلي على الأقل 20 مليون أو أكثر للسكان غير محددة.

8-بيوينفورماتيك تجهيز والتحقق

1. الحمض النووي عملية تسلسل البيانات في شكل فستق مع مجموعة من البرامج المستقلة برامج مبنية على (1) خريطة تسلسل قراءة الملفات في تنسيق عالمي سام (2) قياس تخصيب الجينات بين مجموعات البيانات (3) إجراء تحليل إحصائي للبيانات في النظام إلى مرتبة المرشح الذي الجينات إيجابية للتفاعل Y2H (4) تقديم معلومات بشأن ما region(s) وما هو الإطار متعدية الجنسيات كل من كدنا فريسة كل الجينات الشظايا التي تسفر عن إيجابية Y2H وتتكون التفاعلات، و (5) تقديم الأدوات اللازمة لإعادة بناء ليس فقط 5 'بل أيضا 3' نهاية أجزاء متفاعلة فيما بينها مما يسمح إعادة الإعمار والتحقق في شكل Y2H تقليدية. تشغيل هذه البرامج بالتفصيل في الدراسة المرفقة.

النتائج

الإنزيم Y2H وقد استخدمت على نطاق واسع لإيجاد تفاعلات البروتينات: البروتين، وقد وضعت عدة تكييفات ونظم. معظمها، أن نفس الاعتبارات التي تساعد على ضمان نجاح هذه النهج السابقة تعتبر هامة ديبن. بعض المعايير الهامة تشمل: ضمان التعبير عن مجال الحمض النووي ملزم البروتينات الانصها?...

Discussion

هنا نقدم دليل لكيفية إجراء فحوصات Y2H دفعة واحدة باستخدام طرق محسنة. وهناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة في الإجراء للمساعدة على ضمان أن سكان الخميرة التي ستوضع تحت التحديد ممثل مكتبة البداية وأن ما يكفي من السكان الخميرة انطلاق يستخدم الخضوع للتحديد للحد من تقلب . الأهم من ذلك، هذه المقاييس ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Illumina HiSeq 4000	Illumina		deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies	Biolegend	901514	Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies	QED Biosciences Inc	18826	Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI	New England BioLabs	R0191S
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S
BamHI-HF	New England BioLabs	R3236S
XhoI	New England BioLabs	R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder	J.T. Baker	U2211-08
Salmon Sperm DNA	Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific	50-948-286	carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate	Research Products International	K22000
LE Agarose	GeneMate	E-3120-500	used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride	Research Products International	S23025
Tryptone	Research Products International	T60060
D-Sorbitol	Research Products International	S23080
Lithium Acetate Dihydrate	MP Biomedicals	155256
Calcium Chloride	ThermoFisher	C79
EDTA Sodium Salt	Research Products International	E57020
Yeast Extract Powder	Research Products International	Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids	Research Products International	Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE	Formedium	DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE	Formedium	DCS1169
CSM-Leu-Met	Formedium	DCS0549
CSM-Trp-Met	Bio 101, Inc	4520-922
L-Methionine	Formedium	DOC0168
Adenine	Research Products International	A11500
D-(+)-Glucose	Research Products International	G32045
Bacto Agar	BD	214010	used for making media plates in section 1
Peptone	Research Products International	P20240
3-amino-1,2,4 Triazole	Sigma	A8056
2-Mercaptoehanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250
Zymolyase 100T	USBiological	Z1004
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P8281
Phenol:Chloroform:IAA	Ambion	AM9732
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	238074
Ethanol	Decon Laboratories, INC	2716
RNAse A	ThermoFisher	EN0531
Urea	Research Products International	U20200
SDS	Research Products International	L22010
glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Tris-HCl	Gibco	15506-017
bromophenol blue	Amresco	449
Gibson Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5510S	Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541S	Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide	Amresco	0492-5G
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit	KAPA Biosystems	KK8500	preparation kit for deep sequencing
Codon optimization	http://www.jcat.de
Codon optimization	https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks	Integrated DNA Technologies		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings	Thermofisher		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit	EPOCH Life Sciences		Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220	Covaris		high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain	http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436		MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
PLY5725 MATalpha yeast strain	Dr. Robert Piper Lab		MATalpha his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 gal4∆ trp1∆ Gal80∆
pGal4AD (pPL6343)	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes	Kord-Vallmark sold by VWR	2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube	Thermofisher	14-961-33
pipet-aid	Drummond	4-000-100
5 mL Serological Pipette	Denville	P7127
10 mL Serological Pipette	Denville	P7128
25 mL Serological Pipette	Denville	P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker	Fisher Scientific	02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle	Fisher Scientific	06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder	Fisher Scientific	08-572-6G
SpectraMax 190	Molecular Devices		used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000	Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator	Ultra Lum	MEB 20	used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123602G
P200 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123601G
P20 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123600G
P10 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips	GeneMate	P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips	VWR	10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips	VWR	10017-042
50 mL conical tube	VWR	490001-627
15 mL conical tube	VWR	490001-621
cell scraper	Denville Scientific	TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
HCl	Fluka Analytical	318949-1L
NaOH	J.T. Baker	5674-02
Wooden applicators	Solon Care	55900
Eppendorf microcentrifuge 5424	Fisher Scientific	05-400-005	microcentrifuge
Sorvall ST16R	Thermo Fisher Scientific	75004381	benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)	GE Healthcare	NA934-1ML	Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)	GE Healthcare	NA931-1ML	Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Fisher Scientific	34080	ECL detection solution
Isotemp Incubator	Thermo Fisher Scientific		Incubator
Mutitron 2	INFORS HT		Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205	Fisher Scientific		water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)	Clontech	630482	commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)	Clontech	630488	commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector	Clontech	630442	commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector	Clontech	630443	commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase	Bioline	BIO-21042	DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler	BioExpress	P-6050-60	pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes	USA Scientific	1405-8100