النقل المتعدد الوسائط "الشبكية الحجمي التصوير المائل المسح الضوئي الليزر تنظير العين" (أوسلو) و "التصوير المقطعي التماسك الضوئية" (OCT)

Summary

نقدم هنا، وضع بروتوكول للحصول على مجال الرؤية الكبيرة (FOV) ثلاثي الأبعاد (3D) الأسفار والصورة الشبكية OCT باستخدام منصة تصوير المتعدد الوسائط رواية. وسوف نقدم إعداد النظام، والطريقة للمحاذاة، والبروتوكولات التنفيذية. سوف يتجلى في فيفو التصوير، وستقدم النتائج التمثيلية.

Abstract

بينما تصوير fluorescence يستخدم على نطاق واسع في طب العيون، صورة شبكية ثلاثية الأبعاد (3D) الأسفار مجال الرؤية كبيرة (FOV) لا يزال تحديا كبيرا مع الشبكية الدولة من فن التصوير طرائق لأنها سوف تتطلب التراص z إلى ترجمة dataset حجمي. نظم الأوعية (ثماني) أكتوبر والأحدث من التصوير المقطعي التماسك الضوئية (OCT) التغلب على هذه القيود لتوفير صور تشريحية والأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد (3D)، ولكن لا يمكن تصور طبيعة خالية من صبغة أكتوبر التسرب يدل على الأوعية الدموية خلل وظيفي. ويصف هذا البروتوكول منحدر رواية المسح الضوئي الليزر تقنية تنظير العين (أوسلو) الذي يوفر fluorescence الحجمي 3D تصوير الشبكية. الإعداد لنظام التصوير يولد مائلة المسح بمنزلق ذيل حمامة وتؤيد نظام التصوير النهائي في زاوية للكشف عن الصور المقطعية الفلورسنت. النظام يستخدم ليزر المسح أسلوب، وذلك، يسمح من سهل إدراج أكتوبر كطريقة تصوير هيكلي حجمي تكميلية. ويتجلى في فيفو التصوير على الفئران الشبكية هنا. يتم حقن محلول فلوريسسين عن طريق الوريد لإنتاج الأوعية fluorescein الحجمي (اللجنة).

Introduction

علم أمراض العيون والرؤية تستفيد كثيرا من تقنيات التصوير الضوئي الحديثة، منذ الشبكية يمكن يمكن الوصول إليها بسهولة مع الضوء. تصوير الشبكية الأسفار هو أداة أساسية في تشخيص وعلاج أمراض الأوعية الدموية تشوريوريتينال مثل اعتلال الشبكية السكري (DR) والمتصلة بالعمر البقعي (AMD)، التي هي الأسباب الرئيسية للعمى في الولايات المتحدة.

ومع ذلك، أنها لا تزال تمثل تحديا للحصول مجال الرؤية الكبيرة (FOV)، وثلاثي الأبعاد (3D) الشبكية التصوير باستخدام التصوير بالأسفار. ليس لديه القدرة على حل عمق التصوير النظارة ولا ترفض ضوء منتشر. خلط من إشارات من عمق مختلفة نتيجة لذلك يقلل من جودة الصورة. تنظير العين ليزر المسح (سلوفاكيا) و [كنفوكل] سلوفاكيا (كسلو) يمكن التقليل من تأثير الإضاءة باستخدام النابضة [كنفوكل]¹. بيد أنه من الصعب بالنسبة لسلوفاكيا أو كسلو للحصول على صورة شبكية بشرية ثلاثية الأبعاد بسبب الحد من التركيز عمق. يمكن أن توفر البصريات التكيفية سلوفاكيا (أوسلو) القرار رائع والتباين عن طريق تصحيح لانحرافات واجهة الموجه وعرض بالعين البشرية. ومع ذلك، أوسلو سوف لا تزال بحاجة التراص z ل التصوير الحجمي². التغلب على هذه القيود لتقديم ثلاثي الأبعاد (3D) الصور التشريحية والأوعية الدموية،^4،،من⁵⁶، ولكن طبيعة خالية من صبغة التماسك الضوئية التصوير المقطعي (OCT)³ ونظم الأوعية (ثماني) أكتوبر من أكتوبر لا يمكن تصور التسرب يدل على الخلل في الأوعية الدموية.

ويصف هذا البروتوكول رواية منهاج متعدد الوسائط للشبكية fluorescence الحجمي 3D التصوير، وهما المائل المسح الضوئي الليزر تنظير العين (أوسلو). في نظام التصوير، وهذا المسح منحرف يتم إنشاؤها بواسطة شريط تمرير ذيل حمامة، ونظام تصوير نهائي هو الانحياز في زاوية للكشف عن الأسفار عبر الصور المقطعية. يستخدم النظام ليزر المسح أساليب، وتسمح هذه التقنيات سهلة التأسيس مع أكتوبر كطريقة تصوير هيكلي حجمي تكميلية. القرار الحالي بعمق حوالي 25 ميكرومتر في شبكية الفئران ومجال الرؤية هو 30°. أساسا، أوسلو يسمح إصدار فلورسنت من أكتوبر ويمكن أن يقترن في وقت واحد في أكتوبر وثماني عبر FOV كبيرة.

في هذا البروتوكول، ونحن سوف تصف الإعداد من أوسلو وطريقة محاذاة والبناء وطريقة التصوير في فيفو الشبكية الفئران ونتائج الممثل.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "العناية بالحيوان" واستخدام اللجنة (أكوك) من مركز بوسطن الطبي.

1-نظام الإعداد

1. نظام أوسلو
   1. استخدام مصدر ليزر سوبيركونتينووم كمصدر الليزر للنظام.
      1. فصل نطاق الضوء المرئي (450-650 nm) من الطول الموجي الأعلى (650-2000 شمال البحر الأبيض المتوسط) بمرآة مزدوج اللون (DM1). توسيع النطاق مع زوج من المناشير المشتتة بعد شعاع يمر من خلال استقطاب شعاع الخائن (PBS).
      2. مكان فتحه لتحديد نطاق الطول الموجي الإثارة (475-495 نيوتن متر). استخدم مرآة عاكسة لتعكس شعاع المصفاة إلى زوج المنشور وثم الزوجين الضوء في وضع واحد ألياف بصرية (SMF 1).
      3. استخدام مطياف لتأكيد اختيار الطول الموجي في الإخراج من الألياف وضع واحد.
   2. قم بتوصيل الألياف وضع واحد اثنين المقرنات متعاقب الألياف الضوئية كما هو مبين في الشكل 2. واحد من منفذ إخراج الألياف من مقرنة الألياف الثاني يسلم على ضوء نظام أوسلو.
   3. كلمات الليزر أولاً في نظام أوسلو.
      1. يصرف الليزر بمرآة جلفانومتر (GM1). ترحيل الليزر لمرآة جلفانومتر ثانية (GM2) بنظام تلسكوب 1:1، وكذلك ترحيل لتلميذ العين بنظام تلسكوب 3:1.
      2. تثبيت مرآة مزدوج اللون (DM2) داخل منظومة تلسكوب 3:1 تعكس الإشارات الأسفار.
   4. جبل نظام التلسكوب 3:1 ومرآة مزدوج اللون (DM2) على شريط تمرير ذيل حمامة مخصصة إزاحة المحور البصري وإنشاء منحدر فحص الإضاءة كما هو مبين في الشكل 3. استخدام قدمه ذات الورنيّة للتحكم بدقة في طول الإزاحة كما هو مطلوب.
   5. مسار بصري التصوير الأسفار.
      1. وتعكس fluorescence مرآة مزدوج اللون وترحيل لمرآة جلفانومتر الثالث إلغاء المسح الضوئي المسح البطيء.
      2. تتابع الضوء إلى عدسة الهدف تصوير بنظام آخر تلسكوب 1:1. تثبيت البصريات أعلاه في مرحلة ترجمة.
         ملاحظة: يتم تثبيت مرحلتين الترجمة الإضافية تحت مرآة جلفانومتر الثالثة (GM3) لتوفير فائض في درجات الحرية للاستفادة المثلى من التصوير.
   6. جبل نظام تصوير نهائي في مرحلة ثلاث درجات من الحرية (التناوب، وهما محور الترجمة). استخدم كاميرا مستو لالتقاط الصور المقطعية الأسفار.
2. نظام التصوير المقطعي التماسك البصري
   1. استخدام نفس مصدر الليزر سوبيركونتينووم كمصدر الليزر للنظام.
      1. فصل النطاق (الجرد) الأشعة تحت الحمراء القريب (650-900 نانومتر) الضوء المتبقي (650-2000 شمال البحر الأبيض المتوسط) من جانب آخر مرآة مزدوج اللون (DM3). استخدام عامل تصفية تمرير طويل إلى زيادة الحد من عرض النطاق الترددي إلى 800-900 نانومتر. زوجين الشعاع في وضع واحد ألياف بصرية (SMF 2).
   2. قم بتوصيل الألياف واحدة وضع منفذ الإدخال الأخرى من المقرنات الألياف الضوئية متعاقب اثنين للجمع بين الإثارة أوسلو الأزرق. توجيه الضوء من منفذ الإخراج الثاني من مقرنة الألياف الثانية في الذراع مرجع OCT، التي لديها مرشح كثافة محايدة متغير (فندف)، ولوحات التعويض تشتت ومرآة عاكسة.
      ملاحظة: عاد الضوء من ذراع الإشارة والعين ريكومبينيس في مقرنة الألياف الضوئية الثانية ويتم تسليمها إلى مطياف أكتوبر لجمع الإشارة.
3. الحصول على البيانات
   1. استخدام برمجيات نظام اقتناء بيانات المكتوبة في LabVIEW وتعديلها من بروتوكول المسح ثماني^7،،من^89،10. لكل ب-المسح الضوئي، شهدت دورة عمل 80% للأسنان مع الخطوات 500 هو الإخراج بمجلس تمثيلي إخراج (AO1) للتحكم في x ' مرآة المسح السريع، GM2.
   2. تحريك الكاميرا خط المسح الضوئي في كل خطوة للحصول على البيانات أكتوبر عند المرأة في مسح الاتجاه إلى الأمام فقط. تعيين وقت التعرض للكاميرا خط المسح الضوئي لتكون المايكروثانيه 17.
   3. للحصول على إشارة ثماني، كرر بقياس 5 مرات في نفس الموقع ب-المسح الضوئي.
   4. تعيين معدل إخراج AO في 100 كيلو هرتز، ومعدل ألف خط أكتوبر في 50 كيلو هرتز. التحكم في ص ' مرآة المسح البطيء، GM1، قبل الموجي تكثف. مزامنة مرآة المسح الشطب، GM3، مع GM1 إلغاء المسح الضوئي المسح البطيء.
   5. تحريك الكاميرا مستو آخر إخراج تمثيلية المجلس (AO2) لالتقاط صورة الفلورسنت واحدة في كل ص ' الموقع. التصوير حجم المحاصيل أو بن بكسل جاره لزيادة سرعة وحساسية كما هو مطلوب.

2-نظام المحاذاة

1. ضبط الشق في أوسلو مصدر الضوء لتحديد الطول الموجي الإثارة الأزرق. استخدام مطياف لمراقبة النطاق الطيفي إلى حوالي 475-490 نانومتر.
2. قم بضبط منزلق جبل ذيل الحمامة إزاحة المحور البصري ب ~ 5 مم. هذا سيؤدي إلى إزاحة في التلميذ الفئران قبل مم ~1.7، نتج عنه بزاوية مائلة ~ 15 درجة مئوية على الشبكية.
3. ضبط مرحلة الترجمة للبصريات الكشف عن الأسفار عن 5 مم نفسه.
4. ضبط fluorescence النهائي يكون ~ 30° نظام التصوير.
5. قياس الطاقة الضوئية باستخدام مقياس طاقة. تأكد من قوة الإثارة أوسلو الأزرق هو ≤0.2 ميغاواط وأكتوبر الليزر السلطة ≤0.8 ميغاواط، مما لا يؤدي تلف الشبكية.
   ملاحظة: تستند إلى معيار ANSI، تعرض متساهلة الحد الأقصى (مبية) للشبكية على المستوى ~ 2mW^7،8 في نطاق الضوء المرئي. ووفقا للصيغة التي ديلوري et al. ⁹، مبية للضوء تحت الأحمر القريب أعلى بحوالي مرتين من الضوء المرئي، في حوالي 4 ميغاواط.

3-التجربة الحيوانية في فيفو

1. نقل الفئران "إيفانز طويلة" ذكور 12 أسبوعا في قاعة التعريفي. تخدير الفئران مع isoflurane 4.5% في الأكسجين لمدة 10 دقائق مع معدل تدفق 2 لتر في الدقيقة المبخر إيسوفلوراني.
   1. تأكيد عمق التخدير كما يحددها انعدام منعكس الانسحاب خلال قرصه الأفوات.
2. بعد التعريفي، مكان الفئران على حامل 5-محور (x و y، z الترجمات، ياو والملعب). توفير الحرارة تكميلية باستخدام مرحلة ساخنة، تعميم الماء الدافئ بطانية أو أي طريقة أخرى مناسبة في تجربة طويلة. المحافظة على التخدير في 1.5% إيسوفلوراني بمعدل 2 لتر/دقيقة تدفق خلال الجزء المتبقي من هذه التجربة. عند عدم استخدام دائرة التعريفي مع العادم النشطة، ينبغي أن توضع الدائرة التعريفي على طاولة backdraft أو رهاناتهم أو تحت غص مسح إيسوفلوراني.
3. تمدد التلميذ مع حل العيون تروبيكاميدي 1% لمدة دقيقتين. تطبيق 0.5% HCl جهاز حل العيون في العين في الفئران للتخدير الموضعي إضافية، إذا لزم الأمر. إبقاء العين رطبة بالدموع الاصطناعية التجارية على الأقل مرة واحدة كل دقيقة أثناء التجربة.
4. حقن فلوريسسين الملح (10% w/w) أو فيتك المخفف (10% w/w) في المحلول الملحي المعقم (0.1-0.3 مل) عن طريق الوريد الذيل مع 1 مل إبرة المحقن و ز 29.
5. قم بتشغيل مصدر الليزر. ضع مرشح كثافة محايدة للتخفيف من الإثارة الضوء الأزرق أثناء المحاذاة. قياس قوة الضوء أكتوبر ليكون ~0.8 ميغاواط، والضوء الأزرق < 0.01 ميغاواط لتجنب تشكيل إعتام عدسة العين.
6. بدء وضع جلفانومتر المسح الضوئي والمحاذاة. ضبط ارتفاع الكرة العين لجعل ليزر ثابتة بقعة على القرنية. ضبط موضع العين الفئران لجعل حافة التلميذ عمودي تقريبا بالليزر، وإزاحة الليزر إلى مركز قمي العين عن ~1.5 مم.
7. كذلك ضبط صاحب الحيوان حتى أكتوبر الصور تصل إلى الجودة المثلى. في x ' المسح السريع الاتجاه، تأكد من أن تظهر الصورة ب-تفحص مستعرضة شقة. عند التبديل إلى y ' بطء اتجاه المسح الضوئي، تأكد من الصورة ب-مسح المقطع العرضي تظهر مائلة، نتيجة المسح منحرف.
8. إزالة عامل تصفية الكثافة الطبيعية للإثارة الضوء الأزرق ورصد في الوقت الحقيقي التي تغذية من الكاميرا. وينبغي أن تظهر الصورة الفلورسنت مقطعية عبر إظهار الأوعية الدموية التي تظهر في أعماق مختلفة.
   1. ضبط تركيز الأسفار النهائي التصوير النظام للوصول إلى التركيز الأمثل. تسمح تعديلات دقيقة لوضع العين في الطائرة الأفقي للوصول إلى أفضل جودة الصورة في أوسلو.
9. بعد المحاذاة، يبدأ بالحصول على ثماني المتزامنة والأوعية fluorescein الحجمي (اللجنة).
10. إنشاء الصور الحجمي لثماني وأوسلو واسطة Matlab. سابقا وصف الخوارزميات بالتفصيل¹⁰. إنشاء حل عمق فاسكولاتوريس الشبكية بتجزئة الصورة.
11. بعد الانتهاء من التصوير، إيقاف الليزر والإفراج عن الحيوان وتطبيق بعض مرهم العيون في العيون، ومن ثم ضع الحيوان في مربع استعادة.
12. لا تترك الحيوان غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية أو ككل سياسة مؤسسية.

النتائج

ويبين الشكل 4a صورة أكتوبر مستعرضة للشبكية الفئران. الشكل 4b ج-4 إظهار نفس الصور المقطعية الشبكية للجنة ثماني وأوسلو المكتسبة في نفس الوقت. أوسلو تمكن مستعرضة فا مماثلة إلى أكتوبر ب-المسح الضوئي. بالمقارنة مع ثماني، صورة مستعرضة ال?...

Discussion

هنا، لقد قمنا بوصف أوسلو، في فيفو حجمي فلورسنت الشبكية التصوير تقنية مع أ فوف ما يزيد على 30 °. أكتوبر، معيار الحالية للرعاية التصوير الأسلوب في طب العيون، بالمقارنة مع أوسلو عروض مماثلة 3D التصوير القدرة بعد يسمح التباين الأسفار أن أكتوبر ليست حساسة ل. وميزة أوسلو هو أنه يتطلب مسح النق?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supercontinuum Laser Source	NKT Photonics	SuperK EXTREME EXU-OCT6
Dichroic Mirror (DM1)	Thorlabs	DMLP650R
Dichroic Mirror (DM2)	Chroma	ZT514/1064rpc
Dichroic Mirror (DM3)	Thorlabs	DMLP900R
Single Mode Fiber (SMF 1)	Thorlabs	P3-460B-FC-2
Single Mode Fiber (SMF 2)	Thorlabs	P3-780A-FC-2
Optic Fiber Coupler	Thorlabs	TW850R5A2
1:1 Telescope System	Thorlabs	AC254-100-A×2
3:1 Telescope System	Thorlabs	AC254-150-A×2
3:1 Telescope System	Thorlabs	AC254-50-A×2
Galvo Mirrors (GM1,GM2)	Thorlabs	GVS201×2
De-sacn Galvo Mirrors (GM3)	Thorlabs	GVS011
Objective Lens	Olympus	UplanSApo 20×/0.75
Final imaging system	Olympus	UplanFL N 10×/0.3
Final imaging system	Computar	12-36mm/1:2.8
Camera	PCO	Pco.pixelfly usb
Filter	Thorlabs	FEL0800
Mounted Continuously Variable ND Filter	Thorlabs	NDC-50C-4M-A
Line Scan Camera	Thorlabs	SPL2048-140K
Analog Output Board (AO1)	National Instrument	PCI-6731
Analog Output Board (AO2)	National Instrument	PCIe-6351
Long pass filter	Thorlabs	FEL0800