Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Özet

Toplu işleme Maya 2-hibrid ekranlarının birden fazla yem protein etkileşim profilleri av füzyon protein son derece karmaşık bir dizi doğrudan karşılaştırma sağlar. Burada, rafine yöntemleri, yeni reaktifler ve bunların kullanımı böyle ekranlar için nasıl açıklar.

Özet

Maya 2-hibrid tahlil kullanarak protein-protein etkileşimleri için tarama uzun etkili bir araç olmuştur ama kullanımı büyük ölçüde son derece etkileşen adaylar Kütüphanesi'ndeki zenginleştirilmiş yüksek benzeşme interactors keşfi için sınırlı olmuştur. Geleneksel bir biçimde düşük benzeşme interactors bulunduğu düşük sıkılık yürütülen çözümlemek için çok fazla kolonileri Maya 2-hibrid tahlil yol açabilir. Ayrıca, farklı yem plazmid karşı aynı Kütüphanesi bir kapsamlı ve eksiksiz sorgulama karşılaştırmalı bir analiz elde edilemez. Her ne kadar bazı bu sorunları dizilmiş av kütüphaneleri kullanarak ele alınabileceği böyle ekranlar çalışması için gereken altyapı ve maliyetini engelleyici olabilir. Alternatif olarak, aynı anda geçici düzinelerce ortaya çıkarmak için Maya 2-hibrid tahlil adapte olması ve bir strateji kullanarak tek bir ekran içinde statik protein etkileşimler olarak adlandırdığı DEEPN (dinamik zenginleştirme değerlendirme Protein ağları için), hangi yüksek işlem hacmi DNA sıralama ve hesaplama etkileşen ortakları kodlamak plazmid nüfusu evrimi takip içerir. Burada, özelleştirilmiş reaktifler ve kolayca ve uygun maliyetli yürütülecek bir DEEPN ekran izin iletişim kurallarını açıklar.

Giriş

Hücre biyolojik süreçlerin tam bir anlayış moleküler mekanizmaları altında yatan protein etkileşim ağları bulmaya dayanır. Protein etkileşimleri tanımlamak için bir yaklaşım iki protein etki alanı ilgi bir başkasına¹bind sonra işleyen chimeric transkripsiyon faktörü birleştirerek çalışır Maya 2-hibrid (Y2H) tahlil olduğunu. Tipik bir Y2H ekran etkileşen proteinler transkripsiyon harekete geçirmek için erimiş kodlama plazmidler her iki bir kütüphane evler Maya nın nüfusu oluşturularak gerçekleştirilir (Örn., 'füzyon protein av') ve protein oluşan bir verilen 'yem' plazmid bir DNA bağlayıcı etki alanına (Örneğin, Gal4 ters yönde aktive dizisine bağlar Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı) ilgi erimiş. Y2H yaklaşım ana avantajlarından biri nispeten kolay ve ucuz tipik bir laboratuarda yapmak rutin moleküler biyolojik iş²için donatılmış olmasıdır. Ancak, geleneksel olarak gerçekleştirildiğinde, bir kullanıcı seçimi olumlu Y2H etkileşimi için üzerine ortaya çıkan bireysel kolonileri örnekler. Bu ciddi bir şekilde anket Kütüphane 'av' klonlar sayısını sınırlar. Belirli bir etkileşen av bolluğu diğerleri düşük bereket av plazmid müdahalesini algılama şansı azalan göre çok yüksek olduğunda bu sorunu bileşik olduğunu.

Proteom kapsamlı kapsama Y2H ilkesini kullanarak için bir çözüm neyin bilinen tek tek av plazmid içeren bir dizi dijital olarak sorguya bir matris biçimli yaklaşım kullanımıdır. Ancak, böyle bir yaklaşım proteinler veya etki alanları³az sayıda interactome tanımlamada ilgilenen bireysel araştırmacılar için kolayca erişilebilir veya maliyet-etkin değil bir altyapı gerektirir. Ayrıca, birden çok parçaya etkileşen proteinlerin kodlamak çok karmaşık av kitaplıkları için pratik boyutları böyle matris dizileri boyutunu artıracağı. Deneyleri karmaşık kütüphaneler ile toplu olarak gerçekleştirmek ve etkileşen klon massive paralel yüksek üretilen iş sıralama⁴kullanan olup olmadığını değerlendirmek için bir alternatiftir. Bu tipik bir kullanarak birden çok koloniler halinde ortaya av plazmidlerin varlığı tahlil uygulanabilir Y2H biçimlendirilmiş hangi Maya hücreleri füzyon protein etkileşen bir çifti konut üzerinde plaka^5,6büyümeye izin yaklaşım. Bu genel bir fikir sorgu her iki birden fazla yem artırmak ve bileşenleri aynı saat^7,8av vurgulu.

Yine de, birçok araştırmalar daha kolay bir henüz daha fazla çaba sadece birkaç protein 'yemler üzerinde' odaklı gerektirir ve daha ayrıntılı ve yarı kantitatif sorgusu, bir tek karmaşık av kütüphane tarafından yararlanabilir. Biz geliştirdik ve geniş ölçekli protein etkileşim çalışmaları toplu biçimi⁴' te bir Y2H ilkesini kullanarak gerçekleştirmek için bir yaklaşım doğrulanmış. Bu belirli av plazmid genişleme hızı Y2H etkileşim⁹göreli gücü için bir proxy sunucu olarak kullanır. Bir nüfus içinde tüm plazmid derin sıralama için normal büyüme tabi veya seçici büyüme koşulları üreten güçlü ve zayıf Y2H etkileşimleri verim klonların tam bir harita. İnteractors repertuar elde edilen ve doğrudan birden fazla yem plazmid karşılaştırılır. DEEPN (Protein ağları değerlendirme için dinamik zenginleştirme) olarak adlandırdığı elde edilen iş akışı böylece fark interactomes proteinler, vs. başka bir protein arasında karşılaştırma izin tanımlamak için aynı av kitaplıklarındaki tanımlamak için kullanılabilir.

Burada, biz DEEPN göstermek ve hangi Şekil 1' de özetlenen onun kullanımını kolaylaştırmak laboratuvar yöntemleri gelişmeler tanıtmak. Önemli iyileştirmeler şunlardır:

Av Maya nüfus nesil. Bir DEEPN anahtar gereksinimleri Maya plazmid av kütüphanelerin aynı dağıtım var farklı yem Plasmid'ler ile nüfus oluşturuyor. Av plazmid Kütüphane eşdeğer taban çizgisi nüfus farklı yemler interactomes arasında doğru karşılaştırmaları yapmak için gereklidir. Bu en iyi zaman bir kütüphane plazmid zaten haploit Maya nüfus içinde yer alan ve verilen yem plazmid nüfus hareketli bir diploid üretmek için çiftleşme tarafından elde elde edilir. Burada, nasıl böyle nüfus haploit Maya yer alan ticari kitaplıklarını kullanma yapmak bir net rehber sağlamak. Her ne kadar diploitler yüksek bir sayı üretmek yöntemleri bulduk, bu ticari kitaplığı içeren maya suşları genel çiftleşme verimliliğini düşüktü. Bu nedenle, biz tepki çiftleşme başına çok daha fazla diploitler verimleri av kitaplıkları ev yeni bir yük inşa.

Yeni yem plazmidler ayarla. Oluşan 'yem' füzyon protein faiz ve DNA'ya bağlanıcı etki alanı protein Hızlı birçok geçerli plazmid 2µ onları onların kopya sayısını yükseltmek için izin, tabanlıdır. Bu kopya sayısı oldukça değişken nüfus ve değişkenlik Y2H transkripsiyon yanıt yol. Bu sırayla yetenek seçimi altında hücre büyüme yanıtı dayalı bir verilen protein etkileşimin gücünü ölçmek için çarpık. Bu kısmen bazıları daha önce piyasada bulunan pDEST32¹⁰gibi tarif var bir düşük kopya plazmid kullanarak adres olabilir. Biz Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı füzyon proteinler de yem parçaları her iki akıntıya karşı klonlama sağlar Kanr direnç geni taşıyan bir TRP1 düşük kopya şeması tabanlı plazmid içinde üreten yeni bir yem plazmid (pTEF-GBD) inşa ve Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanının aşağı akım.

Yeni yüksek yoğunluklu Y2H parçasını kitaplık. Biz ev Y2H av kitaplıklara yeni bir plazmid inşa ve rastgele yamultulmuş genomik DNA parçaları Saccharomyces cerevisiaeyapılan son derece karmaşık bir Y2H kütüphane oluşturmak için kullanılır. Dizi analizi bu kitaplığın 1 milyondan fazla farklı elemanları, yukarıda açıklanan Maya genomik Y2H plazmid kitaplıkları¹¹çok daha karmaşık olduğunu göstermiştir. Bu yeni kütüphane ile DEEPN iş akışı karmaşık kütüphaneleri güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde pek çok farklı Plasmid'ler ile karşılamak için güçlü olduğunu göstermek başardık.

Protokol

1. hazırlanması medya ve plakaları

Not: Tüm plakaları en az 2 gün protokol başlamadan önce yapılması gerekir. Medya herhangi bir noktada yapılabilir. Ancak, arabelleğe alınmış maya ekstresi pepton dekstroz adenin (bYPDA) hangisinin kullanılacağı gün yapılması gerekir. Bazı medya ne genellikle kullanılan daha büyük olan adenin düzeyini içeren bir ek karışımı kullanılarak yapılır. En az medya takviyeleri 10 mg/L adenin belirtin. Etiketli takviyeleri '+ 40Ade' 40 mg/L adenin toplam belirtin.

1. Glikoz çözüm hazırlamak (% 50 w/v). İçin 1 L, D-(+) 500 g çözülür-800 mL distile su bir 1000 mL ölçek glikoz. Bir mezun silindir ve filtre bir steril 1000 mL medya depolama şişe içine bir 0.2 µm steril filtreden kullanmanın 1000 ml ses düzeyini ayarlayın.
2. Maya özü pepton Dekstroz (YPD) tabak hazırlamak. İçin 1 L, 20 g pepton ve 10 g Maya Extract 800 ml distile su bir 1000 mL ölçek geçiyoruz. Mezun silindir içine dökün, 960 mL distile su ile doldurun. 2000 mL Erlenmeyer şişe dökün ve agar 15 g ekleyin. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 40 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. De dönen tarafından karıştırın.
   1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
3. Tam sentetik en az medya (CSM) hazırlamak-Trp plakaları. İçin 1 L, 800 mL distile su bir 1000 mL ölçek içine Maya azot Bankası 6,7 g amino asitler olmadan çözülür. Mezun silindir içine dökün, ilâ 960 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve Trp - 0.7 g ekleyin-çıkarma mix, metiyonin 20 mg ve agar 15 g bir araya geldi. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 40 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. De dönen tarafından karıştırın.
   1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
4. CSM-Leu araya geldi tabak hazırlamak. İçin 1 L, 800 mL distile su bir 1000 mL ölçek içine Maya azot Bankası 10,05 g amino asitler olmadan çözülür. Mezun silindir içine dökün ve ilâ 940 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve 1.005 g - Leu ekleyin-çıkarma mix ve agar 15 g bir araya geldi. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 60 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. De dönen tarafından karıştırın.
   1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
5. CSM-Leu-Trp tabak hazırlamak. İçin 1 L, 800 mL distile su bir 1000 mL ölçek içine Maya azot Bankası 10,05 g amino asitler olmadan çözülür. Mezun silindir içine dökün, ilâ 940 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve 1.005 g - Trp ekleyin-Leu + 40Ade çıkarma mix, adenin 240 mg ve agar 15 gr. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 60 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. De dönen tarafından karıştırın.
   1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
6. CSM-Leu-Trp-O'nun tabak hazırlamak. İçin 1 L, 800 mL distile su bir 1000 mL ölçek içine Maya azot Bankası 10,05 g amino asitler olmadan çözülür. Mezun silindir içine dökün, ilâ 940 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve 0.975 g - Trp ekleyin-Leu-onun + 40Ade çıkarma mix, adenin 240 mg ve agar 15 gr. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 60 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. De dönen tarafından karıştırın.
   1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
7. CSM-Leu-Trp-His-3AT tabak hazırlamak. İçin 1 L, 800 mL distile su bir 1000 mL ölçek içine Maya azot Bankası 10,05 g amino asitler olmadan çözülür. Mezun silindir içine dökün, ilâ 940 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve 0.975 g - Trp ekleyin-Leu-onun + 40Ade çıkarma mix, adenin 240 mg ve agar 15 gr. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 60 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. 3-amino-1,2,4 triazole (3AT) 1 M steril stokunun 100 µL içinde dönen tarafından karıştırın.
   1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
8. LB-Kanr tabak hazırlamak. Erime 10 g Tryptone, Maya 5 g için 1 L, hulâsa ve NaCl 10 g 800 ml distile su bir 1000 mL ölçek. Mezun silindir içine dökün, en fazla 1000 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve agar 15 g ekleyin. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda 50 mg sefaloridin ve dönen tarafından karıştırın.
   1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
9. YPD, CSM-Leu-bir araya geldi, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp ve CSM-Leu-Trp-O'nun ortam hazırlamak. Dışında bir Erlenmeyer şişesi dökme yerine, medya depolama şişe içine dökün ve agar ihmal plakalar için yukarıdaki yordamı kullanın.
10. BYPDA (arabelleğe alınmış YPDA) hazırlayın. Steril YPD medya alıp 200 mg/L adenin steril distile su ekleyin. 3.7 için pH HCl. filtresiyle 0.2 µm steril filtre bir steril şişe içine ayarlayın.
11. Dönüştürme arabelleği hazırlayın: 2 M sorbitol, 1 M Lityum asetat dihydrate, 10 mM Tris pH 7,6, 0,5 mM EDTA, 0.2 mM kalsiyum klorür distile su içinde. 0.2 µm steril filtreden bir steril şişe içine filtre.
12. PEG çözüm hazırlamak: % 70 w/v Polietilen glikol 3350 distile su içinde. Otoklav tarafından sterilize.
13. Dön hazırlayın: 8 M üre, % 4 w/v SDS, 50 mM Tris pH 6.8, % 10 v/v gliserol, distile su %0.02 w/v bromophenol olarak steril mavi.
14. STE (güçlü TE) hazırlamak: 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8.0 distile su içinde. 0.2 µm steril filtreden bir steril şişe içine filtre.
15. Zymolase hisse senedi çözüm hazırlamak: 10 mg/mL Zymolase 100T 50 mM potasyum fosfat dibasic pH 7.5, % 50 v/v gliserol arabellekte steril distile su (-20 ° C'de depolanan).

2. klonlama ve yem plazmid doğrulanması

Not: Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı plazmid inşaatı. Şu anda piyasada bulunan ve akademik olarak kullanılabilir Y2H sistemleri çeşitli vardır. DEEPN protein DNA'ya bağlanıcı etki alanına erimiş ilgi ifade yem plazmid içinde TRP1koşuluyla bunların çoğu karşılamak-plazmid içeren. Diğer aşağı akım gereksinimleri olan sıra hemen akıntıya karşı av Kütüphanesi Ekle bilinir ve bu olumlu Y2H etkileşim His3 üretimini bırakmak için seçim histidin eksik medya tarafından attı. Burada biz yeni Y2H yem plazmid (pTEF-GBD, Şekil 2) nasıl kullanılacağını açıklar, ancak, pGBKT7 de dahil olmak üzere diğer Y2H yem plazmid de kullanılabilir. İnşaat ve yem plazmid değerlendirilmesi için pTEF-GBD kullanımı anlatacağız. Genel bir not olarak, iyi ifade ve klonlama ile kolaylığı sağlamak için Maya kodon önyargı'nin bir açık okuma çerçevesi üretmek için gen sentez öneririz. Klonlama düzeni Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı ile çerçeve ve 3' siteye klonlama zaman bir kodonu yem kodlama bölge izleyen olmak için yem sağlar emin olun.

1. Plazmid vektör hazırlayın. Plazmid pTEF-GBD sağlar ilgi protein kodlama bir parçası klonlama için 5' ya da 3' bir hızlı derleme yöntemiyle Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı kodlama bölgesi. Ekleme 5' sitesinde, pTEF-GBD NarI ve EcoRI ile 3 µg sindirmek veya 3' sitesinde sokmak için BamHI ile sindirmek ve XhoI için 2-4 h. Electrophorese örnek % 1 DNA özel jel içeren 0,2 - 0,5 µg/mL arasında etidyum bromür (EtBr) 100 tüketim kesim 5,630 bp TEF-GBD ve üreticinin yönergelerine uygun olarak bir DNA jel ekstraksiyon kiti kullanarak arındırmak ve 260 absorbans tarafından DNA ölçmek spektrofotometre¹²nm.
   Not: Nesil yem kodlama ekler. Kodlama proteinler DNA parçaları veya protein parçaları ilgi gen sentezi kullanılarak yapılmış ve uncloned parçaları olarak kullanılabilir olabilir. Bu kodon Saccharomyces cerevisiae ifade için en iyileştirilmiş ve çevrimiçi araçlar kodon optimizasyonu için malzeme listesinde bulunan önerilir.
2. 5' için ekleme, ATG başlama kodonu 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 tarafından kodlama DNA parçası kanattan 've 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3', anılan sıraya göre. 3' Gal4 DNA bağlayıcı etki ile çerçeve için ekleme, kodlama parçası 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa tarafından -3 kanat 've 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
3. Plazmid İnşaat için hızlı montaj üreticisinin yönergelerini belirtildiği gibi klonlama parçaları için kesilmiş pTEF GBD uymalısınız.
   1. Tüm E. coli LB-Kanr levhalar değiştirdi ve 16-20 h 37 ° C'de için kuluçkaya plaka PTEF-GBD istenen eklemek ile konut koloniler tarafından PCR güçlendirme oligonucleotides kullanarak belirlenebilir: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' ve 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' ekleme ve 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' ve 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' 3' eklemek için. Bu oligonucleotides de ekleme sıralama için astar olarak hizmet verebilir.
   2. Planı hazırlanması üzerinde > her pTEF-GBD türev ve rahat sıralama ve Maya dönüşümleri malzeme sağlamak için pTEF-GBD 10 µg.
   3. Aşağıdaki PCR koşullar kullanın: 3 dk 98 ° C'de 30 25 döngüsü tarafından takip 98 ° c, 30 s s 55 ° c ve 2 dk 72 ° C'de takip 2.5 mM MgCl₂ içeren bir arabellek kullanarak 72 ° C'de 5 min tarafından , 0.5 U/100 µL DNA polimeraz ve özel tampon.

3. ifade Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı Fusion proteinlerin

1. Yetkili Maya olun.
   1. Çizgi PJ69-4A Maya YPD plaka üzerine dışarı 1 mm³ -80 ° c kazıma steril bir ahşap aplikatör alarak stok ve yavaşça YPD plaka arasında sürtünme donmuş. Ahşap aplikatör her geçişte medya yüzey el değmemiş bir parçası arasında gider plaka taşıyın. YPD plaka 30 ° C'de 2 gün veya tek kolonileri görünür hale gelene kadar kuluçkaya. Donmuş hisse senedi PJ69-4A Maya Maya su veya büyüme medyada askıya alma, DMSO ile % 7 ilave ve-80 ° C'de depolayarak olun
   2. Bir koloni 5 ml steril bir ahşap aplikatör kullanarak bir 20 x 150 mm Kültür tüp YPD kültürünün aşılamak ve gecede 200 devirde titreyen bir kuluçka 30 ° C'de büyür.
   3. YPD 50 mL steril Erlenmeyer şişesi bir 250 ml PJ69-4A Maya zorlanma gecede kültür 4 mL ile aşılamak. 30 ° C arasında için bir optik yoğunluk (OD₆₀₀) 200 d/d, titreyen bir kuluçka standart 1 cm ışık yolu ile spectrophotometry tarafından belirlenen yaklaşık 1,2, büyümek. Büyüme genellikle 5-7 saat sürer.
   4. Maya sedimantasyon konik tüp 4696 x g benchtop santrifüj oda sıcaklığında 5 min için de bir 50 ml tarafından izole et. Süpernatant sıvı atık damping tarafından atmak. Bir pipet kullanarak, Pelet dönüştürme arabelleği ve transfer konik tüp 15 mL 5 ml resuspend. Süpernatant atmak ve dönüştürme arabelleği 1000 µL pipet ile son Hacim 1 ml Maya resuspend için Resediment.
   5. 200 devir / dakikada sallayarak süre Maya hücreleri 30 ° C'de 60 dk için kuluçkaya ve buz 30-90 dakika yerleştirin.
2. Maya plazmid dönüşümü.
   1. 1.5 mL steril microcentrifuge Tüp, pTEF-GBD tabanlı plazmid 1 µg ve 5 µL 10 mg/mL somon sperm taşıyıcı DNA çözüm ekleyin. Ayrıca yalnızca somon sperm taşıyıcı DNA negatif dönüşümü kontrol olarak içeren bir tüp içerir. Buz gibi Maya hücre süspansiyon 100 µL pipet tarafından her tüp için ekleyin. %70 100 µL eklemek bir 1000 µL pipet ve karışımı yavaşça tarafından tüp 5 - 10 kat (yapmak değil girdap) flicking PEG çözümle.
   2. 200 devirde titreyen bir kuluçka için 45 dk 30 ° C'de kuluçkaya.
   3. 15 dakika 42 ° C'de Isı şok.
   4. Tortu 845 x g 3 dakika oda sıcaklığında, microcentrifuge içinde kapalı pipet ve süpernatant atmak, Pelet steril su 150 µL içinde yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend ve bir CSM-Trp plaka yüzey üzerine yayıldı.
   5. 30 ° C kuluçka makinesine plakaları sağ tarafında yukarı yerleştirin ve 2-3 kolonileri görünür hale gelene kadar gün kuluçkaya. Tabak baş aşağı kuluçka için 6-12 h 30 ° C'de sonra plaka yüzeyinde yoğunlaşma önlemek için açık olabilir.
   6. Steril bir kürdan kullanarak CSM-Trp plaka üzerine bir yama olarak dönüştürme ve çizgi başına 2-3 kolonileri alın. 30 ° C'de 24 h için büyümeye izin
3. Lysates protein ifade için yapmak.
   1. CSM-Trp sıvı medya 3 mL maç kafa boyutlu Maya yama ile aşılamak ve gecede bir 20 x 150 mm Kültür tüp 30 ° C'de 200 devir / dakikada sallayarak süre büyür. İki gecede kültür boş pTEF-GBD vektör başı yem olun.
   2. 1 mL YPD CSM-Trp gecede kültür için her 3 mL ekleyin. 30 ° C'de 1 h için 200 devir / dakikada sallayarak süre büyümek. Hücre OD spektrofotometre tarafından kontrol edin.
   3. Tortu OD göre normalize hücreleri, aynı sayıda. Steril 1.5 mL microcentrifuge tüplerinin 2,348 x g bir microcentrifuge oda sıcaklığında bir 5 dk spin ile kullanın. Bir pipet süpernatant iptal etmek için kullanın. Son stok 2.1 OD minimumda karşılık gelir.
      Not: eşdeğer hücre sayısı hesaplanırken, farklı birimlerde her gecede kültür en az 2.1 OD elde etmek için gerekli olabilir oluşabilir.
   4. Pelet 0.2 M NaOH 450 µL içinde yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Hücreler için 2 dk 2,348 x g oda sıcaklığında, recentrifuge ve süpernatant pipet tarafından atın.
   5. Pelet 50 µL dönüş arabelleği ile yukarı ve aşağı dikkatle kabarcıklar yapmak değil gibi pipetting tarafından resuspend. 70 ° C'de 5 min için ısı örnek
4. Protein ifade SDS-sayfa tarafından kontrol edin.
   1. Kullanım bir degrade jel moleküler ağırlık geniş bir ürün yelpazesi sağlamak için % 4-20 çözülebilir. Yük eşit miktarda (aynı OD) örnekleri bir SDS-sayfa içine jel ve değiştirilmemiş pTEF-GBD vektör^13,14,15içeren en az bir örnek eklemeyi unutmayın.
   2. Elektroforetik ayrılıktan sonra nitroselüloz ve anti-myc monoklonal veya poliklonal antikorlar ve ECL algılama çözüm (Şekil 3) kullanan immunoblot jel aktarın.

4. kendi kendine harekete geçirmek Test

1. Steril bir ahşap aplikatör alarak, Maya az miktarda şişeyi dışarı kazıma ve YPD plaka üzerinde çizgiler faiz YPD plaka üzerine av Kütüphanesi konut zorlanma karşılık gelen-80 ° C stoktan çizgi MATalpha Maya dışarı. YPD plaka 30 ° C'de 2 gün veya tek kolonileri görünür hale gelene kadar kuluçkaya. YPD plaka üzerine bir kaç tek kolonileri yama ve gecede 30 ° C'de kuluçkaya
   Not: bazı uyumlu piyasada bulunan Y2H kütüphaneler Y187 içinde saklanır, ancak burada ev av kitaplığına geliştirilen yeni yük PLY5725 olduğunu.
2. 3.3.1 - bölümündeki yordamları izleyin PLY5725 LEU2ile dönüştürmek için 3.3.4-plazmid istenen av kitaplığı barındırmak için kullanılan dayalı. Burada geliştirilen kitaplıkları için karşılık gelen plazmid pGal4AD olduğunu (pPL6343). Maya transformants, CSM-Leu araya geldi tabak tabağa kurtarmak için. Koloniler sonra ortaya çıkan, CSM-Leu araya geldi plaka üzerine yamalar olarak çizgi ve 30 ° C'de 24 h için kuluçkaya
3. Anti boş vektör pPL6343 kullanarak ifade onaylamak için 3,4 protokolünde izleyin-HA monoklonal veya poliklonal antikorlar ve ECL algılama çözüm.
4. Her PLY5725 ile çapraz desende dönüştürülmüş PJ69-4A Maya oluşturur çizgi YPD tabakta Protokolü Bölüm 3.4 ve 4.3 protein ifade etmek ve 30 ° C'de gecede kuluçkaya doğrulandı. Burada iki suşlar birlikte büyüdü ve üzerine yama hücre almak 1 mm³ ayrı CSM-Leu-bir araya geldi, CSM-Trp ve CSM-Trp-Leu plakaları ve 24 h büyümek.
   Not: İstenen diploitler CSM-Trp-Leu tabaklarda büyüyecek. CSM Leu met büyüme ve CSM-Trp tabak maya büyüme için pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir.
5. CSM-Trp-Leu medya gecede 30 ° C'de 1 ml diploitler büyümek 2,348 x g, bir microcentrifuge oda sıcaklığında 3 dk de tortu 500 µL hücreleri microcentrifuge 1,5 ml tüp. Süpernatant pipet tarafından atmak. 1 mL steril su hücrelerde resuspend ve sedimantasyon ve resuspension tekrarlayın. Hücre OD₆₀₀ denetleyin.
6. 1:10 bir dizi çoğu başlangıç ile steril su kullanarak her hücre süspansiyon, seri dilutions yapmak konsantre her 0,5 aşırı doz, çözüm. Her seyreltme CSM-Leu-Trp plaka, CSM-Leu-Trp-O'nun bir tabak ve bir CSM üzerine 5 µL spot-Leu-Trp-onun + 3AT plaka. 30 ° C'de kuluçkaya ve büyüme için incelemek günlük 3 gün içinde (Şekil 4).
   Not: 1:10 için seri seyreltme, tüpün içine su 90 µL aşırı doz 0,5 içeren 10 µL pipet ve mix yukarı ve aşağı pipetting. Toplam altı farklı konsantrasyonlarda noktaya kadar seri dilutions 1:10 yapmaya devam.

5. yem ve av Kütüphane ile Maya nüfus oluşturma

Not: ticari av Kütüphane plazmid evler Y187 zorlanma iyi dostum değil. Bu nedenle, aşağıdaki en iyi duruma getirilmiş koşullar Kütüphane karmaşıklığı korumaları gerekmektedir. PLY5725 strain içeren Y2H av kitaplıkları arkadaşları daha iyi ve aynı çiftleşme prosedür-ebilmek var olmak kullanılmış bu türe (Şekil 5).

1. Her biri çeşitli TRP1taşıyan PJ69-4A transformants kültürleri 3 mL aşılamak-pTEF-GBD yem plazmid CSM-Trp medya bir kültür tüp içeren. Yalnız yordam denetimi olarak hizmet etmek için pTEF-GBD vektör plazmid içeren iki ayrı kültür içerir. Kültürler 30 ° c, 200 rpm 6 h için kuluçkaya ve 25 mL steril bir Erlenmeyer şişesi gecede büyüme için kültür içine oranında seyreltin.
2. LEU2içeren MATalpha hücreler dondurulmuş (-80 ° C) şişe tezcan-"av" Kütüphane, oda sıcaklığında taşıyor. CSM-Leu araya geldi medya ile tamamen çözülmüş flakon steril bir Erlenmeyer şişesi 125 mL aşılamak. Tüm kültürler gecede 30 ° C'de 200 devir / dakikada sallayarak ile büyümek.
   Not: Bir gecede kültür OD₆₀₀ 1.0-1.5 sonraki adımlara geçmeden önce arasındaki aralığı gerekiyor.
3. 21 OD karşılıkları her 4696 x g oda sıcaklığında bir 5 dk spin ile PJ69-4A transformant kültürlerin santrifüj kapasitesi. Her 10 reaksiyonlar çiftleşme için istenen, Pelet 39 OD₆₀₀ eşdeğerleri büyük kütüphane plazmid konik tüpler ayrı 50 mL taşıyan MATalpha yük.
   1. 10 mL steril su hücrelerde ve yeniden cips yeni 50 ml konik tüp 4696 x g 5 dk benchtop santrifüj oda sıcaklığında resuspend. Bir pipet kullanarak, yavaşça süpernatant pelleted hücreleri aksatmadan çıkarın.
   2. Granül 4 mL PJ69-4A hücreleri ve PLY5725 hücre bYPDA (pH 3.7) 10 ml resuspend.
4. Set-up çiftleşme reaksiyonlar, ekleyin 1 mL PJ69-4A hücreleri, MATalpha kitaplığı içeren hücre 1 mL ve 1 mL konik tüp yeni 50 ml bYPDA pH 3.7 dönüştürdü. Nazik yörünge ajitasyon (100-130 devir/dakika) 90 dk ile 30 ° C'de kuluçkaya.
   1. Hücreler için bir benchtop santrifüj oda sıcaklığında 4696 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant pipet tarafından kaldırmak ve Pelet 2 mL 1:1 bYPDA:YPD resuspend. 100 mm YPD levha üzerine tüm 2 mL pipet tarafından plaka ve yaklaşık 20 h 30 ° C'de kuluçkaya.
5. Hücreleri 2-3 mL CSM-Leu-Trp medya çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanarak YPD plakaları hücrelerden hasat. 50 mL konik tüpün yerinden pipet hücrelere. 4 - 5 kere ile 2-3 mL CSM-Leu-Trp medya tabak 1000 µL kullanarak ortamın pipet yukarı pipetting ve yavaşça YPD plaka yüzeyi boyunca ortam çıkarma tarafından durulayın.
   1. Hücreler için bir benchtop santrifüj oda sıcaklığında 4696 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant pipet tarafından atın ve 40 mL CSM-Leu-Trp medya hücrelerde (yapmak değil girdap yukarı ve aşağı) pipetting tarafından resuspend.
6. Oluşan diploit hücre sayısını tahmin etmek için 200 µL ve 2000 µL CSM-Trp-Leu medya diploit karışımı 4 µL sulandırmak. Her seyreltme CSM-Leu-Trp plaka üzerine 200 µL plaka.
   Not: 1:10,000 ve 1:100,000 kat seyreltme hasat ve beklenen ~ 9.000-27.000 koloniler 1:10,000 seyreltme plaka üzerinde 36-40 h. için 30 ° C'de kuluçka sonra onay plakaları adımdan sonra 5,7 verimli diploitler stokunun iki tabak temsil ediyor. 200 koloniler 1:10,000 seyreltme plaka üzerinde en az sayıda adım 5,8 devam etmek için gerekli
7. Hemen her 40 mL cep resuspension de geri kalanını al ve Erlenmeyer şişe 500 mL CSM-Leu-Trp medya içeren bir 1000 mL aşılamak. Bir ilk OD₆₀₀al. Doygunluk (~2.0 OD/mL) ulaşana kadar 180 rpm'de sallayarak ile bu şişeler 30 ° C'de kuluçkaya. Bu genellikle yaklaşık 36-40 h. monitör büyüme 24 h sonra tekrar 36 h OD₆₀₀tarafından alır.
8. Bir pipet kullanarak her kültür ve innoculate Erlenmeyer şişeler, bir içeren 750 mL CSM-Leu-Trp medya ve ikinci içeren 750 mL CSM-Leu-Trp-O'nun 3AT en düşük düzeyi olan 2000 mL doymuş 500 mL aliquots 20 mL kaldırmak bu arka plan (daha önce belirlenen Bölüm 4.5) ortadan kaldırır. Yeni kültürler (770 mL) de dönen tarafından mix ve bir ilk OD₆₀₀al.
9. 30 ° C'de kültürler genellikle seçili olmayan CSM-Leu-Trp kültür için 24 saat içinde ortaya çıkar ve 70 h altında seçim Y2H etkileşimleri için kültürler için üzerinden alabilir doygunluk erişene dek 180 rpm'de sallayarak süre kuluçkaya.
10. Kültürler Doygunluk (OD ~ 2.0) alabilirseniz, 11 mL pipet, tortu 4696 x g oda sıcaklığında bir 5 dk spin hücrelerle kaldırmak, süpernatant pipet, atmak ve -20 ° C'de dondurmak veya DNA ekstraksiyon devam. Seçili ve seçili olmayan örnekleri her ikisi de derin sıralama için kullanılır.

6. numune hazırlama DEEPN derin sıralama için

1. DNA ekstraksiyon.
   1. Hücre çökeltilerini Protokolü Bölüm 5,7 500 µL sTE arabellek ve transfer microcentrifuge tüp 1.5 mL resuspend için bir pipet kullanın. Betamercaptoethanol 3 µL ve Zymolase stokunun 10 µL ekleyin. Mix iyi ve 24-36 h 37 ° C kuluçka kuluçkaya.
   2. İki kez 500 µL fenol/kloroform/izoamil alkol ile örnek bir duman hood¹⁶kullanırken ayıklayın.
   3. 4 M NaCl 7 µL, buz gibi % 100 etanol (alkol), mix INVERSION tarafından ve her iki donma sıcaklığı-20 ° C 900 µL ekleyin veya tortu DNA iplik 21,130 x g bir microcentrifuge oda sıcaklığında 10 dakika için de tarafından devam edin.
   4. Süpernatant pipet tarafından atmak. Pelet 900 µL % 70 ile üç kez yıkayın alkol.
   5. Tortu 21,130 x g 2 min için cips ve artık alkol yıkama tarafından pipet kaldırın. 7 dk. 42 ° C'de için kuru Pelet
   6. 0.1 x sTE için 90 dk 37 ° C su banyosunda 120 µL Pelet resuspend, her 30 dakikada karıştırmak için tüpler hafifçe vur.
   7. Ayıklanan DNA'ın 60 µL microcentrifuge tüp steril bir 1,5 mL pipet. STE, 3,5 µL RNase A stok, mix ve 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya flick 120 µL ekleyin.
   8. Daha önce bölümü 6.1.3 - 6.1.5, yaptığımız etanol çökelti ama 4 M NaCl yerine 5 M amonyum asetat 7 µL kullanın.
   9. 0.1 x sTE için 90 dk 37 ° C su banyosunda 55 µL RNase A tedavi DNA resuspend, 260 absorbans tarafından her 30 dk. miktarını DNA karıştırmak için tüpler fiske nm bir spektrofotometre üzerinde.
2. PCR cDNA ekler.
   1. İki DNA örneği başına 50 µL PCR reaksiyonları gerçekleştirin. Her reaksiyon 25 pmol av-Kütüphane plazmid eşleşen her ileriye ve geriye doğru astar içerir (malzemeleri görmek). Reaksiyonlar da High-Fidelity 2 x PCR Master Mix, DNA örneği, 5 µg 25 µL içerir ve en fazla 50 µL. genişletme reaksiyonlar uzantısı kez 3 dk 72 ° c, anneal sıcaklık 30 55 ° c ile 25 devir için su s ve 10 s. Precede için 98 ° C'de denaturing Bisiklete binme bir 30 s denatürasyon 98 ° C ve takip ile 72 ° C'de 5 dk kuluçka tarafından
   2. 4 analiz µL % 1 DNA özel jel elektroforez ile DNA özel tarafından her PCR reaksiyon jel içeren 0,2 - 0,5 µg/mL EtBr¹⁷. DNA örneği tarafından UV transillumination gözünün önüne getir. Örnekleri DNA yaklaşık 1-3 kb, bantlama deseni örnekleri için Y2H etkileşim neredeydi bulunduğu bir smear (Şekil 6) seçili gösterir.
   3. Yinelenen PCR örnekleri birleştirmek ve üreticinin yönergelerine uygun olarak PCR arıtma seti kullanarak arındırmak ve 260 absorbans tarafından DNA ölçmek nm bir spektrofotometre üzerinde.

7. derin sıralama

Not: Numune hazırlama ve sıralamanın bir derin sıralama platformda genellikle ticari ve akademik DNA sıralama çekirdek tesislerde kullanılabilir.

1. Yamultma 600 ng bir ortalama uzunluğu ~ 300 fragments vermek için bir yüksek performanslı ultra-sonicator kullanarak PCR ürününün bp.
2. Barkodlar, kodlama bağlayıcı siteleri, priming ekler derin sıralama için bir hazırlık seti kullanarak Dizin oluşturulmuş sıralama kitaplıkları oluşturmak ve dizileri asimetrik olarak DNA parçalarının uçlarını yakalamak.
3. Kütüphane hazırlık üretici yönergelerine göre gerçekleştirin. Havuzu kütüphaneler ve dizi uzun eşleştirilmiş uç okuma bir derin sıralama platformda (Örneğin, 2 x 150 bp PE okuma) olarak dizine. 10 ve daha fazla okuma genellikle daha karmaşık seçili olmayan nüfus için istenen ile 40 milyon arasında istenen okuma sayısı, her örnek için hedef olduğunu. Seçili olmayan nüfus için en az 20 milyon veya daha fazla okuma öneririz.

8. Bioinformatic işleme ve doğrulama

1. Tek başına yazılım programları (1) sıra eşlemek için inşa dosyaları bir evrensel SAM biçiminde (2) ölçmek okumak bir dizi ile fastq formundaki verileri sıralama işlemi DNA gen zenginleştirme arasında veri (3) verileri istatistiksel analizi gerçekleştirmek hangi aday gen sıralaması için sipariş Y2H etkileşim () 4 olumlu) ne region(s) ve ne translasyonel çerçevesinde her av cDNA gen başına bu parçaları oluşur etkileşimler vardır olumlu Y2H verim bilgi ve (5) sağlamak sağlamak sadece 5' aynı zamanda onların yeniden yapılanma ve doğrulama geleneksel bir Y2H biçimde izin etkileşen parçaları 3' sonunda yeniden oluşturmak için araçlar. Bu programların çalışması eşlik eden çalışmada detaylı.

Sonuçlar

Y2H tahlil protein: protein etkileşimleri bulmak için yaygın olarak kullanılmaktadır ve çeşitli uyarlamalar ve sistemleri geliştirilmiştir. Çoğunlukla, bu önceki yaklaşımlar ile başarı sağlamak aynı konuları DEEPN için önemlidir. Bazı önemli kriterler şunlardır: Füzyon protein, sahte düşük bir arka plan onun + ilgi bir boş av plazmid, yem yüksek bir çiftleşme verimliliği ile yem içeren diploitler artış sağlanması ifade DNA'ya bağlanıcı etki alanı...

Tartışmalar

Burada bir rehber en iyi duruma getirilmiş yöntemleri kullanarak toplu iş iş işlemde Y2H deneyleri gerçekleştirmeye ilişkin sağlamak. Halkın seçimi altında gelebileceğini söyledi Maya başlangıç Kütüphane temsilcisidir ve yeterli başlangıç Maya nüfusun bu değişkenliği sınırlamak için seçim geçmesi için kullanılan emin olmak için yordamda birkaç kritik adım vardır . Önemlisi, bu kriterler geleneksel bir Y2H yöntemi, böylece bu yaklaşım çoğu laboratuvarlar için standart moleküle...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Illumina HiSeq 4000	Illumina		deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies	Biolegend	901514	Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies	QED Biosciences Inc	18826	Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI	New England BioLabs	R0191S
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S
BamHI-HF	New England BioLabs	R3236S
XhoI	New England BioLabs	R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder	J.T. Baker	U2211-08
Salmon Sperm DNA	Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific	50-948-286	carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate	Research Products International	K22000
LE Agarose	GeneMate	E-3120-500	used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride	Research Products International	S23025
Tryptone	Research Products International	T60060
D-Sorbitol	Research Products International	S23080
Lithium Acetate Dihydrate	MP Biomedicals	155256
Calcium Chloride	ThermoFisher	C79
EDTA Sodium Salt	Research Products International	E57020
Yeast Extract Powder	Research Products International	Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids	Research Products International	Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE	Formedium	DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE	Formedium	DCS1169
CSM-Leu-Met	Formedium	DCS0549
CSM-Trp-Met	Bio 101, Inc	4520-922
L-Methionine	Formedium	DOC0168
Adenine	Research Products International	A11500
D-(+)-Glucose	Research Products International	G32045
Bacto Agar	BD	214010	used for making media plates in section 1
Peptone	Research Products International	P20240
3-amino-1,2,4 Triazole	Sigma	A8056
2-Mercaptoehanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250
Zymolyase 100T	USBiological	Z1004
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P8281
Phenol:Chloroform:IAA	Ambion	AM9732
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	238074
Ethanol	Decon Laboratories, INC	2716
RNAse A	ThermoFisher	EN0531
Urea	Research Products International	U20200
SDS	Research Products International	L22010
glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Tris-HCl	Gibco	15506-017
bromophenol blue	Amresco	449
Gibson Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5510S	Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541S	Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide	Amresco	0492-5G
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit	KAPA Biosystems	KK8500	preparation kit for deep sequencing
Codon optimization	http://www.jcat.de
Codon optimization	https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks	Integrated DNA Technologies		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings	Thermofisher		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit	EPOCH Life Sciences		Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220	Covaris		high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain	http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436		MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
PLY5725 MATalpha yeast strain	Dr. Robert Piper Lab		MATalpha his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 gal4∆ trp1∆ Gal80∆
pGal4AD (pPL6343)	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes	Kord-Vallmark sold by VWR	2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube	Thermofisher	14-961-33
pipet-aid	Drummond	4-000-100
5 mL Serological Pipette	Denville	P7127
10 mL Serological Pipette	Denville	P7128
25 mL Serological Pipette	Denville	P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker	Fisher Scientific	02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle	Fisher Scientific	06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder	Fisher Scientific	08-572-6G
SpectraMax 190	Molecular Devices		used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000	Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator	Ultra Lum	MEB 20	used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123602G
P200 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123601G
P20 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123600G
P10 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips	GeneMate	P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips	VWR	10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips	VWR	10017-042
50 mL conical tube	VWR	490001-627
15 mL conical tube	VWR	490001-621
cell scraper	Denville Scientific	TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
HCl	Fluka Analytical	318949-1L
NaOH	J.T. Baker	5674-02
Wooden applicators	Solon Care	55900
Eppendorf microcentrifuge 5424	Fisher Scientific	05-400-005	microcentrifuge
Sorvall ST16R	Thermo Fisher Scientific	75004381	benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)	GE Healthcare	NA934-1ML	Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)	GE Healthcare	NA931-1ML	Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Fisher Scientific	34080	ECL detection solution
Isotemp Incubator	Thermo Fisher Scientific		Incubator
Mutitron 2	INFORS HT		Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205	Fisher Scientific		water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)	Clontech	630482	commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)	Clontech	630488	commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector	Clontech	630442	commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector	Clontech	630443	commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase	Bioline	BIO-21042	DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler	BioExpress	P-6050-60	pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes	USA Scientific	1405-8100