Экран 2-гибрид дрожжи в пакете для сравнения взаимодействий протеина

Резюме

Пакетная обработка экранов 2-гибрида дрождей позволяет для прямого сравнения профилей взаимодействия нескольких приманки белков с весьма сложным набором добычу синтеза белков. Здесь мы описываем, изысканные методы, новые реагенты и как осуществлять их использования для таких экранов.

Аннотация

Скрининг для взаимодействий протеин протеина используя пробирного 2-гибрида дрождей уже давно эффективным средством, но его использование во многом был ограниченным к открытию высокоспецифичные посредники, которые сильно обогащенный в библиотеке взаимодействующих кандидатов. В традиционном формате пробирного 2-гибрида дрождей может принести слишком много колоний для анализа при проведении в низкой жесткости где низкого сродства посредники могут быть найдены. Кроме того без всеобъемлющей и полной допроса той же библиотеки против различных приманки плазмид, сравнительный анализ невозможно. Хотя некоторые из этих проблем могут быть решены с использованием библиотек выстроились добычу, стоимость и инфраструктуры, необходимых для работы таких экранов может быть непомерно высока. В качестве альтернативы, мы адаптировали дрожжи 2-гибрид assay одновременно раскрыть десятки переходных и статические белковых взаимодействий в одном экране, используя стратегию называют DEEPN (динамический обогащения для оценки белка сетей), который включает в себя высокопроизводительного секвенирования ДНК и вычисление проследить эволюцию популяции плазмиды, которые кодируют взаимодействия партнеров. Здесь мы описываем заказной реагентов и протоколы, которые позволяют DEEPN экрана, чтобы быть выполнен легко и экономически эффективно.

Введение

Полное понимание биологических процессов клетки основывается на поиске сетей взаимодействия белков, которые лежат в основе их молекулярные механизмы. Один из подходов к идентификации взаимодействий протеина является дрожжи assay (Y2H) 2-гибрид, который работает путем сборки функционирования химерных транскрипционный фактор, после двух доменов протеина интереса связывать друг с другом¹. Типичный Y2H экран осуществляется путем создания население дрожжей, что дома обе библиотеки плазмид кодирования взаимодействуя белками, сливается с transcriptional активатор (например., «добычу» синтез белка) и плазмида данного «приманки» состоит из белка из интереса сливается с ДНК связывающий домен (например, Gal4 ДНК-связывающих домен, который связывает вверх по течению Gal4 активируя последовательности). Одним из главных преимуществ Y2H подход является, что это сравнительно легко и недорого провести в типичной лаборатории оснащены для рутинной молекулярных биологических работы². Однако когда традиционно выполняется, пользователь образцы отдельных колоний, которые возникают при выборе для позитивного взаимодействия Y2H. Это серьезно ограничивает количество библиотека «добычу» клоны, которые могут быть обследованы. Эта проблема усугубляется, когда обилие конкретных взаимодействующих добычу очень высока по сравнению с другими, уменьшая вероятность обнаружения взаимодействия с низкой численности хищных плазмид.

Одним из решений для использования Y2H принципа всеобъемлющего охвата протеома является использование матрицы формате подхода, которой массив плазмид известных индивидуальных добычу могут допрашиваться цифровой. Однако такой подход требует инфраструктуры, которая не является легко доступной или экономически отдельных следователей, которые заинтересованы в определении interactome небольшое количество белков или домены³. Кроме того очень сложные добычу библиотек, которые могут кодировать несколько фрагментов взаимодействующих белков будет расширять размер такой матрицы массивов непрактичным размеров. Альтернативой является для выполнения анализов с комплекс библиотек в пакетах и оценить наличие взаимодействующих клонов, используя массивной параллельной последовательности высок объём⁴. Это может быть применено к assay присутствие плазмид добычу, которые возникают в несколько колоний, с использованием типичного Y2H формате подход, в котором дрожжи клетки жилья взаимодействующие синтеза белков могут расти на пластине^5,6. Эта общая идея может акцентировал увеличить запрос оба несколько приманки и добычей компонентов на же время^7,8.

Тем не менее многие расследования требуют что проще еще более целенаправленный характер усилий на нескольких белка «приманки» и может принести пользу более запросом исчерпывающим и полуколичественных единый комплекс добычу библиотеки. Мы разработали и проверены подход для выполнения белка широкомасштабного взаимодействия исследования с использованием Y2H принцип в пакетный формат⁴. Скорость расширения конкретной жертвой плазмида использует в качестве прокси для относительной силы взаимодействия Y2H⁹. Глубокие секвенирования всех плазмид в рамках населения подвергается нормальному росту или селективный рост условий производит полную карту клонов, которые дают сильные и слабые Y2H взаимодействий. Репертуар посредники могут получить и непосредственно сравнивать по несколько плазмидов приманки. Полученный рабочий процесс, называется DEEPN (динамический обогащения для оценки белка сетей) таким образом может использоваться для определения дифференциального interactomes же добычей библиотек для идентификации белков, позволяя сравнение одного белка против другой.

Здесь, мы демонстрируем DEEPN и внесения улучшений в лабораторных методов, которые облегчают его использования, которые приводятся на рисунке 1. Значительные усовершенствования включают в себя:

Поколение популяций хищных дрожжи. Одним из ключевых требований DEEPN порождает населения дрожжей с различные приманки плазмиды, которые имеют такое же распределение библиотек добычу плазмиды. Эквивалентные базовых популяций хищных плазмида библиотеки необходимы для точных сопоставлений между interactomes разных приманки. Это лучше всего достигается, когда библиотека плазмида уже расположен в haploid дрожжей населения и перемещение заданного приманки плазмида в населения достигается путем спаривания производить диплоидные. Здесь мы предоставляем четкое руководство в том, как сделать такое население, с использованием коммерческих библиотек, размещенный в haploid дрожжей. Хотя мы нашли методы, которые генерируют большое количество diploids, общей спаривания эффективности эти коммерческие библиотеки, содержащей штаммов дрожжей был низким. Таким образом мы построили новый штамм, который может дом добычу библиотек, что дает гораздо больше diploids за спаривания реакции.

Новый набор приманки плазмид. Многие текущие плазмиды, которые выражают протеины сплавливания «приманки» входят протеина интереса и ДНК связывающих домена на основе 2μ, позволяя им для того усилить их копии номер. Этот номер копии могут быть вполне переменной в населенности и привести к изменчивости в ответ transcriptional Y2H. Это в свою очередь может исказить возможность оценить силу взаимодействия данного белка, основываясь на ответе роста клеток под выбор. Это может быть частично адрес с помощью низкой копировать плазмиду, некоторые из которых ранее были описаны как коммерчески доступных pDEST32¹⁰. Мы построили новые приманки плазмида (pTEF ГПБ), которая производит Gal4-ДНК связывающих белков фьюжн домена внутри центромер низкая копирования плазмида TRP1 , перевозящих ген сопротивления Kanr, также позволяет клонирования приманки фрагментов оба вверх по течению и вниз по течению от Gal4 ДНК-связывающих домена.

Библиотека фрагмент новой высокоплотного Y2H. Мы построен новый плазмида дом Y2H добычу библиотек и использовал его для построения сложных Y2H библиотеки из случайно стриженый фрагментов геномной ДНК из Saccharomyces cerevisiae. Анализ последовательности показали, что эта библиотека более 1 миллиона различных элементов, гораздо более сложным, чем ранее описанные дрожжи геномной Y2H плазмиды библиотек¹¹. С этой новой библиотеки мы смогли показать, что процесс DEEPN достаточно прочным для того, чтобы вместить комплекс библиотек с много различных плазмид в манере, которая является надежным и воспроизводимость.

протокол

1. подготовка средств массовой информации и плиты

Примечание: Все пластины должны быть сделаны как минимум 2 дня перед началом протокол. Средства массовой информации могут быть сделаны в любой точке. Однако буферизации дрожжевой экстракт Пептон Декстроза аденин (bYPDA) необходимо предусмотреть в день, из которых он будет использоваться. Некоторые средства массовой информации производится с использованием дополнения смеси, содержащей уровень аденин, что больше, чем обычно используется. Большинство дополнений минимальные средства массовой информации укажите аденин 10 мг/Л. Добавки с надписью «+ 40Ade» укажите в общей сложности 40 мг/Л аденин.

1. Подготовка раствора глюкозы (50% w/v). Для 1 Л, растворить в 500 g D-(+)-глюкозы в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Отрегулируйте громкость до 1000 мл с помощью мерного цилиндра и фильтр через 0,2 мкм стерильным фильтром в бутылку хранения СМИ стерильные 1000 мл.
2. Подготовьте дрожжевой экстракт Пептон Декстроза (YPD) пластины. Для 1 Л, растворяют 20 g Пептон и 10 г дрожжей экстракт в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 960 мл дистиллированной водой. Налить в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавить 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 40 мл 50% глюкозы. Смешайте хорошо крутятся.
   1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
3. Подготовить полный синтетических минимальный СМИ (CSM)-Trp пластины. Для 1 Л, растворяются 6,7 г дрожжей азота базы без аминокислот в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 960 мл дистиллированной водой. Налейте в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавьте 0,7 г - Trp-встретился отсева микс, 20 мг метионин и 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 40 мл 50% глюкозы. Смешайте хорошо крутятся.
   1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
4. Подготовьте CSM-леи-Met пластины. Для 1 Л, растворяются 10.05 г дрожжей азота базы без аминокислот в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налить в мензурку и заполнить до 940 мл дистиллированной водой. Налейте в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавить 1,005 г - леи-встретил отсева смеси и 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 60 мл 50% глюкозы. Смешайте хорошо крутятся.
   1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
5. Подготовьте CSM-леи-Trp пластины. Для 1 Л, растворяются 10.05 г дрожжей азота базы без аминокислот в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 940 мл дистиллированной водой. Налейте в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавить 1,005 г - Trp-лей + 40Ade отсева микс, 240 мг аденин и 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 60 мл 50% глюкозы. Смешайте хорошо крутятся.
   1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
6. Подготовьте CSM-леи-Trp-его тарелки. Для 1 Л, растворяются 10.05 г дрожжей азота базы без аминокислот в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 940 мл дистиллированной водой. Налейте в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавьте 0.975 g - Trp-леи-его + 40Ade смесь отсева, 240 мг аденин и 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 60 мл 50% глюкозы. Смешайте хорошо крутятся.
   1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
7. Подготовьте CSM-леи-Trp-его 3AT пластины. Для 1 Л, растворяются 10.05 г дрожжей азота базы без аминокислот в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 940 мл дистиллированной водой. Налейте в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавьте 0.975 g - Trp-леи-его + 40Ade смесь отсева, 240 мг аденин и 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 60 мл 50% глюкозы. Смешайте в 100 мкл стерильные запас 1 M 3-амино-1,2,4 триазола (3AT), закрученной.
   1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
8. Подготовьте LB-Kanr пластины. Для 1 Л, Растворите 10 g Триптон, 5 г дрожжей экстракт и 10 г NaCl в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 1000 мл дистиллированной водой. Налить в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавить 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Добавьте 50 мг канамицин и смешать с закрученной.
   1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
9. Подготовьте YPD, CSM-леи-Met, CSM-ГТО, CSM-леи-ГТО и CSM-леи-Trp-его средств массовой информации. Описанные выше для пластин за исключением вместо вливаются в колбу Эрленмейера, налить в бутылку для хранения средств массовой информации и опустить агар.
10. Подготовка bYPDA (буферизованное YPDA). Возьмите стерильные YPD СМИ и добавить 200 мг/Л аденин в стерильной дистиллированной воде. Скорректировать рН 3,7 с HCl. фильтра через 0,2 мкм стерильным фильтром в стерильных бутылку.
11. Подготовить преобразования буфера: 2 M сорбитол, дигидрат ацетат лития 1 М, 10 мм трис рН 7,6, 0.5 мм ЭДТА, кальция хлорид 0,2 мм в дистиллированной воде. Фильтрация через фильтр 0.2 мкм стерильным в стерильных бутылку.
12. Подготовить PEG решение: 70% w/v полиэтиленгликоля 3350 в дистиллированной воде. Стерилизуйте в автоклаве.
13. Подготовить вертеть: 8 M мочевины, SDS 4% w/v, 50 мм трис рН 6,8, 10% v/v глицерина, 0,02% w/v бромфеноловый синий в стерильной дистиллированной воды.
14. Подготовить sTE (сильный TE): 50 мм трис, 20 ЭДТА, рН 8,0 в дистиллированной воде. Фильтрация через фильтр 0.2 мкм стерильным в стерильных бутылку.
15. Подготовить раствор Zymolase: 10 мг/мл Zymolase 100т в 50 мм калия фосфат двухосновной pH 7.5, 50% v/v глицерин буфер в стерильной дистиллированной воды (хранятся при температуре-20 ° C).

2. клонирование и проверка приманки плазмиды

Примечание: Строительство Gal4-ДНК связывающих домена плазмид. В настоящее время существует целый ряд коммерчески доступных и академически доступны Y2H систем. DEEPN может вместить многие из них, условии, что приманка плазмида выражения протеина интереса, сливается в ДНК связывающих домен находится в TRP1-содержащих плазмиды. Другие требования, ниже по течению, что последовательность сразу вверх по течению добычу библиотеки известен вставки и позитивного взаимодействия Y2H может быть забит с производством His3 позволяет для выбора в средствах массовой информации не хватает гистидина. Здесь мы будем описывать использование новой плазмида Y2H приманку (pTEF ГПБ, рис. 2), однако, могут также использоваться другие приманки плазмид Y2H, включая pGBKT7. Для строительства и оценки приманки плазмид мы будем описывать использование pTEF ГПБ. Общее замечание мы рекомендуем гена синтеза производить открытое чтение кадр, который придерживается предвзятости кодон дрожжей чтобы обеспечить хорошее выражение и легкость с клонирования. Убедитесь, что клонирования схема позволяет приманку, чтобы быть в рамка с Gal4 ДНК-связывающий домен и что при клонировании в 3' сайт, стоп-кодон следующим регионе приманки кодирования.

1. Подготовьте вектор плазмиды. Плазмида pTEF ГПБ позволяет для клонирования шифруя протеин интереса либо 5' и 3' региона кодирования Gal4 ДНК-связывающий домен, с помощью метода быстрой сборки. Для вставки на 5' сайте, дайджест 3 мкг pTEF ГПБ Нари и EcoRI или для вставки на сайт 3', дайджест с BamHI и XhoI для 2-4 ч. Electrophorese образца ДНК агарозы 1% гель содержащие 0,2 - 0,5 мкг/мл ethidium бромид (бромистый этидий) на 100 г. акцизный вырезать 5,630 bp КТЭ-ГПБ и очистить с помощью комплекта извлечения геля ДНК в соответствии с инструкциями производителя и количественного определения ДНК путем поглощения на 260 Нм на спектрофотометре¹².
   Примечание: Поколение приманки кодирования вставок. Фрагменты ДНК кодирования белков или фрагменты белка интерес может быть изготовлен с использованием гена синтеза и доступны как uncloned фрагменты. Рекомендуется, что кодоны оптимизированы для выражения в Saccharomyces cerevisiae и онлайн инструменты для оптимизации кодон, включены в список материалов.
2. Для 5' вставки, обрамляют фрагмента ДНК кодирования кодон начала ГПТ, 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 'и 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3, соответственно. 3' вставки в рамке с связывающий домен Gal4 ДНК, обрамляют фрагмента кодирования, 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 "и 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3».
3. Для строительства плазмида используйте метод быстрой сборки согласно инструкциям производителя для клонирования фрагментов в резки pTEF ГПБ.
   1. Плита все превращается E. coli на LB-Kanr пластины и проинкубируйте 16-20 ч при 37 ° C. Колонии жилья pTEF ГПБ с требуемой вставки могут быть идентифицированы по амплификации PCR используя олигонуклеотиды: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' и 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' Вставка и 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' и 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' по 3' вставить. Эти олигонуклеотиды может также служить грунты для секвенирования insert.
   2. План по подготовке > 10 мкг каждого pTEF ГПБ производной и pTEF ГПБ самостоятельно предоставлять материалы для преобразования последовательности и дрожжи.
   3. Используйте следующие условия PCR: 3 мин при 98 ° C, а затем 25 циклов 30 s на 98 ° C, 30 s при 55 ° C и 2 мин при 72 ° C, а затем 5 мин при 72 ° C, используя буфер, содержащий 2,5 мм₂ MgCl , 0.5 U/100 мкл ДНК-полимеразы и проприетарные буфера.

3. выражение домена Gal4-ДНК связывающих белков Fusion

1. Сделайте компетентным дрожжей.
   1. Полоса из PJ69-4A дрожжей на YPD пластину, принимая стерильные деревянные аппликатор, соскоб 1 мм³ -80 ° c замороженных фондовых и растирая его мягко через пластину YPD. Переместите деревянным аппликатором вниз пластину, так что каждый проход идет через нетронутые частью поверхности СМИ. Инкубируйте YPD пластины при 30 ° C в течение 2 дней или до тех пор, пока один колоний видны. Сделать замороженные запасы PJ69-4A дрожжей, приостановив дрожжи в воде или роста СМИ, дополняющего с ДМСО до 7% и хранения при температуре-80 ° C.
   2. Прививок одной колонии в 5 мл культуры YPD в трубу культуры 20 мм x 150 мм, с помощью стерильных аппликатор деревянные и расти на ночь при 30 ° C в тряску инкубатор на 200 об/мин.
   3. Прививать 50 мл YPD в 250 мл стерильную колбу Эрленмейера с 4 мл ночь культуры PJ69-4A штамм дрожжей. Растут в пожимая инкубатора при 30 ° C, 200 rpm оптической плотности (₆₀₀OD) приблизительно 1.2, как определено методом спектрофотометрии с пути света стандартного 1 см. Рост обычно занимает 5-7 ч.
   4. Изолируйте дрожжей, седиментации в 50 мл конические пробки на 4,696 g x 5 мин при комнатной температуре в центрифуге benchtop. Выбросите супернатант сбросами в жидких отходов. С помощью пипетки, Ресуспензируйте гранулы в 5 мл буфера для преобразования и передачи 15 мл Конические трубки. Resediment чтобы отменить супернатанта и Ресуспензируйте дрожжи в 1 мл окончательный объем преобразования буфера с 1000 мкл пипетки.
   5. Инкубировать дрожжевых клеток для 60 мин при 30 ° C при встряхивании в 200 об/мин, а затем поместить на льду за 30-90 мин.
2. Дрожжи плазмида преобразование.
   1. 1,5 мл стерильного microcentrifuge трубки добавьте 1 мкг на основе pTEF ГПБ плазмиды и 5 мкл 10 мг/мл спермы лосося перевозчика ДНК решения. Также включать трубка, содержащая только лосося спермы перевозчик ДНК как элемент негативные трансформации. Добавьте 100 мкл суспензии клеток ледяной дрожжей в каждую пробирку, пипетки. 100 мкл 70% PEG решение с 1000 мкл пипетки и смешайте нежно, стряхивая трубки 5 - 10 раз (делать не вихрь).
   2. Инкубируйте на 30 ° C, в дрожь инкубатор на 200 об/мин за 45 мин.
   3. Теплового шока при 42 ° C 15 мин.
   4. Осадков в microcentrifuge в 845 g x 3 мин при комнатной температуре, Пипетка с удалить супернатант, Ресуспензируйте Пелле в 150 мкл стерильной воды, закупорить вверх и вниз и распределяют по поверхности плиты CSM-ГТО.
   5. Разместите таблички справа вверх в инкубаторе 30 ° C и проинкубируйте 2-3 дня до тех пор, пока колоний видны. Плиты могут быть перевернуто во избежание образования конденсата на поверхности пластины после инкубации при 30 ° C для 6-12 ч.
   6. Взять 2-3 колоний за преобразования и полоска как патч на CSM-Trp пластину с помощью стерильных зубочисткой. Позволяют расти в течение 24 ч при температуре 30 ° C.
3. Сделайте лизатов для выражения протеина.
   1. Прививок 3 мл жидких сред CSM-ГТО с размером матч руководитель дрожжей из патча и расти на ночь при 30 ° C в трубке культура 20 мм x 150 мм, при встряхивании в 200 об/мин. Сделайте два ночи культур на приманку и пустой pTEF ГПБ вектора.
   2. Добавьте 1 mL YPD для каждого 3 мл CSM-Trp ночь культуры. Расти в течение 1 ч при 30 ° C, при встряхивании в 200 об/мин. Проверьте на од клеток, спектрофотометр.
   3. Отложения эквивалентное количество клеток, нормализующее согласно ОД. Используйте стерильные 1,5 мл microcentrifuge трубок с 5 мин спина на 2348 x g при комнатной температуре в microcentrifuge. Использование пипетки отказаться супернатант. Окончательный акций соответствует как минимум 2.1 ОД.
      Примечание: При расчете эквивалентное количество клеток, это может произойти, что разные тома может потребоваться от каждой ночи культуры для достижения минимальной 2.1 ОД.
   4. Ресуспензируйте гранулы в 450 мкл 0,2 М NaOH, закупорить вверх и вниз. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре. Recentrifuge клетки на 2 мин на 2348 x g при комнатной температуре и отбросить супернатант в пипетку.
   5. Ресуспензируйте лепешка с 50 мкл буфера ВЕРТЕТЬ, закупорить вверх и вниз тщательно, чтобы не сделать пузыри. Пример тепла для 5 мин при 70 ° C.
4. Проверка выражения протеина SDS-PAGE.
   1. Использование градиента гель 4-20%, обеспечить широкий спектр молекулярным весом могут быть решены. Эквивалент нагрузки (же OD) образцов в SDS-PAGE гель и не забудьте включить по крайней мере один образец, содержащий в неизмененном pTEF ГПБ вектор^13,14,15.
   2. После электрофоретического разделения передачи гель нитроцеллюлозы и immunoblot с помощью моноклональных и поликлональных антител анти myc и ECL обнаружения раствора (рис. 3).

4. самостоятельной активации теста

1. Полоса из дрожжей MATalpha от соответствующего жилья добычу библиотека интерес на пластину YPD, принимая стерильных аппликатор деревянные, соскоб небольшое количество дрожжей из флакона и мелирование через пластину YPD штамм акций-80 ° C. Инкубируйте YPD пластины при 30 ° C в течение 2 дней или до тех пор, пока один колоний видны. Патч пару один колоний на YPD пластину и Инкубируйте на ночь на 30 ° C.
   Примечание: Новый штамм, разработанных здесь дом добычу библиотеки является PLY5725, тогда как некоторые совместимый коммерчески доступных библиотек Y2H размещены в Y187.
2. Выполните процедуры, описанные в 3.3.1 - 3.3.4 для преобразования PLY5725 с LEU2-на основе плазмид, используются для размещения библиотеки желаемого добычу. Для библиотек, разработанных здесь, соответствующий плазмида является pGal4AD (pPL6343). Чтобы восстановить трансформантов дрожжи, пластину на CSM-леи-Met пластины. После колонии возникают, полоска как патчи на CSM-леи-Met пластину и инкубировать в течение 24 ч при температуре 30 ° C.
3. Следуйте протокола в 3.4 для подтверждения выражение pPL6343 пустой вектор с использованием анти-Ха моноклональных и поликлональных антител и решения обнаружения ECL.
4. Streak которую каждый преобразованный PJ69-4A дрожжей в крест узор с PLY5725 строит на YPD пластина, которая была подтверждена выразить белка в протоколе раздел 3.4 и 4.3 и Инкубируйте на 30 ° C на ночь. Возьмите 1 мм³ клеток, где два штаммов выросли вместе и патч на отдельные CSM-леи-Met, CSM-ТРП и CSM-Trp-леи пластин и расти 24 h.
   Примечание: Желаемый diploids будет расти на тарелках CSM-Trp-лей. Рост на CSM-леи-мет и CSM-Trp плиты служат положительный контроль для роста дрожжей.
5. Расти diploids в 1 мл CSM-Trp-леи СМИ на ночь на 30 ° C. Осадков 500 мкл клетки в 1,5 мл microcentrifuge трубки на 2348 x g, 3 мин при комнатной температуре в microcentrifuge. Отказаться от супернатанта, пипетки. Ресуспензируйте клеток в 1 мл стерильной воды и повторите седиментации и ресуспендирования. Проверка ОД₆₀₀ клеток.
6. Сделать серию 1:10 серийных разведений каждого суспензии клеток, используя стерильную воду с начиная с наиболее концентрированный раствор каждого в ОД 0.5. SPOT 5 мкл каждого разведения на тарелку CSM-леи-ГТО, CSM-леи-Trp-его тарелку и CSM-леи-Trp-его + 3AT пластины. Инкубируйте на 30 ° C и проверить для роста ежедневно в течение 3 дней (рис. 4).
   Примечание: для 1:10 серийный разрежения, Пипетка 10 мкл трубка, содержащая ОД 0,5 в 90 мкл воды и перемешать, закупорить вверх и вниз. Продолжать делать 1:10 серийных разведений, пока есть в общей сложности шесть различных концентраций в месте.

5. Создайте дрожжей населения с приманкой и добычей Библиотека

Примечание: Y187 штамм, который дома коммерческой добычи библиотека плазмиды также не мат. Таким образом следующие оптимизированные условия требуются для поддержания сложности библиотеки. PLY5725 штамм содержащие Y2H добычу библиотек товарищей лучше и же спаривания процедура может использоваться с этот штамм (рис. 5).

1. Прививать 3 мл культур каждого из трансформантов PJ69-4A, перевозящих различные TRP1-содержащих pTEF ГПБ приманки плазмида в CSM-ГТО СМИ в трубке культуры. Включает два отдельных культур, содержащих pTEF ГПБ вектор плазмиды самостоятельно выступать в качестве процедурного контроля. Инкубировать культур при 30 ° C, 200 rpm для 6 h и затем разбавляют в 25 мл в стерильную колбу Эрленмейера ночь роста культуры.
2. Разморозить замороженные (-80 ° C) флакон MATalpha клетки, содержащие LEU2-проведение «добычей» библиотека при комнатной температуре. Прививать 125 мл CSM-леи-Met СМИ в стерильную колбу Эрленмейера с целом талой флакона. Растут всех культур на ночь на 30 ° C с встряхивания на 200 об/мин.
   Примечание: OD₆₀₀ ночи культур необходимо диапазоне от 1,0 до 1,5 перед переходом к следующим шагам.
3. Центрифуга 21 ОД эквиваленты каждого из культур transformant PJ69-4A с 5 мин спина на 4,696 x g при комнатной температуре. За каждые 10 спаривания реакции желаемого, Пелле 39₆₀₀ эквиваленты ОД MATalpha штамма, перевозящих библиотека плазмид в отдельных 50 мл конические трубы.
   1. Ресуспензируйте клетки в 10 мл стерильной воды и повторно Пелле в новой 50 мл Конические трубки 4,696 x г 5 мин при комнатной температуре в центрифуге benchtop. С помощью пипетки, аккуратно удалите супернатант без нарушения гранулированных клетки.
   2. Ресуспензируйте гранулы PLY5725 клеток в 10 мл bYPDA (рН 3,7) и PJ69-4A клеток в 4 мл.
4. Для настройки спаривания реакций, добавить 1 мл PJ69-4A преобразовали клетки, 1 мл MATalpha библиотека содержащих клеток и 1 мл bYPDA рН 3,7 до новой 50 мл Конические трубки. Инкубируйте на 30 ° C с нежным орбитальных агитации (100-130/мин) 90 мин.
   1. Центрифуга клетки для 5 мин при 4,696 x g, при комнатной температуре в центрифуге benchtop. Удалить супернатант пипетки и Ресуспензируйте гранулы в 2 мл bYPDA:YPD 1:1. Пластина все 2 мл на 100 мм YPD пластину на пипетку и Инкубируйте на 30 ° C около 20 мин.
5. Урожай клетки от YPD плит с помощью скребка ячейки выбить клетки в 2-3 мл CSM-леи-ГТО СМИ. Пипетка выбили клетки в 50 мл Конические трубки. Промойте пластины 4 - 5 раз с 2-3 мл CSM-леи-ГТО СМИ, закупорить вверх, что средства массовой информации, используя 1000 мкл Пипетка и осторожно извлечь средства массовой информации по всей поверхности пластины YPD.
   1. Центрифуга клетки для 5 мин при 4,696 x g при комнатной температуре в центрифуге benchtop. Отказаться от супернатанта, дозаторов и Ресуспензируйте клетки в 40 мл CSM-леи-ГТО СМИ, закупорить вверх и вниз (ДУ не вихрь).
6. Чтобы оценить количество формируется диплоидный клеток, разбавляют 4 мкл диплоидных смеси в 200 мкл и 2000 мкл CSM-Trp-леи СМИ. Плита 200 мкл каждого разведения на тарелку CSM-леи-ГТО.
   Примечание: Две пластины представляют мэм и картирование раз разведение акций diploids собирают и приносит ожидаемый ~ 9000-27000 колоний на пластину разрежения мэм после инкубации при 30 ° C для 36-40 ч. Проверка пластин после шага 5.7. Минимальное количество 200 колоний на пластину разрежения мэм необходим для перехода к шагу 5.8
7. Немедленно занять оставшуюся часть каждого 40 мл клеток ресуспендирования и прививать 1000 мл колбу Эрленмейера, содержащий 500 мл CSM-леи-ГТО СМИ. Возьмите первоначальный ОД₆₀₀. Инкубируйте эти фляги при 30 ° C с встряхивания на 180 об/мин, до тех пор, пока они достигают насыщения (~2.0 ОД/мл). Это обычно занимает около 36-40 ч. рост монитор на 24 ч потом снова на 36 h ОД₆₀₀.
8. С помощью пипетки, удалите 20 мл аликвоты каждого из насыщенных 500 мл культур и innoculate 2000 мл Эрленмейер колбы, один содержащие 750 мл CSM-леи-ГТО СМИ и второй содержащие 750 мл CSM-леи-Trp-его с низким уровнем 3AT, устраняет фон (ранее определяется в разделе 4.5). Mix новых культур (770 мл) хорошо крутятся и принять первоначальный ОД₆₀₀.
9. Инкубируйте культур при 30 ° C во время тряски на 180 об/мин до достижения насыщения, который обычно происходит в течение 24 ч для невыбранных CSM-леи-Trp культуры и может занять более 70 h для культур под выбор для Y2H взаимодействия.
10. После культуры достигли насыщения (ОД ~ 2.0), удалить 11 мл с пипеткой, отложений клетки с 5 мин спина на 4,696 x g при комнатной температуре, отказаться от супернатанта, пипетки и заморозить при температуре-20 ° C или продолжить на экстракции ДНК. Образцы выбранных и невыбранных будет использоваться для глубокого последовательности.

6. Пробоподготовка для секвенирования глубоко DEEPN

1. Экстракции ДНК.
   1. Используйте пипетку для Ресуспензируйте клеток окатышей из протокола раздел 5.7 в 500 мкл буфера sTE и передачи для 1.5 мл пробки microcentrifuge. Добавьте 3 мкл betamercaptoethanol и 10 мкл Zymolase запасов. Хорошо перемешайте и инкубировать в инкубаторе 37 ° C для 24-36 ч.
   2. Извлечь образец два раза с 500 мкл фенол/хлороформ/изоамилового спирта при использовании вытяжки дыма¹⁶.
   3. Добавление 7 мкл 4 М NaCl, 900 мкл ледяной 100% этанола (ETOH), микс от инверсии и либо замораживания-20 ° C или продолжать отложений ДНК, спиннинг на 21,130 x g 10 мин при комнатной температуре в microcentrifuge.
   4. Отказаться от супернатанта, пипетки. Помыть лепешка трижды с 900 мкл 70% ETOH.
   5. Отложениях Пелле 21,130 g x 2 мин и удалить остаточные ETOH мыть с пипеткой. Сухие гранулы для 7 мин при 42 ° C.
   6. Ресуспензируйте Пелле в 120 мкл 0.1 x sTE в ванну воды 37 ° C, 90 мин, Флик трубы смешивать каждые 30 мин.
   7. Пипетка 60 мкл ДНК в стерильных 1,5 мл пробки microcentrifuge. 120 мкл sTE, 3.5 мкл РНКазы A акций, Флик смешивать и инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч.
   8. Преципитат этанола, как ранее сделали в раздел 6.1.3 - 6.1.5, но использовать 7 мкл ацетата аммония 5 М вместо 4 М NaCl.
   9. Ресуспензируйте РНКазы A-обработал дна в 55 мкл 0.1 x sTE в ванну воды 37 ° C, 90 мин, Флик трубы смешивать каждые 30 мин Quantify ДНК путем поглощения на 260 Нм на спектрофотометре.
2. ПЦР cDNA вставляет.
   1. Выполняют два, 50 мкл ПЦР-реакции на образец ДНК. Каждый реакции содержит 25 пмоль каждого прямого и обратного грунтовки, соответствия плазмида добычу библиотеки (см. материалы). Реакции также содержат 25 мкл высококачественный 2 x PCR Мастер микс, 5 мкг ДНК образца и воды до 50 мкл. Amplify реакций для 25 циклов с расширение раз 3 мин при 72 ° C, обжигают Температура 55 ° c за 30 сек и денатурировать на 98 ° C для 10 s. предшествует Велоспорт по 30 s денатурации 98 ° C и следовать с 5 минут инкубации при 72 ° C.
   2. Анализ 4 мкл каждого реакции PCR, электрофорез геля агарозы 1% ДНК с дна агарозы гель содержащие 0,2 - 0,5 мкг/мл бромистый этидий¹⁷. Визуализации образца ДНК путем просвечивания УФ. Образцы покажет что мазок ДНК около 1-3 КБ, где диапазонов шаблон может быть найдена для образцов, где взаимодействие Y2H был выбран (рис. 6).
   3. Объединить повторяющиеся образцы ПЦР и очистить, используя комплект для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя и количественного определения ДНК путем поглощения на 260 Нм на спектрофотометре.

7. глубокая последовательности

Примечание: Пробоподготовка и последовательности на платформе глубокий последовательности обычно доступен в коммерческих и академических учреждениях ядро секвенирования ДНК.

1. Сдвига 600 нг ПЦР продукта с помощью высокопроизводительных ультра sonicator дать фрагменты средней длиной ~ 300 bp.
2. Создания индексированных последовательности библиотек с помощью подготовки комплекта для глубоких последовательности, которая добавляет линкеры кодирования штрих-кодов, грунтовка сайтов, и захват последовательности несимметрично на концах фрагментов ДНК.
3. Выполните подготовку библиотека согласно инструкциям производителя. Бассейн индексируются библиотек и последовательности, как долго в паре конец читает на платформе глубокую последовательности (например, 2 x 150 bp PE прочтений). Нужное количество операций чтения для каждого образца находится между 10 и 40 миллионов, с более читает, требуемой для невыбранных групп населения, которые являются более сложными, как правило. Мы рекомендуем по крайней мере 20 миллионов или более читает для невыбранных групп населения.

8. Bioinformatic обработка и проверка

1. Процесс ДНК последовательности данных в виде fastq с набором автономные программного обеспечения, программы построены для (1) карта последовательности чтения файлов в формате универсального Сэм (2) количественно гена обогащения между наборами данных (3) выполнять статистический анализ данных в Чтобы ранжировать какой кандидат гены являются позитивными для взаимодействия Y2H () 4) предоставлять информацию о том, что регион(ы) и какие поступательные кадр каждый cDNA добычу за гена фрагменты, дают позитивные Y2H взаимодействия состоят, и (5) инструменты для восстановления не только 5' но и 3' концу взаимодействующих фрагментов, позволяя их реконструкции и проверки в традиционном формате Y2H. Работы этих программ подробно в исследовании, сопровождающих.

Результаты

Y2H assay широко используется для поиска: протеин взаимодействия и несколько систем и адаптации были разработаны. По большей части те же соображения, которые помогут обеспечить успех этих предыдущих подходов имеют важное значение для DEEPN. Некоторые из важных контрольных ?...

Обсуждение

Здесь мы предоставляем руководство по как для выполнения анализов Y2H в пакете с помощью оптимизированные методы. Есть несколько критических шаги процедуры, чтобы помочь обеспечить население дрожжей, который будет находиться в разделе выбор представителя начала библиотеки и что доста?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Illumina HiSeq 4000	Illumina		deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies	Biolegend	901514	Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies	QED Biosciences Inc	18826	Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI	New England BioLabs	R0191S
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S
BamHI-HF	New England BioLabs	R3236S
XhoI	New England BioLabs	R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder	J.T. Baker	U2211-08
Salmon Sperm DNA	Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific	50-948-286	carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate	Research Products International	K22000
LE Agarose	GeneMate	E-3120-500	used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride	Research Products International	S23025
Tryptone	Research Products International	T60060
D-Sorbitol	Research Products International	S23080
Lithium Acetate Dihydrate	MP Biomedicals	155256
Calcium Chloride	ThermoFisher	C79
EDTA Sodium Salt	Research Products International	E57020
Yeast Extract Powder	Research Products International	Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids	Research Products International	Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE	Formedium	DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE	Formedium	DCS1169
CSM-Leu-Met	Formedium	DCS0549
CSM-Trp-Met	Bio 101, Inc	4520-922
L-Methionine	Formedium	DOC0168
Adenine	Research Products International	A11500
D-(+)-Glucose	Research Products International	G32045
Bacto Agar	BD	214010	used for making media plates in section 1
Peptone	Research Products International	P20240
3-amino-1,2,4 Triazole	Sigma	A8056
2-Mercaptoehanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250
Zymolyase 100T	USBiological	Z1004
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P8281
Phenol:Chloroform:IAA	Ambion	AM9732
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	238074
Ethanol	Decon Laboratories, INC	2716
RNAse A	ThermoFisher	EN0531
Urea	Research Products International	U20200
SDS	Research Products International	L22010
glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Tris-HCl	Gibco	15506-017
bromophenol blue	Amresco	449
Gibson Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5510S	Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541S	Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide	Amresco	0492-5G
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit	KAPA Biosystems	KK8500	preparation kit for deep sequencing
Codon optimization	http://www.jcat.de
Codon optimization	https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks	Integrated DNA Technologies		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings	Thermofisher		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit	EPOCH Life Sciences		Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220	Covaris		high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain	http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436		MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
PLY5725 MATalpha yeast strain	Dr. Robert Piper Lab		MATalpha his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 gal4∆ trp1∆ Gal80∆
pGal4AD (pPL6343)	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes	Kord-Vallmark sold by VWR	2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube	Thermofisher	14-961-33
pipet-aid	Drummond	4-000-100
5 mL Serological Pipette	Denville	P7127
10 mL Serological Pipette	Denville	P7128
25 mL Serological Pipette	Denville	P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker	Fisher Scientific	02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle	Fisher Scientific	06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder	Fisher Scientific	08-572-6G
SpectraMax 190	Molecular Devices		used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000	Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator	Ultra Lum	MEB 20	used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123602G
P200 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123601G
P20 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123600G
P10 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips	GeneMate	P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips	VWR	10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips	VWR	10017-042
50 mL conical tube	VWR	490001-627
15 mL conical tube	VWR	490001-621
cell scraper	Denville Scientific	TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
HCl	Fluka Analytical	318949-1L
NaOH	J.T. Baker	5674-02
Wooden applicators	Solon Care	55900
Eppendorf microcentrifuge 5424	Fisher Scientific	05-400-005	microcentrifuge
Sorvall ST16R	Thermo Fisher Scientific	75004381	benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)	GE Healthcare	NA934-1ML	Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)	GE Healthcare	NA931-1ML	Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Fisher Scientific	34080	ECL detection solution
Isotemp Incubator	Thermo Fisher Scientific		Incubator
Mutitron 2	INFORS HT		Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205	Fisher Scientific		water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)	Clontech	630482	commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)	Clontech	630488	commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector	Clontech	630442	commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector	Clontech	630443	commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase	Bioline	BIO-21042	DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler	BioExpress	P-6050-60	pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes	USA Scientific	1405-8100