酵母 2-混合筛在批次中比较蛋白质相互作用

摘要

酵母 2-混合筛的分批处理可以直接比较多饵蛋白与高度复杂的猎物融合蛋白的相互作用。在这里, 我们描述了精制方法, 新试剂, 以及如何实现这些屏幕的使用。

摘要

用酵母 2-杂交法筛选蛋白质-蛋白质相互作用长期以来一直是一个有效的工具, 但它的使用在很大程度上仅限于发现高亲和性的 interactors 在互动的候选库中高度丰富。以传统的形式, 酵母 2-杂交试验可以产生太多的菌落分析时进行低严格的, 在那里可能发现低亲和 interactors。此外, 如果没有对同一图书馆进行全面和彻底的讯问, 对不同的诱饵质粒, 就无法进行比较分析。虽然这些问题中的一些可以使用阵列的牺牲品库来解决, 但操作此类屏幕所需的成本和基础设施却是令人望而却步的。作为替代, 我们已经适应了酵母 2-杂交检测, 同时发现在一个单一的屏幕上的许多瞬态和静态蛋白质相互作用的一个战略称为 DEEPN (动态富集评估蛋白质网络), 这采用高通量 DNA 测序和计算来跟踪编码相互作用伙伴的质粒种群的进化。在这里, 我们描述了定制的试剂和协议, 使 DEEPN 屏幕易于执行和经济高效。

引言

对细胞生物学过程的完全理解依赖于寻找其分子机制基础的蛋白质相互作用网络。一种识别蛋白质相互作用的方法是酵母 2-杂交 (Y2H) 法, 它通过组装一个功能的嵌合体转录因子, 一旦两个感兴趣的蛋白质领域绑定到另一个¹。一个典型的 Y2H 屏幕是通过创建一个酵母种群, 它既可以将相互作用的蛋白质的质粒库编码成转录激活剂 (e. g, "猎物" 融合蛋白) 和由蛋白质组成的给定的 "诱饵" 质粒。的兴趣融合到 dna 绑定域 (例如, 绑定到 Gal4-upstream 激活序列的 Gal4 DNA 绑定域)。Y2H 方法的一个主要优点是, 在为常规分子生物学工作配备的典型实验室中, 进行²是相对容易和廉价的。但是, 当传统上执行时, 用户会对在选择时出现的单个菌落进行正面 Y2H 交互的采样。这严重限制了可以调查的图书馆 "猎物" 克隆的数量。当一个特定的相互作用的猎物的丰度相对于其他捕食者非常高时, 这一问题就会复杂化, 从而减少了从低丰度猎物质粒中检测相互作用的几率。

在蛋白质组的综合覆盖范围内使用 Y2H 原理的一个解决方案是使用矩阵格式化的方法, 其中包含已知单个猎物质粒的阵列可以进行数字审问。但是, 这种方法需要的基础结构对于那些有意定义少量蛋白质或域³的 interactome 的个体调查人员来说是不容易接近或成本效益高的。此外, 非常复杂的猎物库, 可能编码多个相互作用的蛋白质片段, 将扩大这种矩阵数组的大小不切实际的大小。另一种方法是在批次中执行复杂库的检测, 并使用大规模并行高通量排序⁴评估交互克隆的存在。这可以用来检测在多个殖民地出现的猎物质粒的存在, 使用典型的 Y2H 格式化的方法, 其中酵母细胞外壳的相互作用对融合蛋白被允许生长在一个板块^5,6。这一总体思路可以增强, 以增加对多个诱饵和猎物组件的查询, 同时^7,8。

尽管如此, 许多调查还是需要更简单、更专注于少量蛋白质 "诱饵" 的努力, 并且可以通过对单个复杂的猎物库进行详尽而半定量的查询来获得更多的好处。我们已经开发并验证了一种使用 Y2H 原则在批处理格式⁴中执行广泛的蛋白质交互研究的方法。这使用特定的猎物质粒的膨胀率作为 Y2H 交互作用的相对强度的代理⁹。在正常生长或选择性生长条件下, 在种群内的所有质粒的深度测序生成完整的克隆, 产生强弱的 Y2H 相互作用。interactors 可以在多个诱饵质粒中得到和直接比较。由此产生的工作流称为 DEEPN (对蛋白质网络进行动态富集评估), 因此可以用来识别同一个猎物库中的差异 interactomes, 以确定蛋白质, 从而使一种蛋白质与另一种蛋白进行比较。

在这里, 我们演示了 DEEPN, 并介绍了有助于其使用的实验室方法的改进, 其中概述了图 1。重大改进包括:

捕食酵母种群的生成.DEEPN 的关键要求之一是产生不同饵料质粒的酵母种群, 它们的粒细胞分布相同。捕食质粒库的等效基线种群对不同饵料的 interactomes 进行精确比较是必不可少的。这是最好的实现, 当一个图书馆的质粒已经安置在单倍体酵母种群和移动一个给定的诱饵质粒进入该人群是通过交配产生一个倍。在这里, 我们提供了一个明确的指南, 如何使这些人口使用的商业图书馆在单倍体酵母。虽然我们发现了产生大量 diploids 的方法, 但这些含有酵母菌的商业文库的整体交配效率却很低。因此, 我们构造了一种新的应变, 可以使猎物库产生更 diploids 的每一个交配反应。

新的诱饵质粒集。许多目前表达 "诱饵" 融合蛋白的质粒是由感兴趣的蛋白质和 DNA 结合的领域组成的, 2µ, 允许它们放大其拷贝数。这个拷贝数在人口中可能是相当可变的并且导致变异在 Y2H 转录反应。这反过来可能会扭曲的能力, 以衡量一个特定的蛋白质相互作用的强度, 根据细胞的生长反应的选择。这可以通过使用低拷贝质粒来部分解决, 其中一些以前曾被描述为商业上可用的 pDEST32¹⁰。我们构建了一种新的诱饵质粒 (pTEF GBD), 在TRP1着丝粒基低拷贝质粒中产生 Gal4-DNA-binding 域融合蛋白, 携带 Kanr 抵抗基因, 同时也允许克隆上游和Gal4 DNA 结合领域的下游。

新的高密度 Y2H 片段库.我们构建了一个新的质粒来 Y2H 猎物库, 并利用它建立一个高度复杂的 Y2H 图书馆由随机剪切片段的基因组 DNA 从酿酒酵母。序列分析表明, 该库有100万多个不同的元素, 远比以前描述的酵母基因组 Y2H 质粒库¹¹复杂得多。通过这个新的库, 我们能够证明 DEEPN 工作流足够健壮, 能够以可靠和可重现的方式容纳许多不同质粒的复杂库。

研究方案

1. 介质和板材的制备

注: 在开始该协议之前, 所有的盘子需要做最少2天。媒体可以在任何时候进行。然而, 缓冲酵母萃取蛋白胨葡萄糖腺嘌呤 (bYPDA) 需要做的日子, 将使用它。一些媒体是使用一个补充组合, 其中含有腺嘌呤水平大于通常使用。大多数最小的培养基补充剂指定10毫克/升腺嘌呤。标签为 ' + 40 艾德 ' 的补充剂指定总共40毫克/升腺嘌呤。

1. 准备葡萄糖溶液 (50% 瓦特/v)。1 L, 在1000毫升烧杯中溶解800毫升蒸馏水中的 d-(+) 葡萄糖500克。调整体积到1000毫升使用一个毕业的圆筒和过滤通过一个0.2 µm 无菌过滤器成一个无菌1000毫升介质储存瓶。
2. 制备酵母提取物蛋白胨葡萄糖 (YPD) 板。1 L, 在1000毫升烧杯中溶解20克的蛋白胨和10克的酵母萃取物在800毫升蒸馏水中。倒入一个毕业的圆筒, 用蒸馏水填满960毫升。倒入2000毫升锥形瓶, 加入15克琼脂。高压釜和冷却在37°c 水浴直到水浴温度冷却了到大约 42-50 °c。使用吸管添加40毫升50% 葡萄糖。用旋转的混合好。
   1. 用吸管倒入100毫米的20毫升培养基。
3. 准备完整的合成最小介质 (CSM)-多金属板。1 L, 在1000毫升烧杯中溶解6.7 克的酵母氮基, 而不含氨基酸为800毫升蒸馏水。倒入一个已毕业的圆筒, 用蒸馏水填满960毫升的水。倒入2000毫升的锥形瓶, 并添加 0.7 g 的-多党人满足的辍学混合, 20 毫克的蛋氨酸, 15 克的琼脂。高压釜和冷却在37°c 水浴直到水浴温度冷却了到大约 42-50 °c。使用吸管添加40毫升50% 葡萄糖。用旋转的混合好。
   1. 用吸管倒入100毫米的20毫升培养基。
4. 准备 CSM-列伊-满足板块。1 L, 在1000毫升烧杯中溶解10.05 克的酵母氮基, 而不含氨基酸为800毫升蒸馏水。倒入一个毕业的圆筒和填充940毫升的蒸馏水。倒入2000毫升的锥形烧瓶中, 加入1.005 克列伊-满足的辍学混合和15克琼脂。高压釜和冷却在37°c 水浴直到水浴温度冷却了到大约 42-50 °c。使用吸管添加60毫升50% 葡萄糖。用旋转的混合好。
   1. 用吸管倒入100毫米的20毫升培养基。
5. 准备 CSM-列伊多党板块。1 L, 在1000毫升烧杯中溶解10.05 克的酵母氮基, 而不含氨基酸为800毫升蒸馏水。倒入一个已毕业的圆筒, 用蒸馏水填满940毫升的水。倒入2000毫升的锥形瓶, 并添加 1.005 g 的 Leu+40Ade 的辍学混合, 240 毫克腺嘌呤和15克的琼脂。高压釜和冷却在37°c 水浴直到水浴温度冷却了到大约 42-50 °c。使用吸管添加60毫升50% 葡萄糖。用旋转的混合好。
   1. 用吸管倒入100毫米的20毫升培养基。
6. 准备好他的盘子1 L, 在1000毫升烧杯中溶解10.05 克的酵母氮基, 而不含氨基酸为800毫升蒸馏水。倒入一个已毕业的圆筒, 用蒸馏水填满940毫升的水。倒入2000毫升的锥形瓶, 并添加 0.975 g 的 Leu-His+40Ade 的辍学混合, 240 毫克腺嘌呤和15克的琼脂。高压釜和冷却在37°c 水浴直到水浴温度冷却了到大约 42-50 °c。使用吸管添加60毫升50% 葡萄糖。用旋转的混合好。
   1. 用吸管倒入100毫米的20毫升培养基。
7. 准备 CSM-Leu-Trp-His-3AT 板。1 L, 在1000毫升烧杯中溶解10.05 克的酵母氮基, 而不含氨基酸为800毫升蒸馏水。倒入一个已毕业的圆筒, 用蒸馏水填满940毫升的水。倒入2000毫升的锥形瓶, 并添加 0.975 g 的 Leu-His+40Ade 的辍学混合, 240 毫克腺嘌呤和15克的琼脂。高压釜和冷却在37°c 水浴直到水浴温度冷却了到大约 42-50 °c。使用吸管添加60毫升50% 葡萄糖。混合100µL 1 米无菌库存的3氨基-12, 4 三唑 (3AT) 旋转。
   1. 用吸管倒入100毫米的20毫升培养基。
8. 准备 LB Kanr 板。1 L, 在800毫升烧杯中溶解10克胰蛋白胨、5克酵母萃取物和10克氯化钠在1000毫升蒸馏水中。倒入一个已毕业的圆筒, 用蒸馏水填满1000毫升的水。倒入2000毫升的锥形瓶, 加入15克琼脂。高压釜和冷却在37°c 水浴直到水浴温度冷却了到大约 42-50 °c。加入50毫克卡那霉素, 混合旋转。
   1. 用吸管倒入100毫米的20毫升培养基。
9. 准备 YPD, 列伊会谈, csm-激进党, csm-列伊激进党和 csm-列伊激进党-他的媒体。使用上面的程序板, 除了不倒入锥形瓶, 倒入一个媒体储存瓶和省略琼脂。
10. 准备 bYPDA (缓冲 YPDA)。服用无菌 YPD 培养基, 在无菌蒸馏水中加入200毫克/升腺嘌呤。将 pH 值调整为 3.7, 用 HCl 将0.2 µm 无菌过滤器过滤成无菌瓶。
11. 准备转换缓冲器: 2 米山梨醇, 1 米醋酸锂, 10 毫米三 pH 7.6, 0.5 毫米 EDTA, 蒸馏水中的0.2 毫米氯化钙。通过0.2 µm 无菌过滤器过滤成无菌瓶。
12. 准备 PEG 溶液: 70% 瓦特/v 聚乙二醇3350在蒸馏水。用高压釜消毒。
13. 准备旋转: 8 米尿素, 4% 瓦特/v SDS, 50 毫米三 pH 6.8, 10% 伏/v 甘油, 0.02% 瓦特/v 溴酚蓝色在无菌蒸馏水。
14. 准备 (强 TE):50 毫米三, 20 毫米 EDTA, pH 8.0 在蒸馏水。通过0.2 µm 无菌过滤器过滤成无菌瓶。
15. 准备 Zymolase 库存解决方案:10 毫克/毫升 Zymolase 100T 在50毫米磷酸钾二元 pH 7.5, 50% 伏/v 甘油缓冲在无菌蒸馏水 (储存在-20 °c)。

2. 诱饵质粒的克隆和鉴定

注: Gal4-DNA-binding 领域质粒的构建。目前, 有各种各样的商业可用和学术上可用的 Y2H 系统。DEEPN 可以容纳其中的许多, 条件是, 表达感兴趣的蛋白质的诱饵质粒被融合到 DNA 结合域中, 是在含有TRP1的质粒中。其他下游要求是已知的, 在猎物库插入的上游序列是众所周知的, 一个积极的 Y2H 互动可以通过生产 His3, 允许选择的媒体缺乏组氨酸。在这里, 我们将描述使用一个新的 Y2H 诱饵质粒 (pTEF-GBD,图 2), 但是, 其他 Y2H 诱饵粒, 包括 pGBKT7 也可以使用。对于诱饵质粒的构建和评价, 我们将描述 pTEF-GBD 的使用。作为一般的说明, 我们建议基因合成, 以产生一个开放阅读框架, 坚持酵母密码子的偏见, 以帮助确保良好的表达和易于克隆。确保克隆方案允许诱饵与 Gal4 DNA 结合的领域内帧, 当克隆到 3 ' 站点, 一个停止密码子跟踪诱饵编码区域。

1. 制备质粒载体。质粒 pTEF-GBD 允许克隆一个片段编码的兴趣蛋白 5 ' 或 3 ' 的区域编码的 Gal4 DNA 结合领域使用快速组装方法。在 5 ' 站点上插入, 文摘3µg pTEF-GBD 与纳莉和 EcoRI 或为插入在 3 ' 站点, 消化与 BamHI 和 XhoI 2-4 h. Electrophorese 样品在1% 个脱氧核糖核酸琼脂糖凝胶包含 0.2-0.5 µg/毫升溴溴 (EtBr) 在 100 v. 消费削减 5630 bp 毒性当量因子-GBD 和纯化使用 dna 凝胶萃取试剂盒根据制造商的指示和量化 DNA 的吸收率在 260 nm 的分光^光度计12。
   注: 生成诱饵编码插入。DNA 片段编码的蛋白质或蛋白质片段的兴趣可以利用基因合成和可用作为 uncloned 片段。建议在酿酒酵母中对密码子进行最佳表达, 并将密码子优化的在线工具包括在材料列表中。
2. 对于 5 ' 插入, 侧面的 DNA 片段编码一个 ATG 开始密码子由 5 '-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 ' 和 5 '-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3 ', 分别。对于 3 ' 插入帧与 Gal4 DNA 结合域, 侧面编码片段由 5 '-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 ' 和 5 '-tagtaactagcataaccccttggggcc-3 '。
3. 对于质粒结构, 请按照制造商指示的快速装配方法将片段克隆成切 pTEF-GBD。
   1. 板块全部转化为 16-20 小时, 在37摄氏度的 Kanr 板和孵化. 殖民地住房 pTEF-GBD 与所需的插入可以通过 PCR 扩增, 使用寡核苷酸: 5 '-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' 和 5 '-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC 3 ' 为 5 ' 插入和 5 '-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3 ' 和5 '-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3 ' 为 3 ' 插入。这些寡核苷酸也可以作为排序插入的引物。
   2. 规划每 pTEF GBD 衍生物和 pTEF GBD 的制备 > 10 µg, 为测序和酵母转变提供材料。
   3. 使用以下 PCR 条件: 3 分钟在98°c, 跟随25个周期三十年代在98°c, 三十年代在55°c 和 2 min 在72°c, 跟随5分钟在72°c 使用包含2.5 毫米氯化镁₂的缓冲区, 0.5 U/100 µL DNA 聚合酶和专有缓冲器。

3. Gal4-DNA-binding 域融合蛋白的表达

1. 制作合格的酵母。
   1. 通过服用无菌的木制涂抹器, 将 PJ69-4A 酵母 YPD 板上, 刮1毫米³的-80 °c 冷冻库存, 并轻轻地擦过 YPD 板。将木制的涂抹器移下盘子, 使每个通行证穿过介质表面的未触及部分。将 YPD 板孵育30°c 2 天, 或直到单个菌落可见。在水或生长培养基中悬浮酵母, 使 PJ69-4A 酵母冷冻储存, 补充亚砜为 7%, 贮存于-80 摄氏度。
   2. 接种一个单一的殖民地在5毫升的文化 YPD 在一个20毫米 x 150 毫米培养管使用无菌的木制涂抹器和在30°c 隔夜增长在一个震动孵化器在 200 rpm。
   3. 在250毫升的无菌锥形瓶中接种50毫升的 YPD, PJ69-4A 酵母菌株的隔夜培养4毫升。生长在震动孵化器在30°c, 200 rpm 到光学密度 (OD₆₀₀) 大约 1.2, 由分光光度法确定以标准 1 cm 光路径。增长通常需要 5-7 小时。
   4. 在台式离心机室温下, 以 4696 x g 为5分钟, 在50毫升锥形管中沉淀分离酵母。倾倒到液体废料中, 弃上清液。使用吸管, 并用重悬5毫升的转化缓冲颗粒, 并转移到15毫升圆锥管。Resediment 放弃上清, 并并用重悬酵母在1毫升的最终容积的转化缓冲器与1000µL 吸管。
   5. 孵育酵母细胞60分钟在30°c, 而颤抖在 200 rpm, 然后放在冰上 30-90 分钟。
2. 酵母质粒的转化。
   1. 在1.5 毫升的无菌离心管中, 添加1µg 的 pTEF-GBD 基质粒和5µL 10 毫克/毫升鲑鱼精子载体 DNA 溶液。还包括一只含有鲑鱼精子载体 DNA 作为负转化控制的管。用吸管将100µL 的冰冷酵母细胞悬浮在每管上。添加100µL 70% PEG 溶液与1000µL 吸管和混合轻轻地弹管 5-10 倍 (不涡)。
   2. 孵育在30°c, 在震动孵化器在200转每分钟45分钟。
   3. 热休克在42°c 15 分钟。
   4. 沉积物在离心在 845 x g 在室温下3分钟, 去除和丢弃上清, 并用重悬颗粒在150µL 的无菌水中吹打上下, 并扩散到一个 CSM-跨国激进板块的表面。
   5. 放置在30°c 孵化器和孵化2-3 天, 直到殖民地可见的板块右侧。在30°c 6-12 小时的孵化后, 板块可能会颠倒, 以避免板材表面凝结。
   6. 以 2-3 个殖民地每转换和条纹作为一个补丁上的 CSM-多党板块使用无菌牙签。允许生长24小时, 在30摄氏度。
3. 使裂解物蛋白表达。
   1. 接种3毫升的 CSM-激进党的液体介质与匹配头大小的酵母从补丁和增长隔夜在30°c 在20毫米 x 150 毫米培养管, 而颤抖在 200 rpm。每一个诱饵和空 pTEF-GBD 向量两个通宵文化。
   2. 加入1毫升的 YPD 到每3毫升的 CSM-跨国激进党文化。生长1小时在30摄氏度, 而颤抖在 200 rpm。用分光光度计检查细胞的 OD。
   3. 沉积一个等价的细胞数, 根据 OD 正常化。使用无菌1.5 毫升的离心管, 5 分钟旋转 2348 x g 在室温下的离心。用吸管丢弃上清液。最后的股票相当于至少2.1 的 OD。
      注意: 在计算相等数量的单元格时, 可能需要从每晚的区域性中获得不同的卷, 以达到最小的 2.1 OD。
   4. 并用重悬450µL 0.2 米氢氧化钠中的颗粒, 上下吹打。室温下孵育5分钟。Recentrifuge 细胞在室温下以 2348 x g 为2分钟, 用吸管去除上清液。
   5. 并用重悬50µL 旋转缓冲器的球团, 吹打上下小心, 不会产生气泡。热样本为5分钟, 在70摄氏度。
4. 通过 SDS 页检查蛋白质表达。
   1. 使用梯度凝胶 4-20%, 以确保大范围的分子量可以解决。将样本的等效数量 (相同 OD) 加载到 SDS 页凝胶中, 并确保至少包含一个包含未修改的 pTEF GBD 向量^13,14,15的示例。
   2. 电泳分离后, 使用抗 c-myc 单克隆或多克隆抗体和 ECL 检测解决方案 (图 3) 将凝胶转移到硝化棉和应用免疫印迹。

4. 自活化试验

1. MATalpha 酵母从-80 °c 的股票对应的应变住房的猎物图书馆的 YPD 板上采取了一个无菌的木制涂抹器, 从瓶子里刮出少量的酵母, 并在 YPD 板上裸奔。将 YPD 板孵育30°c 2 天, 或直到单个菌落可见。将一对夫妇单一的殖民地贴在 YPD 板上, 在30摄氏度的一夜之间孵化。
   注意: 在这里开发的新的应变房子猎物库是 PLY5725, 而一些兼容的商业可用的 Y2H 图书馆被安置在 Y187。
2. 按照 3.3.1 3.3.4 中的过程, 使用用于存储所需的猎物库的基于LEU2的质粒来转换 PLY5725。在这里开发的图书馆, 相应的质粒是 pGal4AD (pPL6343)。要恢复酵母转化, 板到 CSM-列伊满足板。在殖民地出现之后, 条纹作为补丁到 CSM-列伊遇见的板材和孵育24小时在30°c。
3. 遵循3.4 中的协议, 通过抗 HA 单克隆或多克隆抗体和 ECL 检测解决方案, 确认 pPL6343 空载体的表达。
4. 将每种转化后的 PJ69-4A 酵母与 PLY5725 构造在一个 YPD 板上, 在3.4 和4.3 的协议节中证实表达蛋白, 并在30°c 过夜孵化。采取1毫米³的细胞, 其中两个菌株已共同成长, 并修补到单独的 csm-列伊, csm, 和 csm-多党-列伊板块和增长 24 h。
   注: 所需的 diploids 将生长在 CSM-跨国激进-列伊板块。csm-列伊和 csm-多金属板块的生长对酵母生长起着积极的控制作用。
5. 在1毫升的 CSM-多党-列伊媒体上, 在30摄氏度一夜之间生长 diploids。沉积物500µL 细胞在1.5 毫升离心管在 2348 x g, 3 分钟在室温下离心。用吸管丢弃上清液。并用重悬1毫升的无菌水中的细胞, 重复沉淀和泥沙。检查单元格的 OD₆₀₀ 。
6. 用无菌水对每个细胞悬浮液进行一系列1:10 系列稀释, 其起始最集中的溶液为0.5。点5µL 每稀释到一个 csm-列伊多党板块, 一个 csm-列伊多党-他的盘子, 和一个 CSM-Leu-Trp-His+3AT 板块。孵化30摄氏度, 每天检查增长3天 (图 4)。
   注: 对于1:10 系列稀释, 吸管10µL 的管含有0.5 到90µL 的水和混合吹打上下。继续制作1:10 系列稀释直到有六种不同浓度的斑点。

5. 用诱饵和猎物库创造酵母种群

注意: 住宅商业猎物库质粒的 Y187 菌株不太好交配。因此, 需要以下优化条件来维护库的复杂性。包含 Y2H 猎物库的 PLY5725 菌株更好, 相同的交配过程可以与此应变 (图 5) 一起使用。

1. 接种每 PJ69-4A 转化的3毫升的培养物, 携带各种TRP1的 pTEF GBD 诱饵质粒在 CSM-多党培养基中的培养管中。包括两种单独的文化, 仅包含 pTEF-GBD 载体质粒作为过程控制。孵化的文化在30摄氏度, 200 rpm 6 小时, 然后稀释成25毫升的文化, 在一个无菌的锥形烧瓶过夜生长。
2. 在室温下解冻含有LEU2的 MATalpha 细胞的冰冻 (-80 °c) 瓶, 携带 "猎物" 库。接种125毫升的 CSM-列伊满足媒体在一个无菌锥形瓶与整个解冻瓶。在30摄氏度, 以200转每分钟的震动生长所有的文化。
   注意: 隔夜区域性的 OD₆₀₀需要介于1.0 到1.5 之间, 然后再继续执行下一步步骤。
3. 离心机 21 PJ69-4A 转化文化的当量, 在室温下 4696 x g 旋转5分钟。每10个交配反应, 颗粒 39 OD₆₀₀当量的 MATalpha 菌株携带图书馆质粒在单独的50毫升圆锥管。
   1. 在10毫升的无菌水中并用重悬细胞, 在台式离心机的室温下, 在50毫升的锥形管中重新颗粒 4696 x g 5 分钟。使用吸管, 轻轻地移除上清, 不破坏颗粒细胞。
   2. PJ69-4A 细胞在4毫升和 PLY5725 细胞中的并用重悬颗粒, 10 毫升 bYPDA (pH 3.7)。
4. 为建立交配反应, 加入1毫升的 PJ69-4A 转化细胞, 1 毫升 MATalpha 文库细胞, 1 毫升 bYPDA pH 3.7 到新的50毫升圆锥管。孵育在30°c 与柔和的轨道鼓动 (100-130 rpm) 为90分钟。
   1. 离心细胞为5分钟, 在 4696 x g, 在室温下的台式离心机。用吸管去除上清液, 并用重悬2毫升 1:1 bYPDA: YPD。板所有2毫升到100毫米 YPD 板上的吸管和孵化30°c 约20小时。
5. 利用细胞刮刀从 YPD 板上收获细胞, 将细胞转化为 2-3 毫升的 CSM-列伊多党媒体。吸管将细胞脱落成50毫升的锥形管。用1000µL 吸管吹打介质, 并在 YPD 板表面轻轻弹出介质, 用 2-3 毫升的 CSM-列伊多党介质冲洗盘子 4-5 倍。
   1. 离心细胞为5分钟, 在室温下在台式离心机 4696 x g。用吸管去除上清液, 并用重悬40毫升的 CSM-列伊多党介质中的细胞, 吹打上下 (不要涡旋)。
6. 为了估计形成的双胞细胞的数量, 将双倍混合混合物的4µL 稀释成200µL 和2000µL CSM-多党-列伊的介质。板200µL 每稀释到一个 CSM-列伊多党板块。
   注: 两个板块代表1:10,000 和1:100,000 倍稀释的 diploids 的库存, 并产生预期的 ~ 9000-2.7万殖民地在1:10,000 稀释板孵化后, 30 °c 36-40 h. 在步骤5.7 之后检查车牌。1:10,000 稀释板上至少有200个菌落需要进行步骤5。8
7. 立即采取每40毫升细胞泥沙的其余部分和接种1000毫升锥形瓶含有500毫升的 CSM-列伊多党媒体。采取初始 OD₆₀₀。孵化这些烧瓶在30°c 与震动在 180 rpm, 直到他们达到饱和 (~ 2.0 OD/毫升)。这通常需要大约 36-40 小时的时间, 在24小时内监测增长, 然后在36小时内通过 OD₆₀₀。
8. 使用吸管, 从每一个饱和的500毫升的文化和 innoculate 2000 毫升的锥形烧瓶中移除20毫升的整除数, 其中一个含有750毫升的 csm-列伊多党媒体, 第二个含有750毫升的 csm-列伊激进党-他的最低水平 3AT,消除背景 (以前在第4.5 节中确定)。混合新的文化 (770 毫升) 以及旋转和采取初始 OD₆₀₀。
9. 孵育的文化在30°c, 而晃动在 180 rpm, 直到达到饱和, 这通常发生在24小时内未选定的 CSM-列伊多党文化, 并可以采取超过 70 h 的文化选择为 Y2H 互动。
10. 一旦培养达到饱和度 (OD ~ 2.0), 去除11毫升的吸管, 沉积的细胞以5分钟的旋转在 4696 x g 在室温下, 放弃上清, 并冻结在-20 摄氏度或继续进行 DNA 提取。选定的和未选定的示例都将用于深度排序。

6. DEEPN 深度测序样品的制备

1. DNA 提取。
   1. 使用吸管在500µL 的并用重悬中, 从5.7 号协议部分中的细胞颗粒中, 转移到1.5 毫升的离心管。添加3µL 的 betamercaptoethanol 和10µL 的 Zymolase 库存。混合良好和孵化在37°c 孵化器为24-36 小时。
   2. 用500µL 苯酚/氯仿/异戊醇提取样品两次, 同时使用通风罩¹⁶。
   3. 添加7µL 4 米氯化钠, 900 µL 的冰冷100% 乙醇 (乙醇), 混合通过反转和冻结-20 °c 或继续沉积 DNA 通过旋转在 21130 x g 在室温下在离心的10分钟。
   4. 用吸管丢弃上清液。用900µL 70% 乙醇, 三次清洗颗粒。
   5. 泥沙颗粒 21130 x 克, 2 分钟, 并去除残留乙醇洗涤的吸管。干颗粒为7分钟, 在42摄氏度。
   6. 并用重悬颗粒在120µL 37 °c 水浴90分钟, 每隔30分钟就能把管子搅拌一遍。
   7. 吸管60µL 提取的 DNA 成无菌1.5 毫升离心管。添加120µL, 3.5 µL RNase 一股, 轻拍混合和孵化37°c 1 小时。
   8. 乙醇沉淀如前所做的部分 6.1.3-6.1.5, 但使用7µL 5 米醋酸铵而不是4米氯化钠。
   9. 并用重悬 RNase 在55µL 0.1x 的37摄氏度水浴中处理的 dna 为90分钟, 每隔30分钟就能把管子混合在一起. 通过光度法在分光光度计上吸收 260 nm 来量化 dna。
2. PCR cDNA 插入物。
   1. 每个 DNA 样本执行两个50µL PCR 反应。每个反应包含 25 pmol 的每向前和反向底漆匹配的猎物库质粒 (见材料)。反应也包含25µL 高保真 2x PCR 大师组合, 5 µg 的 DNA 样本, 水可达50µL. 放大反应为25个周期以3分钟的延长的时间在72°c, 退火温度55°c 三十年代, 并且变性在98°c 十年代. 骑自行车之前由三十年代变性在98°c 并且跟随以5分钟孵化在72°c。
   2. 用 1% dna 琼脂糖凝胶电泳法分析4µL 的 PCR 反应, 其中含有 0.2-0.5 µg/毫升 EtBr¹⁷的 dna 琼脂糖凝胶。通过紫外线透视可视化 DNA 样品。样本将显示大约 1-3 kb 的 DNA 涂片, 其中可以找到用于选择 Y2H 交互的样本 (图 6) 的带状模式。
   3. 将重复 pcr 样品和纯化使用 pcr 纯化试剂盒按照制造商的指示和量化 DNA 的吸收率在 260 nm 的分光光度计。

7. 深度测序

注: 一个深测序平台上的样品准备和测序通常在商业和学术 DNA 测序核心设施中得到。

1. 用高性能超 sonicator 剪切600的 PCR 产品, 给出平均长度为300的 bp 的碎片。
2. 使用用于深度排序的准备工具包生成索引排序库, 该套件在 DNA 片段的两端不对称地添加连接器编码条形码、启动站点和捕获序列。
3. 根据制造商的指示执行库准备工作。池索引库和序列作为长配对结束读取在一个深测序平台上 (例如, 2 x 150 bp PE 读取)。每个示例所需的读取数量介于10和4000万之间, 对未选定的群体所需的读取次数通常更为复杂。我们建议至少2000万个或更多的读取为未选定的人口。

8. 生物信息学加工和验证

1. 以 fastq 的形式处理 DNA 排序数据与一组独立的软件程序构建到 (1) 映射序列读取文件中的通用 SAM 格式(2) 量化数据集之间的基因富集(3) 对数据进行统计分析。为了排列哪些候选基因对 Y2H 交互作用是正的, (4) 提供有关哪些区域和哪些平移框架的信息, 每个基因片段产生正 Y2H 相互作用的每一个猎物 cDNA, (5) 提供工具, 不仅重建 5 ', 而且 3 ' 结束互动片段允许他们的重建和验证的传统 Y2H 格式。在随附的研究中详细介绍了这些程序的操作。

结果

Y2H 检测被广泛用于寻找蛋白质: 蛋白质相互作用和几个适应和系统已经开发。在大多数情况下, 同样的考虑, 帮助确保成功的这些以前的方法是重要的 DEEPN。一些重要的基准包括: 确保 DNA 结合领域融合蛋白的表达, 确保在 diploids 的低背景下, 他 + 生长在含有与空捕食质粒感兴趣的诱饵, 诱饵的交配效率高含有马来酵母与库含 MATalpha 酵母, 最后, 低严格的条件, 使人口增长的条...

讨论

在这里, 我们提供了如何使用优化方法在批处理中执行 Y2H 化验的指南。在这个过程中有几个关键步骤, 以帮助确保将被放置在选择下的酵母的人口是起始库的代表, 并且足够的开始酵母人口用于接受选择限制变异.重要的是, 这些基准相对容易实现, 同时适应传统的 Y2H 检测方法和材料, 从而使大多数实验室都能使用标准分子生物学的方法。在使用不同的诱饵质粒时, DEEPN 允许从相同的猎物库种群中进...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Illumina HiSeq 4000	Illumina		deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies	Biolegend	901514	Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies	QED Biosciences Inc	18826	Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI	New England BioLabs	R0191S
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S
BamHI-HF	New England BioLabs	R3236S
XhoI	New England BioLabs	R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder	J.T. Baker	U2211-08
Salmon Sperm DNA	Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific	50-948-286	carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate	Research Products International	K22000
LE Agarose	GeneMate	E-3120-500	used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride	Research Products International	S23025
Tryptone	Research Products International	T60060
D-Sorbitol	Research Products International	S23080
Lithium Acetate Dihydrate	MP Biomedicals	155256
Calcium Chloride	ThermoFisher	C79
EDTA Sodium Salt	Research Products International	E57020
Yeast Extract Powder	Research Products International	Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids	Research Products International	Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE	Formedium	DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE	Formedium	DCS1169
CSM-Leu-Met	Formedium	DCS0549
CSM-Trp-Met	Bio 101, Inc	4520-922
L-Methionine	Formedium	DOC0168
Adenine	Research Products International	A11500
D-(+)-Glucose	Research Products International	G32045
Bacto Agar	BD	214010	used for making media plates in section 1
Peptone	Research Products International	P20240
3-amino-1,2,4 Triazole	Sigma	A8056
2-Mercaptoehanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250
Zymolyase 100T	USBiological	Z1004
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P8281
Phenol:Chloroform:IAA	Ambion	AM9732
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	238074
Ethanol	Decon Laboratories, INC	2716
RNAse A	ThermoFisher	EN0531
Urea	Research Products International	U20200
SDS	Research Products International	L22010
glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Tris-HCl	Gibco	15506-017
bromophenol blue	Amresco	449
Gibson Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5510S	Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541S	Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide	Amresco	0492-5G
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit	KAPA Biosystems	KK8500	preparation kit for deep sequencing
Codon optimization	http://www.jcat.de
Codon optimization	https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks	Integrated DNA Technologies		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings	Thermofisher		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit	EPOCH Life Sciences		Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220	Covaris		high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain	http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436		MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
PLY5725 MATalpha yeast strain	Dr. Robert Piper Lab		MATalpha his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 gal4∆ trp1∆ Gal80∆
pGal4AD (pPL6343)	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes	Kord-Vallmark sold by VWR	2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube	Thermofisher	14-961-33
pipet-aid	Drummond	4-000-100
5 mL Serological Pipette	Denville	P7127
10 mL Serological Pipette	Denville	P7128
25 mL Serological Pipette	Denville	P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker	Fisher Scientific	02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle	Fisher Scientific	06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder	Fisher Scientific	08-572-6G
SpectraMax 190	Molecular Devices		used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000	Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator	Ultra Lum	MEB 20	used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123602G
P200 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123601G
P20 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123600G
P10 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips	GeneMate	P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips	VWR	10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips	VWR	10017-042
50 mL conical tube	VWR	490001-627
15 mL conical tube	VWR	490001-621
cell scraper	Denville Scientific	TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
HCl	Fluka Analytical	318949-1L
NaOH	J.T. Baker	5674-02
Wooden applicators	Solon Care	55900
Eppendorf microcentrifuge 5424	Fisher Scientific	05-400-005	microcentrifuge
Sorvall ST16R	Thermo Fisher Scientific	75004381	benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)	GE Healthcare	NA934-1ML	Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)	GE Healthcare	NA931-1ML	Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Fisher Scientific	34080	ECL detection solution
Isotemp Incubator	Thermo Fisher Scientific		Incubator
Mutitron 2	INFORS HT		Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205	Fisher Scientific		water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)	Clontech	630482	commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)	Clontech	630488	commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector	Clontech	630442	commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector	Clontech	630443	commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase	Bioline	BIO-21042	DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler	BioExpress	P-6050-60	pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes	USA Scientific	1405-8100