단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

요약

효 모 2 잡종 스크린의 일괄 처리 먹이 융해 단백질의 매우 복잡 한 세트로 여러 미끼 단백질의 상호 작용 프로필의 직접 비교 가능합니다. 여기, 우리는 새로운 시 약, 세련 된 방법과 같은 화면에 대 한 그들의 사용을 구현 하는 방법을 설명 합니다.

초록

효 모 2 잡종 분석 결과 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용에 대 한 심사는 긴 효과적인 도구, 하지만 사용 크게 상호 작용 후보자의 라이브러리에서 풍성 하 게 매우 높은 선호도 인터의 발견에 제한 되었습니다. 전통적인 형식에서 효 모 2 잡종 분석 결과 분석 낮은 엄중에서 실시 하는 경우에 낮은 선호도 인터를 찾을 수 있습니다 너무 많은 식민지를 얻을 수 있습니다. 또한, 다른 미끼 플라스 미드에 대 한 동일한 라이브러리의 포괄적이 고 완전 한 심문 없이 비교 분석 얻을 수 없다. 이러한 문제 중 일부 기준점과 먹이 라이브러리를 사용 하 여 해결할 수 있습니다, 있지만 비용과 같은 화면을 작동 하는 데 필요한 인프라는 금지 될 수 있습니다. 대신, 우리 동시에 과도의 수십을 밝히기 위해 효 모 2 잡종 분석 결과 적응 및 정적 단백질 상호 작용 전략을 활용 한 화면 내에서 불리 DEEPN (평가의 단백질 네트워크를 위한 동적 농축)을 통합 높 처리량 DNA 연속 그리고 상호 작용 파트너 인코딩할 플라스 미드의 인구의 진화에 따라 계산 합니다. 여기, 우리 사용자 지정된 시 약 및 DEEPN 화면 쉽고 비용 효율적으로 실행 될 수 있는 프로토콜을 설명 합니다.

서문

세포 생물학 과정의 완전 한 이해를 찾는 그들의 분자 메커니즘의 기반이 되는 단백질 상호 작용 네트워크에 의존 합니다. 단백질 상호 작용을 식별 하는 한 가지 방법은 효 모 2 잡종 (Y2H) 분석 결과, 관심의 두 단백질 도메인 바인딩할 다른¹일단 작동 공상 전사 요소를 조립 하 여 작동 하는. 전형적인 Y2H 화면 인코딩 상호 작용 단백질에 transcriptional 활성 제를 융합 하는 플라스 미드의 두 도서관 효의 인구를 생성 하 여 수행 됩니다 (예., '먹이' 퓨전 단백질)와 주어진된 '미끼' 플라스 미드 단백질의 구성 관심사의 DNA 바인딩 도메인 (예를 들면,에 Gal4 상류 활성화 순서 Gal4 DNA 바인딩 도메인)에 융합. Y2H 접근의 주요 장점 중 하나 그것은 상대적으로 쉽게 하 고 일상적인 분자 생물학 작업²에 대 한 일반적인 실험실에서 수행 하는 저렴 한 장비입니다. 그러나 때 전통적으로 수행, 사용자 긍정적인 Y2H 상호 작용에 대 한 선택 사항에 따라 발생 하는 개별 식민지를 샘플링 합니다. 이 심각 하 게 조사 될 수 있는 라이브러리 '먹이' 클론의 수를 제한 합니다. 이 문제는 때 특정 상호 작용 먹이의 풍부한 매우 낮은 풍부한 먹이 플라스 미드에서 상호 작용 검출의 기회를 감소, 다른 기준으로 복합입니다.

Y2H 원리는 프로테옴의 포괄적인 범위에서 사용 하기 위한 하나의 솔루션 알려진된 개별 먹이 플라스 미드를 포함 하는 배열을 디지털 심문 될 수 있습니다 어떤 점에서 매트릭스 형식의 접근 방법의 사용 이다. 그러나, 이러한 접근 되지 않는 쉽게 액세스할 수 또는 비용 효율적인 단백질 또는 도메인³의 적은 수의 위하여 정의에 관심이 개별 조사 하는 인프라가 필요 합니다. 또한, 상호 작용 단백질의 여러 단편을 인코딩할 수 있습니다 매우 복잡 한 먹이 라이브러리 것 허무 크기 같은 매트릭스 배열의 크기를 확장 합니다. 대안은 배치에서 복잡 한 라이브러리와 분석을 수행 하 고 대규모 병렬 높 처리량 연속⁴를 사용 하 여 상호 작용 클론의 존재를 평가 하는 것 이다. 이 일반적인 사용 하 여 여러 식민지에서 발생 하는 먹이 플라스 미드의 존재를 시험에 적용할 수 있는 Y2H 형식의 접근을 효 모에 세포 융해 단백질의 상호 작용 쌍 주택 접시^5,6에 성장 수 있습니다. 이 일반적인 생각 쿼리 두 여러 미끼의 증가 먹이 같은 시간^7,8에서 구성 요소를 강조 될 수 있습니다.

아직도, 많은 조사 쉽게 아직 더에 초점을 맞춘 노력 불과 단백질 '미끼'를 요구 하 고 단일 복잡 한 먹이 라이브러리의 완전 및 반 정량적 쿼리에서 더 혜택을 받을 수 있습니다. 우리가 개발 하 고 배치 형식⁴의 Y2H 원리를 사용 하 여 대규모 단백질 상호 작용 연구를 수행 하는 방법을 확인 했습니다. 이 Y2H 상호 작용⁹의 상대 강도 대 한 프록시는 특정 먹이 플라스 미드의 확장 속도 사용합니다. 인구 내의 모든 플라스 미드의 깊은 시퀀싱 대상이 정상적인 성장 또는 선택적 성장 조건 강하고 약한 Y2H 상호 작용을 생성 하는 클론의 완전 한 지도 생성. 인터의 레 퍼 토리 얻을 하 고 직접 여러 미끼 플라스 미드에 걸쳐 비교 수 있습니다. 불리 DEEPN (동적 농축 단백질 네트워크의 평가) 결과 워크플로 따라서 다른에 대 한 단백질 사이 비교를 허용 하는 단백질을 식별 하기 위해 같은 먹이 라이브러리에서 차동 interactomes 식별 하 사용할 수 있습니다.

여기, 우리가 DEEPN 설명 그림 1에 설명 되어 있습니다 실험실 방법의 사용을 촉진 하는 개선 사항 소개. 중요 한 개선 다음과 같습니다.

먹이 효 모 인구의 세대. DEEPN의 주요 요구 사항 중 하나 다른 미끼 플라스 미드 플라스 미드 먹이 라이브러리의 동일한 분포와 누 룩의 생성 합니다. 등가 기준 인구 먹이 플라스 미드 도서관의 다른 미끼의 interactomes 간의 정확한 비교를 만들기 위한 필수적입니다. 이것은 최고의 도서관 플라스 미드는 이미 단일 효 모 인구에 자리 하 고는 2 중 생산 짝짓기에 의해 달성 된다 인구에 주어진된 미끼 플라스 미드 이동 달성. 여기, 우리는 단일 효 모에는 상용 라이브러리를 사용 하 여 이러한 인구를 확인 하는 방법에 명확한 가이드를 제공 합니다. 우리가 diploids의 높은 번호를 생성 하는 방법을 발견, 이러한 상용 라이브러리-포함 된 효 모 종자의 전반적인 짝짓기 효율 낮은 했다. 따라서, 우리는 짝짓기 반응 당 훨씬 더 많은 diploids 수율 먹이 라이브러리를 집을 수 있습니다 새로운 긴장을 건설 한다.

새로운 미끼 플라스 미드의 설정. 익스프레스 '미끼' 퓨전 단백질 구성 관심과 DNA 바인딩 도메인의 단백질의 많은 현재 플라스 미드 2µ-기반으로, 그들의 복사본 수를 증폭 하는. 이 복사 번호 인구에서 매우 변수 하 고 Y2H transcriptional 응답에서 가변성으로 이어질 수 있습니다. 이 차례로 선택 셀의 성장 응답에 따라 주어진된 단백질 상호 작용의 강도 측정 하는 기능을 왜곡 수 있습니다. 이 중 일부는 이전 상용 pDEST32¹⁰같은 설명 되었습니다 낮은 사본 플라스 미드를 사용 하 여 주소 분할 수 있습니다. 우리가 건설 한 새로운 미끼 플라스 미드 (pTEF GBD) 또한 상류의 미끼 조각 모두 복제 수 있습니다 Kanr 저항 유전자를 운반 TRP1 centromere 기반 낮은 사본 플라스 미드 내 Gal4 DNA 바인딩 도메인 융합 단백질을 생산 하 고 Gal4 DNA 바인딩 도메인의 다운스트림.

새로운 고밀도 Y2H 조각 도서관. 우리 집 Y2H 먹이 라이브러리에 새로운 플라스 미드를 건설 하 고 게놈 DNA의 임의로 깎인된 파편의 Saccharomyces cerevisiae에서 만든 매우 복잡 한 Y2H 라이브러리를 구축 하는 데 사용. 시퀀스 분석이 라이브러리 1 백만 이상 다른 요소, 앞에서 설명한 효 모 게놈 Y2H 플라스 미드 도서관¹¹보다 훨씬 더 복잡 했다 보여주었다. 이 새로운 라이브러리 DEEPN 워크플로 안정적이 고 재현 가능한 방식으로 많은 다른 플라스 미드와 복잡 한 라이브러리에 맞게 충분히 강력한 보여줄 수 있었습니다.

프로토콜

1입니다. 미디어와 접시의 준비

참고: 모든 접시 프로토콜을 시작 하기 전에 2 일 최소로 만들 필요가 있다. 미디어는 언제 든 지 할 수 있다. 그러나, 버퍼링 된 효 모 추출 물 펩 포도 당 아데닌 (bYPDA) 사용 되는 날을 만들 수 필요가 있다. 일부 미디어 무엇 일반적으로 사용 되는 보다 큰 아데닌의 수준을 포함 하는 보충 믹스를 사용 하 여 이루어집니다. 대부분 최소한의 미디어 보조 10 mg/L 아데닌을 지정합니다. 보조 제 표시 된 '+ 40Ade' 지정 40 mg/L 아데닌의 총.

1. 포도 당 솔루션 준비 (50 %w / v). 1 L, 해산의 D-(+) 500 g-1000 mL 비 커에 증류수 800 mL에 포도. 1000 ml의 멸 균 1000 mL 미디어 저장 병에 0.2 µ m 살 균 필터를 통해 졸업된 실린더와 필터를 사용 하는 볼륨을 조정 합니다.
2. 효 모 추출 물 펩 포도 당 (YPD) 접시를 준비 합니다. 1 L, 펩의 및 1000 mL 비 커에 증류수 800 mL에 효 모 추출의 10 g 20g을 분해. 졸업된 실린더에 따르십시오, 최대 960 mL 증류수 채우기. 2000 mL 삼각 플라스 크에 부 어와 한 천 15 g을 추가. 오토 클레이 브와 37 ° C 물 목욕 물 목욕 온도 약 42-50 ° c.를 냉각 했다 때까지 멋진 50% 포도 당 40 mL를 추가 하는 피 펫을 사용 합니다. 소용돌이 의해 잘 혼합.
   1. 피 펫에 의해 미디어의 20 mL 100 mm 접시의 시리즈를 따르십시오.
3. 완전 한 합성 최소한의 미디어 (CSM) 준비-Trp 접시. 1 L, 1000 mL 비 커에 증류수 800 mL에 6.7 g 효 모 질소 기지의 아미노산 없이 해산. 졸업된 실린더에 따르십시오, 최대 960 mL의 증류수 채우기. 삼각 플라스 크 2000 mL를 붓고 고 추가-Trp의 0.7 g-강하 믹스, 20mg 메티오닌, 한 천 15 g를 만났다. 오토 클레이 브와 37 ° C 물 목욕 물 목욕 온도 약 42-50 ° c.를 냉각 했다 때까지 멋진 50% 포도 당 40 mL를 추가 하는 피 펫을 사용 합니다. 소용돌이 의해 잘 혼합.
   1. 피 펫에 의해 미디어의 20 mL 100 mm 접시의 시리즈를 따르십시오.
4. CSM 레이 만난 접시를 준비 합니다. 1 L, 1000 mL 비 커에 증류수 800 mL에 10.05 g 효 모 질소 기지의 아미노산 없이 해산. 졸업된 실린더에 부 어와 최대 940 mL의 증류수 채우기. 삼각 플라스 크 2000 mL를 붓고 고 추가의-레이 1.005 g-강하 믹스와 한 천 15 g을 만났다. 오토 클레이 브와 37 ° C 물 목욕 물 목욕 온도 약 42-50 ° c.를 냉각 했다 때까지 멋진 50% 포도 당 60 mL을 추가 하는 피 펫을 사용 합니다. 소용돌이 의해 잘 혼합.
   1. 피 펫에 의해 미디어의 20 mL 100 mm 접시의 시리즈를 따르십시오.
5. CSM-레이-Trp 접시를 준비 합니다. 1 L, 1000 mL 비 커에 증류수 800 mL에 10.05 g 효 모 질소 기지의 아미노산 없이 해산. 졸업된 실린더에 따르십시오, 최대 940 mL의 증류수 채우기. 삼각 플라스 크 2000 mL를 붓고 고 추가-Trp의 1.005 g-레이 + 40Ade 강하 믹스, 아데닌, 240 밀리 그램 및 한 천 15 g. 오토 클레이 브와 37 ° C 물 목욕 물 목욕 온도 약 42-50 ° c.를 냉각 했다 때까지 멋진 50% 포도 당 60 mL을 추가 하는 피 펫을 사용 합니다. 소용돌이 의해 잘 혼합.
   1. 피 펫에 의해 미디어의 20 mL 100 mm 접시의 시리즈를 따르십시오.
6. CSM-레이-Trp-그의 접시를 준비 합니다. 1 L, 1000 mL 비 커에 증류수 800 mL에 10.05 g 효 모 질소 기지의 아미노산 없이 해산. 졸업된 실린더에 따르십시오, 최대 940 mL의 증류수 채우기. 삼각 플라스 크 2000 mL를 붓고 고 추가-Trp 0.975 g-레이-그의 + 40Ade 강하 믹스 아데닌, 240 밀리 그램, 한 천 15 g. 오토 클레이 브와 37 ° C 물 목욕 물 목욕 온도 약 42-50 ° c.를 냉각 했다 때까지 멋진 50% 포도 당 60 mL을 추가 하는 피 펫을 사용 합니다. 소용돌이 의해 잘 혼합.
   1. 피 펫에 의해 미디어의 20 mL 100 mm 접시의 시리즈를 따르십시오.
7. CSM-레이-Trp-그의-3AT 접시를 준비 합니다. 1 L, 1000 mL 비 커에 증류수 800 mL에 10.05 g 효 모 질소 기지의 아미노산 없이 해산. 졸업된 실린더에 따르십시오, 최대 940 mL의 증류수 채우기. 삼각 플라스 크 2000 mL를 붓고 고 추가-Trp 0.975 g-레이-그의 + 40Ade 강하 믹스 아데닌, 240 밀리 그램, 한 천 15 g. 오토 클레이 브와 37 ° C 물 목욕 물 목욕 온도 약 42-50 ° c.를 냉각 했다 때까지 멋진 50% 포도 당 60 mL을 추가 하는 피 펫을 사용 합니다. 소용돌이 의해 3-아미노-1,2,4 triazole (3AT)의 1 M 살 균 주식의 100 µ L에 혼합.
   1. 피 펫에 의해 미디어의 20 mL 100 mm 접시의 시리즈를 따르십시오.
8. 파운드-Kanr 접시를 준비 합니다. 과 800 mL에 NaCl의 10 g을 1000 mL 비 커에 증류수 1 L, 디졸브 Tryptone, 10 g의 효 모 5 g 추출 합니다. 졸업된 실린더에 따르십시오, 증류수 1000 mL를 채우십시오. 삼각 플라스 크 2000 mL로 부 어와 한 천 15 g을 추가. 오토 클레이 브와 37 ° C 물 목욕 물 목욕 온도 약 42-50 ° c.를 냉각 했다 때까지 멋진 50 mg 대를 추가 하 고 소용돌이 의해 혼합.
   1. 피 펫에 의해 미디어의 20 mL 100 mm 접시의 시리즈를 따르십시오.
9. YPD, CSM 레이 만난, CSM-Trp, CSM-레이-Trp와 CSM-레이-Trp-그의 미디어를 준비 합니다. 위의 절차를 사용 하 여 격판덮개는 agar를 생략 하 고 삼각 플라스 크에 따르고, 대신 미디어 저장 병에 부 어 제외 하 고.
10. BYPDA (버퍼 YPDA)을 준비 합니다. 살 균 YPD 미디어 고 멸 균 증류수에 200 mg/L 아데닌을 추가. 무 균 병으로 0.2 µ m 살 균 필터를 통해 HCl. 여과기와 3.7 pH 조정 합니다.
11. 변환 버퍼 준비: 2 M sorbitol, 1 M 리튬 아세테이트가 수화물, 10 mM Tris pH 7.6, 0.5 m EDTA, 0.2 m m 증류수에 염화 칼슘. 무 균 병으로 0.2 µ m 살 균 필터를 통해 필터링.
12. 준비 못 솔루션: 증류수에 70 %w / v 폴 리 에틸렌 글리콜 3350. 압력솥에 의해 소독.
13. 돌리기 준비: 8 M 요소, 4 %w / v SDS, 50 mM Tris pH 6.8, 10 %v / v 글리세롤, 0.02 %w / v bromophenol 블루에 살 균 증류수.
14. STE (강한 테) 준비: 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8.0 증류수. 무 균 병으로 0.2 µ m 살 균 필터를 통해 필터링.
15. Zymolase 재고 솔루션을 준비: 10 mg/mL Zymolase 100T 50 mM 칼륨 인산 염기 pH 7.5에에서, 50 %v / v 글리세롤 버퍼 멸 균 증류수 (-20 ° C에 저장).

2. 복제 및 미끼 플라스 미드의 확인

참고: 건설 Gal4 DNA 바인딩 도메인 플라스 미드. 현재, 상용 하 고 학문적으로 사용 가능한 Y2H 시스템의 다양 한이 있다. 미끼 플라스 미드 DNA 바인딩 도메인에 융합 하는 관심사의 단백질을 표현 된 TRP1DEEPN이 수용할 수 있는-포함 하는 플라스 미드. 다른 다운스트림 요구 순서는 즉시 상류 먹이 라이브러리의 삽입 알려져 있다 고 긍정적인 Y2H 상호 작용 미디어 히스티딘 부족에서 선택할 수 있도록 His3의 생산에 의해 득점 될 수 있습니다. 그러나 여기 우리는 새로운 Y2H 미끼 플라스 미드 (pTEF GBD, 그림 2)의 사용을 설명 합니다, 그리고, pGBKT7를 포함 하는 다른 플라스 미드 Y2H 미끼 뿐만 사용할 수 있습니다. 건설 및 미끼 플라스 미드의 평가, pTEF GBD의 사용을 설명 합니다. 일반 노트로 서 유전자 합성을 좋은 표현과 복제와 용이성을 보장 하기 위해 효 모 codon 바이어스를 준수 하는 오픈-독서 프레임을 생산 하는 것이 좋습니다. 복제 스키마 Gal4 DNA 바인딩 도메인 프레임 및 3' 사이트에 복제 하는 경우 정지 codon 다음과 미끼 코딩 지역 미끼에 대 한 수 수 있는지 확인 합니다.

1. 플라스 미드 벡터를 준비 합니다. 플라스 미드 pTEF GBD 관심사의 단백질을 인코딩 조각 복제 허용 5' 또는 3' 지역의 Gal4 DNA 바인딩 도메인 빠른 어셈블리 메서드를 사용 하 여 인코딩. 5' 사이트에 삽입 소화의 나리와 EcoRI pTEF GBD 3 µ g 또는 3' 사이트에 삽입, BamHI로 소화 하 고 2-4 헤 1% DNA agarose에서 Electrophorese 샘플에 대 한 XhoI 젤 포함 0.2-0.5 µ g/mL ethidium 평범한 사람 (EtBr) 100 대에서 삭제할 컷 5,630 혈압 TEF GBD DNA 젤 추출 키트를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라에서 정화 하 고 260에서 흡 광도 의해 DNA를 계량 분 광 광도 계¹²nm.
   참고: 미끼 인코딩 삽입의 세대입니다. DNA 파편 인코딩 단백질 또는 단백질 파편의 복제 되지 않은 조각을 사용할 수 있도록 하 고 유전자 합성을 사용 하 여 만든 수 있습니다. Codons Saccharomyces cerevisiae 에 식에 대 한 최적화와 코 돈 최적화를 위한 온라인 도구 재료의 목록에 포함 하는 것이 좋습니다.
2. 5' 삽입, 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3는 ATG 시작 codon 인코딩 DNA 조각 측면 '및 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3', 각각. 3' Gal4 DNA 바인딩 도메인 프레임에 삽입, ctgcatatggccatggaggccgaa-3-5'로 인코딩 조각 측면 '및 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
3. 플라스 미드 건설에 대 한 빠른 어셈블리 메서드 사용 제조자의 방향에 지정 된 대로 복제 조각 컷된 pTEF GBD에.
   1. 모든 파운드 Kanr 접시에 대장균 을 변형 16-20 h 37 ° c.에 대 한 품 어 접시 원하는 삽입을 가진 pTEF GBD 주거 식민지는 oligonucleotides를 사용 하 여 PCR 증폭에 의해 확인 될 수 있다: CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3-5' ', 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' 삽입 및 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3'와 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' 3' 삽입에 대 한. 이러한 oligonucleotides 뇌관 삽입 시퀀싱도 될 수 있습니다.
   2. 준비 계획 > 각 pTEF GBD 파생 및 시퀀싱 및 누 룩 변환에 대 한 자료를 제공 하는 혼자 pTEF GBD 10 µ g.
   3. 다음 PCR 조건 사용: 98 ° c, 3 분 뒤에 30의 25 주기 s 98 ° C, 30에서 55 ° c, s 및 72 ° C에서 2 분 뒤에 2.5 m m MgCl₂ 를 포함 하는 버퍼를 사용 하 여 72 ° C에서 5 분 0.5 U/100 µ L DNA 중 합 효소, 및 독점 버퍼.

3. 표현의 Gal4 DNA 바인딩 도메인 융합 단백질

1. 유능한 누 룩을 확인 합니다.
   1. -80 ° C의 1 m m³ 를 근 근이 살 균 나무 주걱을 취 함으로써 YPD 접시에 효 모 PJ69-4A에 밖으로 행진 동결 주식과 YPD 접시에 걸쳐 부드럽게 문 지르고. 각 패스 미디어 표면의 손길이 닿지 않은 부분에 걸쳐가 되도록 접시 아래 나무 주걱을 이동 합니다. 2 일 동안 또는 단일 식민지 표시 될 때까지 30 ° C에서 YPD 플레이트를 품 어. 물 또는 성장 매체에서 누 룩을 중단, 7 %DMSO 보충 하 여 저장 하면-80 ° c.에 PJ69-4A 효 언된 재고 확인
   2. 단일 식민지 문화 YPD의 메 마른 나무 주걱을 사용 하 여 20 mm x 150 mm 문화 관에서의 5 mL에 접종 하 고 하룻밤 200 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 30 ° C에서 성장 한다.
   3. PJ69-4A 효 모 스트레인의 숙박 문화 4 mL를 무 균 삼각 플라스 크의 250 ml에서 YPD의 50 mL 접종 표준 1 cm 빛 경로와 분 광 광도 법에 따라 약 1.2의 30 ° C, 광학 밀도 (OD₆₀₀) 200 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 성장 한다. 성장에는 일반적으로 5-7 h 걸립니다.
   4. 벤치탑 원심 분리기에 실 온에서 5 분 동안 4,696 x g에서 원뿔 튜브의 50 mL에 침전 하 여 효를 격리 합니다. 액체 폐기물에 덤핑으로 상쾌한을 삭제 합니다. 변환 버퍼와 15 mL 원뿔 튜브의 전송의 5 mL에 펠 릿을 resuspend를 피 펫을 사용 하 여. 상쾌한, 삭제 하 고 변환 버퍼 1000 µ L 피 펫의 최종 볼륨의 1 mL에 누 룩을 resuspend Resediment.
   5. 30 ° C에서 60 분에 대 한 효 모 세포 200 rpm에서 동요 하는 동안 알을 품고 고 30 ~ 90 분 동안 얼음에 놓습니다.
2. 효 모 플라스 미드 전이입니다.
   1. 살 균 microcentrifuge 튜브 1.5 ml, pTEF GBD-기반 플라스 미드의 1 µ g 및 5 µ L의 10 mg/mL 연어 정자 DNA 솔루션을 추가 합니다. 또한 부정적인 변환 제어로만 연어 정자 캐리어 DNA를 포함 하는 튜브를 포함 합니다. 피 펫에 의해 각 튜브를 얼음 처럼 차가운 효 모 세포 현 탁 액의 100 µ L를 추가 합니다. 70%의 100 µ L을 추가 못 1000 µ L 피 펫 및 부드럽게 터치 튜브 5-10 배 (소용돌이 하지 않습니다) 하 여 혼합 솔루션.
   2. 45 분 200 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 30 ° C에서 품 어.
   3. 15 분 동안 42 ° C에서 열 충격.
   4. 845 x g, 실내 온도에 3 분에 microcentrifuge에 앙금에서 플라스틱 그리고 상쾌한 삭제, 아래로, pipetting으로 살 균 물 150 µ L에서 펠 릿 resuspend CSM Trp 격판덮개의 표면에 걸쳐.
   5. 30 ° C 인큐베이터에 접시 오른쪽 장소 하 고 식민지가 표시 될 때까지 2-3 일 동안 품 어. 플레이트 6-12 h 30 ° C에서 배양 후 플레이트 표면에 응축을 피하기 위해 거꾸로 설정 될 수 있습니다.
   6. 메 마른이 쑤 시 게를 사용 하 여 CSM Trp 접시에 패치로 변환 및 행진 당 2-3 식민지를 가져가 라. 30 ° c.에 24 h에 대 한 성장을 허용합니다
3. 단백질 식 lysates를 확인 합니다.
   1. 일치 머리 크기 패치에서 효와 CSM Trp 액체 미디어의 3 mL 접종 하룻밤 20 mm x 150 mm 문화 관에서 30 ° C에서 200 rpm에서 떨고 있는 동안 성장 하 고. 미끼와 빈 pTEF GBD 벡터 당 2 개의 숙박 문화를 확인 합니다.
   2. CSM Trp 하룻밤 문화의 각 3 ml YPD의 1 mL를 추가 합니다. 200 rpm에서 떨고 있는 동안 30 ° C에서 1 시간에 대 한 성장. 분 광 광도 계에 의해 셀의 OD를 확인 합니다.
   3. 셀, 마약에 따라 정상화의 동등한 수 앙금. Microcentrifuge 튜브의 살 균 1.5 mL를 사용 하 여 실내 온도 microcentrifuge에 2,348 x g에 5 분 회전 급강하. 한 피 펫을 사용 하 여 상쾌한 삭제. 마지막 재고 최소 2.1 OD에 해당합니다.
      참고: 셀의 동등한 수를 계산, 그것은 발생할 수 있습니다 다른 볼륨 최소 2.1 OD를 달성 하기 위해 각 숙박 문화에서 필요할 수 있습니다.
   4. 0.2 M NaOH의 450 µ L를 위아래로 pipetting으로 펠 릿을 resuspend. 실 온에서 5 분 동안 품 어. 실 온에서 2,348 x g 2 분에 대 한 셀을 recentrifuge 하 고 피펫으로 여는 상쾌한 삭제.
   5. 거품을 만들지으로 신중 하 게 여기저기 pipetting으로 돌리기 버퍼의 50 µ L와 펠 릿을 resuspend. 70 ° c.에서 5 분 동안 열 샘플
4. 단백질 발현 SDS 페이지를 확인 합니다.
   1. 분자 무게의 큰 범위를 위해 4-20%의 그라데이션 젤 해결할 수를 사용 합니다. 부하 상응 하는 금액 (동일한 OD) SDS 페이지에 샘플의 젤 되며 수정 되지 않은 pTEF GBD 벡터^13,,1415를 포함 하는 적어도 하나의 샘플을 포함 해야 합니다.
   2. 전기 이동 별거 후 젤 니트로와 immunoblot 안티 myc 단일 클로 널 또는 polyclonal 항 체 및 ECL 탐지 솔루션 (그림 3)를 사용 하 여 전송 합니다.

4. 자기 인증 테스트

1. 조에 해당 하 여 메 마른 나무 주걱, 유리병에서 효 모의 작은 금액을 긁 YPD 격판덮개의 맞은편에 질주 먹이 도서관 YPD 플레이트에 대 한 관심의 주택 스트레인-80 ° C 주식에서 흔 MATalpha 효 모 개 2 일 동안 또는 단일 식민지 표시 될 때까지 30 ° C에서 YPD 플레이트를 품 어. 패치는 YPD 접시에 몇 가지 단일 식민지와 30 ° c.에서 밤새 품 어
   참고: 여기 집 먹이 라이브러리 개발 새로운 변형 PLY5725는 반면 일부 호환 상용 Y2H 라이브러리 Y187에 보관 되어있습니다.
2. 3.3.1-의 절차에 따라 LEU2와 PLY5725를 변환할 3.3.4-플라스 미드를 집 원하는 먹이 라이브러리 사용을 기반으로. 여기서 개발 된 라이브러리, 해당 플라스 미드는 pGal4AD (pPL6343). 효 모 transformants를 복구 하려면 CSM 레이 만난 접시에 접시. 식민지 후 발생, CSM 레이 만난 접시에 패치로 행진 하 고 30 ° c.에 24 h에 대 한 품 어
3. 3.4 pPL6343 빈 벡터를 사용 하 여 안티의 식을 확인 하는 프로토콜에 따라-하 단일 클로 널 또는 polyclonal 항 체 및 ECL 탐지 솔루션.
4. 프로토콜 섹션 3.4와 4.3에에서 단백질을 표현 하 고 하룻밤 30 ° C에서 품 어 확인 되었다 YPD 접시에 각각 PLY5725와 크로스 패턴에서 변형된 PJ69-4A 효 모 생성 행진. 받아 1 m m³ 두 변종에 함께 성장 하 고에 패치 셀의 CSM 레이 만난, 별도 CSM-Trp, 및 CSM-Trp-레이 접시 24 h를 성장.
   참고: 원하는 diploids CSM-Trp-레이 판에 성장할 것입니다. CSM 레이 만난에 성장 및 CSM Trp 접시 효 모 성장에 대 한 긍정적인 컨트롤 역할을 합니다.
5. 30 ° c.에 하룻밤 CSM-Trp-레이 미디어의 1 mL에 diploids 성장 Microcentrifuge의 1.5 ml에서 앙금 500 µ L 셀 2,348 x g, 실내 온도 microcentrifuge에 3 분에 관. 상쾌한 피 펫에 의해 삭제 합니다. Resuspend 살 균 물의 1 mL에서 셀과 침전 및 물의 resuspension 반복 합니다. 셀의 OD₆₀₀ 을 확인 하십시오.
6. 만들기 시리즈 1시 10분의 각 세포 현 탁 액 살 균 수를 사용 하 여 시작 하는 대부분의 직렬 희석 0.5 세에서 각각의 솔루션을 집중. CSM-레이-Trp 접시, CSM-레이-Trp-그의 플레이트, 그리고는 CSM에 각 희석의 5 µ L 자리-레이-Trp-그의 + 3AT 플레이트. 30 ° C에서 품 어와 성장을 위한 검사 일일 3 일 동안 (그림 4).
   참고: 1시 10분에 대 한 직렬 희석, 10 µ L 90 µ L의 물에는 OD 0.5 포함 된 튜브의 플라스틱 및 아래로 pipetting으로 혼합. 1시 10분 직렬 희석 자리에 6 개의 다른 농도의 총 때까지 계속 합니다.

5. 미끼와 먹이 도서관 효 모 인구 만들기

참고: 상업 먹이 라이브러리 플라스 미드 하우스 Y187 스트레인 잘 친구 하지 않습니다. 따라서, 다음과 같은 최적화 된 조건은 라이브러리의 복잡성을 유지 하기 위해 필요 합니다. PLY5725 포함 Y2H 먹이 라이브러리 동료를 더 변형 및이 긴장 (그림 5)와 같은 짝짓기 프로시저를 사용할 수 있습니다.

1. 다양 한 TRP1를 들고 PJ69-4A transformants의 각각의 문화의 3 mL 접종-문화 관에 CSM Trp 미디어에서 pTEF GBD 미끼 플라스 미드를 포함 하. 절차적 컨트롤 역할을 혼자 pTEF GBD 벡터 플라스 미드를 포함 하는 2 개의 별도 문화를 포함 합니다. 30 ° C를 6 h 200 rpm에서 문화를 품 어 그리고 하룻밤 성장 위한 무 균 삼각 플라스 크에 문화의 25 mL로 희석.
2. LEU2를 포함 하는 MATalpha 세포의 냉동된 (-80 ° C) 유리병을 녹여-실 온에서 도서관 "먹이"를 들고. 완전히 해 동된 유리병으로 무 균 삼각 플라스 크에 CSM 레이 만난 미디어의 125 mL 접종 200 rpm에서 떨고 하룻밤 30 ° C에서 모든 문화를 성장.
   참고: OD₆₀₀ 하룻밤 문화의 다음 단계로 진행 하기 전에 1.0 ~ 1.5 사이 범위 필요가 있다.
3. PJ69-4A transformant 문화 실 온에서 4,696 x g에 5 분 회전 급강하의 각각의 21 세 해당 원심 모든 10 짝짓기 반응, 별도 50 mL 원뿔 튜브에에서 라이브러리 플라스 미드를 운반 하는 MATalpha 긴장의 펠 릿 39 세₆₀₀ 등가물 원하는.
   1. Resuspend 살 균 물 10 mL에 셀과 다시 새로운 50 ml에서 원뿔 튜브 4,696 x g 5 분의 작은 벤치탑 원심 분리기에서 실내 온도에. 부드럽게 한 피 펫을 사용 하 여, 수송과 세포를 중단 하지 않고는 상쾌한을 제거 합니다.
   2. 4 mL에 PJ69-4A 셀과 bYPDA (pH 3.7) 10 mL에 PLY5725 셀의 펠 릿 resuspend
4. 설정 하려면 짝짓기 반응, PJ69-4A의 1 mL 변형 셀, MATalpha 라이브러리 포함 된 셀의 1 mL 및 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 bYPDA pH 3.7의 1 mL 추가 합니다. 90 분에 대 한 부드러운 궤도 동요 (100-130 rpm)와 30 ° C에서 품 어.
   1. 실내 온도 벤치탑 원심 분리기에 4,696 x g에 5 분에 대 한 셀 원심 상쾌한 피 펫에 의해 제거 하 고 1:1 bYPDA:YPD 2 mL에 펠 릿을 resuspend. 피 펫에 의해 모든 2 mL 100 mm YPD 접시에 접시와 약 20 h 30 ° C에서 품 어.
5. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 CSM-레이-Trp 미디어의 2-3 mL로 세포를 꺼내 려 하는 YPD 격판덮개에서 베스트 셀. 원뿔 튜브의 50 mL에 dislodged 피 펫 셀. 최대 1000 µ L를 사용 하 여 미디어 플라스틱 pipetting와 부드럽게 YPD 플레이트 표면에 걸쳐 미디어 꺼내기 CSM-레이-Trp 미디어의 2-3 mL와 4-5 회 접시를 헹 구 십시오.
   1. 실내 온도 벤치탑 원심 분리기에 4,696 x g에 5 분에 대 한 셀 원심 상쾌한 피 펫에 의해 무시 하 고 (마 하지 소용돌이) 위아래로 pipetting으로 CSM-레이-Trp 미디어의 40 mL에 셀을 resuspend.
6. 형성 하는 2 중 세포의 수를 예상 하려면 200 µ L 2000 µ L CSM-Trp-레이 미디어에 2 중 혼합물의 4 µ L를 희석. CSM-레이-Trp 접시에 각 희석의 200 µ L 플레이트.
   참고: 두 접시 diploids 수확 하 고 저조한 1:10,000 희석 접시에 예상된 ~ 9000-27000 식민지 36-40 헤 30 ° C에서 부 화 후 체크 플레이트 단계 5.7 후 재고의 1:10,000 및 1:100,000 배 희석을 나타냅니다. 최소한 1:10,000 희석 접시에 200 식민지의 5.8 단계로 진행 하는 데 필요한
7. 바로 셀 물의 resuspension의 각 40 mL의 나머지 고 CSM-레이-Trp 미디어의 500 mL를 포함 하는 삼각 플라스 크 1000 mL를 접종 합니다. 초기 세₆₀₀을 가져가 라. 채도 (~2.0 OD/mL)를 도달할 때까지 180 rpm에서 떨고와 30 ° C에서이 플라스 크를 품 어. 이 일반적으로 걸립니다 약 36-40 헤 24 h에 모니터 성장을 다시 36 h에 OD₆₀₀여.
8. 문화와 innoculate 2000 mL 삼각 플라스 크, 포함 한 750 mL CSM-레이-Trp 미디어의과 두 번째 포함 750 mL의 CSM-레이-Trp-그의 3AT의 낮은 수준으로의 포화 500 mL의 각에서 aliquots의 20 mL를 제거를 피 펫을 사용 하 여 그 배경 (이전 섹션 4.5에서 결정)을 제거 합니다. 소용돌이 의해 잘 새로운 문화 (770 mL)를 혼합 하 고 초기 세₆₀₀걸릴.
9. 채도 일반적으로 선택 되지 않은 CSM-레이-Trp 문화에 대 한 24 시간 이내 발생 하 고 Y2H 상호 작용에 대 한 선택에서 문화에 대 한 70 h 이상 걸릴 수 있습니다 도달까지 180 rpm에서 떨고 있는 동안 30 ° C에서 문화를 품 어.
10. 문화에는 채도 (OD ~ 2.0)에 도달 했습니다, 일단 제거의 11 mL 피 펫, 앙금 4,696 x g 상 온에서 5 분 스핀으로 셀, 피 펫,으로 상쾌한 삭제-20 ° C에서 동결 또는 DNA 추출에 계속. 선택한 및 선택 되지 않은 샘플 모두 사용 됩니다 깊은 시퀀싱에 대 한.

6. 샘플 준비 DEEPN 깊은 시퀀싱

1. DNA 추출입니다.
   1. 한 피 펫을 사용 하 여 resuspend microcentrifuge 튜브 1.5 ml sTE 버퍼와 전송 프로토콜 섹션 5.7에 500 µ L에서 셀 펠 릿. 3 µ L의 betamercaptoethanol 및 Zymolase 주식의 10 µ L를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 24-36 h에 대 한 37 ° C 배양 기에서 품 어.
   2. 연기 후드¹⁶을 사용 하는 동안 500 µ L 페 놀/클로 프롬/isoamyl 알콜으로 두 번 샘플을 추출 합니다.
   3. 4 M NaCl의 7 µ L, 얼음 감기 100% 에탄올 (ETOH), 전도 의해 혼합 및 어느 동결-20 ° C의 900 µ L를 추가 하거나 토사 DNA microcentrifuge에 실 온에서 10 분 동안 21,130 x g에서 회전 하 여 계속 합니다.
   4. 상쾌한 피 펫에 의해 삭제 합니다. 70%의 900 µ L로 몇 번이 고 펠 릿을 세척 ETOH.
   5. 침전 물 21,130 x g 2 분에 대 한 작은 고 피 펫에 의해 잔여 ETOH 세척을 제거 합니다. 7 분 42 ° c.에 건조 펠 렛
   6. 90 분 동안 37 ° C 물 욕조에 0.1 x sTE의 120 µ L에서 펠 릿 resuspend, 매 30 분을 혼합 튜브 영화.
   7. Microcentrifuge 튜브의 살 균 1.5 mL로 추출 된 DNA의 60 µ L 플라스틱. 인 트, RNase A 주식, 혼합 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어 영화 3.5 µ L의 120 µ L를 추가 합니다.
   8. 이전 단원의 6.1.3-6.1.5, 수행 하는 에탄올 침전 하지만 4 M NaCl 대신 5 M 염화 아세테이트의 7 µ L을 사용 합니다.
   9. 90 분 동안 37 ° C 물 욕조에 0.1 x sTE의 55 µ L에 RNase A 치료 DNA resuspend, 260에서 흡 광도 의해 30 분 마다 계량 DNA를 혼합 튜브 영화는 분 광 광도 계에 nm.
2. PCR cDNA를 삽입합니다.
   1. 2 DNA 샘플 당 50 µ L PCR 반응을 수행 합니다. 각 반응 포함 각 정방향 및 역방향 뇌관 먹이 도서관 플라스 미드를 일치의 25 pmol (자료 참조). 반응 또한 하이파이 2 x PCR 마스터 믹스, 5 µ g의 DNA 샘플의 25 µ L를 포함 하 고 최대 50 µ L. 증폭 반응 확장 시간 72 ° C, 55 ° C 30의 단련 온도에서 3 분의 25 주기 위한 물 들, 그리고 10 s. 선행 98 ° C에서 변성 시키기 사이클링 72 ° c.에서 5 분 부 화와 98 ° C에 따라 30 s 변성에 의해
   2. 4 분석 DNA agarose와 1% DNA agarose 젤 전기 이동 법에 의해 각 PCR 반응의 µ L 젤 포함 0.2-0.5 µ g/mL EtBr¹⁷. UV transillumination에 의해 DNA 샘플을 시각화. 샘플은 DNA 약 1-3 kb, 어디 밴딩 패턴 있습니다 샘플에 대 한 Y2H 상호 작용은의 얼룩 선정 (그림 6) 표시 됩니다.
   3. 중복 PCR 견본을 결합 하 고 제조업체의 지침에 따라에서 PCR 정화 키트를 사용 하 여 정화 하 고 260에서 흡 광도 의해 DNA를 계량 한 분 광 광도 계에 nm.

7. 깊은 시퀀싱

참고: 샘플 준비 및 시퀀싱 깊은 시퀀싱 플랫폼에는 상업 및 학문적 인 DNA 시퀀싱 핵심 시설에서 일반적으로 사용할 수입니다.

1. ~ 300의 평균 길이의 조각에 게 고성능 울트라 sonicator를 사용 하 여 PCR 제품의 전단 600 ng 혈압.
2. 링커 못쓰게 사이트, 바코드, 인코딩 추가 깊은 시퀀싱에 대 한 준비 키트를 사용 하 여 인덱싱된 시퀀싱 라이브러리를 생성 하 고 DNA 파편의 끝에 비대칭으로 시퀀스를 캡처하십시오.
3. 제조업체의 지침에 따라 라이브러리 준비를 수행 합니다. 풀 색인 라이브러리와 깊은 시퀀싱 플랫폼 (예를 들어, 2 x 150 bp PE 읽기)에 긴 쌍 간 읽기 시퀀스. 각 샘플에 대 한 대상으로 읽기 원하는 수 10와 일반적으로 더 복잡 한 선택 되지 않은 인구에 대 한 원하는 더 많은 읽기로 40 백만 사이입니다. 선택 되지 않은 인구를 위해 적어도 20 백만 이상의 읽기를 좋습니다.

8. Bioinformatic 처리 및 확인

1. 독립형 소프트웨어 (1) 시퀀스를 지도 하는 프로그램 파일 범용 샘 형식 (2) 계량 읽기의 세트와 함께 fastq의 형태로 데이터를 시퀀싱 프로세스 DNA 데이터 (집합 사이의 유전자 농축 3) 수행에 데이터의 통계 분석 순위는 후보자 유전자 순서는 긍정적인 상호 작용 Y2H (4) (5) 및 무슨 지구 및 무엇 변환 프레임 각 유전자 마다 먹이 cDNA의 파편을 긍정적인 Y2H 상호 작용 구성 되어 항복 정보 제공 제공 5' 뿐만 아니라 전통적인 Y2H 형식에 그들의 재건 및 확인을 수 있도록 상호 작용 조각의 3' 끝을 재구성 하는 도구. 이러한 프로그램의 운영은 함께 연구에 상세 하다.

결과

Y2H 분석 결과 단백질: 단백질 상호 작용을 찾기위한 널리 사용 되었습니다 그리고 몇 가지 적응 및 시스템 개발 되었습니다. 대부분의 경우, 이러한 이전 접근의 성공을 보장 하는 데 도움이 같은 고려 DEEPN에 대 한 중요 하다. 중요 한 벤치 마크의 일부를 포함: 보장 표현의 DNA 바인딩 도메인 융합 단백질, 보장의 스 퓨 리 어스 낮은 배경을 포함 하는 빈 먹이 플라스 미드, ?...

토론

여기 우리는 최적화 된 방법을 사용 하 여 일괄 처리에서 Y2H 분석 실험을 수행 하는 방법에 대 한 가이드를 제공 합니다. 선택 아래에 배치 될 것 이다 효 모의 인구 시작 라이브러리의 대표는 하 고 충분히 시작 효 모 인구 다양성을 제한 하는 선택을 사용 하는 절차에 있는 몇 가지 중요 한 단계 . 중요 한 것은, 이러한 벤치 마크는 적응 방법 및 전통적인 Y2H 분석 결과, 따라서이 방법은 대부분 실?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Illumina HiSeq 4000	Illumina		deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies	Biolegend	901514	Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies	QED Biosciences Inc	18826	Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI	New England BioLabs	R0191S
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S
BamHI-HF	New England BioLabs	R3236S
XhoI	New England BioLabs	R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder	J.T. Baker	U2211-08
Salmon Sperm DNA	Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific	50-948-286	carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate	Research Products International	K22000
LE Agarose	GeneMate	E-3120-500	used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride	Research Products International	S23025
Tryptone	Research Products International	T60060
D-Sorbitol	Research Products International	S23080
Lithium Acetate Dihydrate	MP Biomedicals	155256
Calcium Chloride	ThermoFisher	C79
EDTA Sodium Salt	Research Products International	E57020
Yeast Extract Powder	Research Products International	Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids	Research Products International	Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE	Formedium	DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE	Formedium	DCS1169
CSM-Leu-Met	Formedium	DCS0549
CSM-Trp-Met	Bio 101, Inc	4520-922
L-Methionine	Formedium	DOC0168
Adenine	Research Products International	A11500
D-(+)-Glucose	Research Products International	G32045
Bacto Agar	BD	214010	used for making media plates in section 1
Peptone	Research Products International	P20240
3-amino-1,2,4 Triazole	Sigma	A8056
2-Mercaptoehanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250
Zymolyase 100T	USBiological	Z1004
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P8281
Phenol:Chloroform:IAA	Ambion	AM9732
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	238074
Ethanol	Decon Laboratories, INC	2716
RNAse A	ThermoFisher	EN0531
Urea	Research Products International	U20200
SDS	Research Products International	L22010
glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Tris-HCl	Gibco	15506-017
bromophenol blue	Amresco	449
Gibson Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5510S	Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541S	Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide	Amresco	0492-5G
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit	KAPA Biosystems	KK8500	preparation kit for deep sequencing
Codon optimization	http://www.jcat.de
Codon optimization	https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks	Integrated DNA Technologies		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings	Thermofisher		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit	EPOCH Life Sciences		Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220	Covaris		high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain	http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436		MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
PLY5725 MATalpha yeast strain	Dr. Robert Piper Lab		MATalpha his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 gal4∆ trp1∆ Gal80∆
pGal4AD (pPL6343)	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes	Kord-Vallmark sold by VWR	2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube	Thermofisher	14-961-33
pipet-aid	Drummond	4-000-100
5 mL Serological Pipette	Denville	P7127
10 mL Serological Pipette	Denville	P7128
25 mL Serological Pipette	Denville	P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker	Fisher Scientific	02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle	Fisher Scientific	06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder	Fisher Scientific	08-572-6G
SpectraMax 190	Molecular Devices		used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000	Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator	Ultra Lum	MEB 20	used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123602G
P200 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123601G
P20 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123600G
P10 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips	GeneMate	P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips	VWR	10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips	VWR	10017-042
50 mL conical tube	VWR	490001-627
15 mL conical tube	VWR	490001-621
cell scraper	Denville Scientific	TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
HCl	Fluka Analytical	318949-1L
NaOH	J.T. Baker	5674-02
Wooden applicators	Solon Care	55900
Eppendorf microcentrifuge 5424	Fisher Scientific	05-400-005	microcentrifuge
Sorvall ST16R	Thermo Fisher Scientific	75004381	benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)	GE Healthcare	NA934-1ML	Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)	GE Healthcare	NA931-1ML	Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Fisher Scientific	34080	ECL detection solution
Isotemp Incubator	Thermo Fisher Scientific		Incubator
Mutitron 2	INFORS HT		Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205	Fisher Scientific		water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)	Clontech	630482	commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)	Clontech	630488	commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector	Clontech	630442	commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector	Clontech	630443	commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase	Bioline	BIO-21042	DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler	BioExpress	P-6050-60	pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes	USA Scientific	1405-8100