Multimodal volumétrica retina imágenes por exploración oblicua oftalmoscopia de láser (oSLO) y tomografía de coherencia óptica (OCT)

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para obtener una imagen retiniana OCT y fluorescencia (3D) tridimensional de gran campo de visión (FOV) mediante una novedosa plataforma multimodal proyección de imagen. Vamos a introducir la configuración del sistema, el método de alineación y protocolos operacionales. Se demostrará en vivo la proyección de imagen, y se proporcionará resultados representativos.

Resumen

Mientras que la proyección de imagen de la fluorescencia es ampliamente utilizada en Oftalmología, una imagen retiniana de la fluorescencia (3D) tridimensional de gran campo de visión (FOV) sigue siendo un gran reto con la retina de vanguardia imagen modalidades porque requerirían z de apilamiento para compilar un conjunto de datos volumétrico. Nueva tomografía de coherencia óptica (OCT) y sistemas de angiografía (OCTA) OCT superan estas restricciones para proporcionar imágenes tridimensionales (3D) de anatómico y vasculares, pero la naturaleza libre de tinte de OCT no puede visualizar salida indicativa de vascular disfunción. Este protocolo describe un oblicuo novedoso láser oftalmoscopia (oSLO) técnica que ofrece la proyección de imagen retiniana fluorescencia volumétrica 3D de escaneo. La configuración del sistema de proyección de imagen genera el oblicuo de un deslizador de cola de Paloma y alinea el sistema de imagen final en un ángulo de detección fluorescentes imágenes seccionadas transversalmente. El sistema utiliza el láser método de análisis y por lo tanto, permite una fácil incorporación de OCT como una modalidad de proyección de imagen estructural volumétrica complementaria. En vivo la proyección de imagen en la retina de la rata se demuestra aquí. Solución de fluoresceína se inyecta por vía intravenosa para producir la angiografía de la fluoresceína volumétrica (vFA).

Introducción

Oftalmología y visión de la ciencia se beneficiaría enormemente de las modernas técnicas de imagen ópticas, puesto que la retina se puede acceder fácilmente con la luz. La proyección de imagen retiniana de la fluorescencia es una herramienta esencial en el diagnóstico y manejo de coriorretinal enfermedades vasculares como la retinopatía diabética (RD) y degeneración macular senil (DMS), los cuales son principales a causas de ceguera en los Estados Unidos.

Sin embargo, es todavía difícil para adquirir un gran campo de visión (FOV), retiniana de (3D) tridimensional de imágenes mediante el uso de imágenes por fluorescencia. Fotografía del fondo no tiene la capacidad de resolución de profundidad y no rechace la luz difusa. Como resultado, la mezcla de señales de diversa profundidad reduce la calidad de imagen. Exploración oftalmoscopia de láser (SLO) y confocal puede SLO (cSLO) reducir el efecto de luz difusa mediante el uso de bloquea confocal¹. Sin embargo, es difícil para SLO o cSLO para adquirir una imagen 3D de retina humana debido al límite de su profundidad de foco. Óptica adaptativa SLO (AOSLO) puede proporcionar excelente resolución y contraste mediante la corrección de las aberraciones de frente de onda que el ojo humano. Sin embargo, AOSLO todavía tendría z de apilamiento para la proyección de imagen volumétrica². Tomografía de coherencia óptica³ y sistemas de angiografía (OCTA) OCT superan estas restricciones para proporcionar tres dimensiones (3D) las imágenes anatómica y vascular^4,5,6, pero la naturaleza libre de tinte de OCT no puede visualizar fugas indicativos de disfunción vascular.

Este protocolo describe una novela plataforma multimodal para retina de fluorescencia volumétrica 3D de imágenes, es decir oblicuas exploración oftalmoscopia de láser (oSLO). En este sistema de proyección de imagen, un análisis oblicuo se generaron por un deslizador de cola de Paloma, y un sistema de imagen final esté alineado en un ángulo para detectar fluorescencia Cruz imágenes seccionales. El sistema utiliza métodos de escaneo láser, y estas técnicas permiten la fácil incorporación con OCT como una modalidad de proyección de imagen estructural volumétrica complementaria. La resolución de profundidad actual es de 25 μm en la retina de la rata y el campo de visión es de 30°. Esencialmente, el oSLO permite una versión fluorescente de OCT y se puede combinar simultáneamente con OCT y OCTA sobre un gran campo de visión.

En este protocolo, describimos la configuración de la oSLO, el método de alineación y construcción, el método de las imágenes en vivo de retina de rata y los resultados representativos.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y uso Comité (ACUC) del centro médico de Boston.

1. configuración del sistema

1. Sistema de oSLO
   1. Utilizar una fuente láser de supercontinuum como la fuente de láser de sistema.
      1. Separar la gama ligera visible (450-650 nm) de mayor rango de longitud de onda (nm 650-2000) por un espejo dicroico (DM1). Ampliar el espectro con un par de prismas de dispersión después de la viga pasa a través de un divisor de haz de polarización (PBS).
      2. Lugar una rendija para seleccionar la gama de longitud de onda de excitación (475-495 nm). Use un espejo reflexivo para reflejar el rayo filtrado al par del prisma y luego acoplar la luz en una fibra monomodo (SMF 1).
      3. Utilice un espectrómetro para confirmar la selección de la longitud de onda en la salida de la fibra del solo modo.
   2. Conectar la fibra del solo modo con dos acopladores de fibra óptica en cascada como se muestra en la figura 2. Uno de los puertos de salida de fibra desde el segundo acoplador de fibra ofrece la luz para el sistema de oSLO.
   3. Colimar el láser primero en el sistema de oSLO.
      1. Desviar el láser por el espejo de un galvanómetro (GM1). Relé el láser a un segundo espejo del galvanómetro (GM2) por un sistema de telescopio de 1:1 y otras relé a la pupila del ojo mediante un sistema de telescopio de 3:1.
      2. Instale un espejo dicroico (DM2) en el sistema del telescopio de 3:1 para reflejar las señales de fluorescencia.
   4. Montar el sistema del telescopio de 3:1 y el espejo dicroico (DM2) en un deslizador de cola de Paloma modificado para requisitos particulares para compensar el eje óptico y crear el oblicuo análisis de iluminación como se muestra en la figura 3. Use un calibrador para controlar con precisión la longitud de desplazamiento como se desee.
   5. Camino óptico de fluorescencia.
      1. Reflejar la fluorescencia por el espejo dicroico y relé para el tercer espejo del galvanómetro a la exploración la exploración lenta.
      2. Relé de la luz a una imagen objetivo por otro sistema de telescopio de 1:1. Instalar la óptica arriba en una etapa de la traducción.
         Nota: Dos etapas de traducción adicionales se instalan en el tercer espejo del galvanómetro (GM3) para proporcionar redundancia en los grados de libertad para optimizar la proyección de imagen.
   6. Montar un sistema de proyección de imagen final en un escenario que tiene tres grados de libertad (rotación y dos ejes de la traducción). Utilice una cámara planar para capturar las imágenes de fluorescencia transversal.
2. Sistema de tomografía de coherencia óptica
   1. Utilizar la misma fuente de laser de supercontinuum como la fuente de láser de sistema.
      1. Separar la gama cerca de (NIR) infrarroja (650-900 nanómetro) la luz restante (650-2000 nm) por otro espejo dicroico (DM3). Utilice un filtro de pase largo para limitar aún más el ancho de banda de 800-900 nm. Pareja la viga en una fibra monomodo (SMF 2).
   2. Conecte la fibra del solo modo al puerto de entrada de los dos acopladores de fibra óptica en cascada para combinar con la excitación de oSLO azul. Dirigir la luz desde el segundo puerto de salida del segunda fibra acoplador para el brazo de referencia OCT, que tiene un filtro de densidad neutra variable (VNDF), las placas de compensación de dispersión y un espejo reflectante.
      Nota: La luz devuelta desde el brazo de referencia y el ojo recombina en el segundo acoplador de fibra óptica y se entrega al espectrómetro de OCT para recoger la señal.
3. Adquisición de datos
   1. Utiliza un software de sistema de adquisición de datos escrito en LabVIEW y modificado a partir del Protocolo de exploración de OCTA^7,8,9,10. Para cada B-scan, un ciclo de deber del 80% que la sierra diente con 500 pasos salida por una placa de salida analógica (OA1) controlar la x' espejo de escaneado rápido, GM2.
   2. Activar la cámara de exploración por línea en cada paso para la adquisición de datos para los PTU solamente cuando el espejo está en adelante dirección de análisis. Establecer el tiempo de exposición de la cámara de exploración de línea que 17 μs.
   3. Para adquirir la señal de la OCTA, repita la medición 5 veces en el mismo lugar de B-scan.
   4. Establecer la tasa de salida AO a 100 kHz y la tasa-Vestido de noche de OCT a 50 kHz. Control de la y' lento análisis espejo, GM1, por una forma de onda de rampa. Sincronizar el espejo de la exploración, GM3, con GM1-escanear la exploración lenta.
   5. Activar la cámara planar por otro tablero de salida analógica (AO2) para capturar una imagen fluorescente en cada y' ubicación. Recortar el tamaño de imagen o bin los píxeles vecinos para aumentar la velocidad y la sensibilidad deseada.

2. el sistema alineación

1. Ajuste la abertura en la fuente de luz de oSLO para seleccionar la longitud de onda de excitación azul. Usar un espectrómetro para monitorear el espectro para ser alrededor de 475-490 nm.
2. Ajuste el regulador de montaje de cola de Paloma para desplazar el eje óptico por ~ 5 mm. Esto dará lugar a un desplazamiento en la pupila de rata ~1.7 mm, resultando en un ángulo oblicuo de ~ 15° en la retina.
3. La misma de 5 mm para ajustar la etapa de la traducción de la óptica de detección de fluorescencia.
4. Ajustar la fluorescencia final proyección de imagen para que sea ~ 30°.
5. Medir la potencia óptica usando un medidor de potencia. Asegúrese de que el poder de excitación azul de oSLO es ≤0. 2 mW y OCT láser potencia ≤0.8 mW, que no causa daños de la retina.
   Nota: Basado en el estándar ANSI, es la máxima exposición permisiva (MPE) a la retina a nivel de ~ 2mW^7,8 en la gama de luz visible. Según la fórmula por Delori et al. ⁹, el error máximo permitido para la luz infrarroja cercana es aproximadamente dos veces mayor que la luz visible, en cerca de 4 mW.

3. en Vivo experiencia con animales

1. Transferencia de una rata de Evans largo macho de 12 semanas en la cámara de inducción. Anestesiar la rata con 4.5% de isoflurano en oxígeno durante 10 minutos con un caudal de 2 L/min por un vaporizador de isoflurano.
   1. Confirmar la profundidad de la anestesia según lo determinado por la falta del reflejo de retirada durante una pizca interdigital.
2. Después de la inducción, colocar la rata en un soporte de 5 ejes (x, y, traducciones de z, yaw y pitch). Proporcionar calor suplementario por el uso de una platina calefactada, manta de agua caliente u otro método adecuado en una experiencia prolongada de circulación. Mantener la anestesia en el 1,5% de isofluorane con un caudal de 2 litros/minutos durante la parte restante del experimento. Al no utilizar una cámara de inducción con escape activo, la cámara de inducción debe colocarse en una mesa de backdraft o campana extractora de encimera o bajo un snorkel para compactar isoflurano.
3. Dilatar a la pupila con tropicamida solución oftálmica al 1% durante 2 minutos. Aplique solución oftálmica al 0.5% ácido clorhídrico del Tetracaine en el ojo de la rata para la anestesia local adicional, si es necesario. Mantener el ojo hidratado con lágrimas artificiales comerciales al menos una vez cada minuto durante el experimento.
4. Inyectar fluoresceína sal (10% w/w) o FITC (10% w/w) diluido en solución salina estéril (0.1-0.3 mL) a través de la vena de la cola con un 1 mL aguja de jeringa y 29G.
5. Encienda la fuente de láser. Coloque un filtro de densidad neutra para atenuar la excitación de luz azul durante la alineación. Medir la potencia de la luz OCT ~0.8 mW y la luz azul < 0,01 mW para evitar la formación de cataratas.
6. Iniciar el modo de exploración y la alineación del galvanómetro. Ajuste la altura de la bola del ojo para hacer un láser estacionario mancha en la córnea. Ajustar la posición del ojo de rata para hacer el borde de la pupila más o menos perpendicular al láser y offset el láser al centro del ojo de ~1.5 mm apical.
7. Más ajustar el soporte del animal hasta imágenes de OCT una calidad óptima. En el x' exploración rápida de dirección, asegúrese de que la imagen B-scan transversal aparezca plana. Cuando se cambia la y ' lenta exploración dirección, asegúrese de que la imagen B-scan de sección aparece inclinada, debido a la exploración oblicua.
8. Retire el filtro de densidad neutra para la excitación de luz azul y monitorear el alimentación de la cámara en tiempo real. Imagen fluorescente seccional cruzada debe aparecer mostrando vasos que aparecen en diferentes profundidades.
   1. Ajuste el enfoque de la fluorescencia final sistema para alcanzar el objetivo óptimo de imagen. Permite un ajuste fino de la posición del ojo en el plano lateral para alcanzar una óptima calidad de imagen de oSLO.
9. Después de la alineación, empieza a adquirir OCTA simultánea y angiografía de la fluoresceína volumétrica (vFA).
10. Construir las imágenes volumétricas de OCTA y oSLO por Matlab. Los algoritmos son descritos en detalle¹⁰. Generar vasculatures retinianas profundidad resuelta por segmentación de la imagen.
11. Después de terminar la proyección de imagen, apagar el láser, liberar el animal y aplicar alguna pomada oftálmica en los ojos y luego coloque el animal en una caja de recuperación.
12. No descuide el animal hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal o según política institucional.

Resultados

Figura 4a muestra una imagen transversal del OCT de una retina de rata. Figura 4b c -4 muestran las mismas imágenes de retinales transversales de AGV OCTA y oSLO adquirió al mismo tiempo. El oSLO permite FA sección análoga al OCT B-scan. En comparación con el OCTA, la imagen transversal del AGV de oSLO identifica claramente los vasos de la capa de fibras nerviosas (NFL) y la capa de células ganglionares (GC...

Discusión

Aquí, hemos descrito oSLO, un en vivo volumétrica fluorescente retinal imaging técnica con un campo de visión 30 ° excesivo. En comparación con octubre, un estándar actual de cuidado imagen método en Oftalmología, oSLO ofrece una proyección de imagen capacidad 3D similar pero permite contraste de fluorescencia que OCT no es sensible a. La ventaja de oSLO es que requiere sólo una exploración de raster y permite así la combinación perfecta de PTU, proporcionando dos técnicas complementarias para la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supercontinuum Laser Source	NKT Photonics	SuperK EXTREME EXU-OCT6
Dichroic Mirror (DM1)	Thorlabs	DMLP650R
Dichroic Mirror (DM2)	Chroma	ZT514/1064rpc
Dichroic Mirror (DM3)	Thorlabs	DMLP900R
Single Mode Fiber (SMF 1)	Thorlabs	P3-460B-FC-2
Single Mode Fiber (SMF 2)	Thorlabs	P3-780A-FC-2
Optic Fiber Coupler	Thorlabs	TW850R5A2
1:1 Telescope System	Thorlabs	AC254-100-A×2
3:1 Telescope System	Thorlabs	AC254-150-A×2
3:1 Telescope System	Thorlabs	AC254-50-A×2
Galvo Mirrors (GM1,GM2)	Thorlabs	GVS201×2
De-sacn Galvo Mirrors (GM3)	Thorlabs	GVS011
Objective Lens	Olympus	UplanSApo 20×/0.75
Final imaging system	Olympus	UplanFL N 10×/0.3
Final imaging system	Computar	12-36mm/1:2.8
Camera	PCO	Pco.pixelfly usb
Filter	Thorlabs	FEL0800
Mounted Continuously Variable ND Filter	Thorlabs	NDC-50C-4M-A
Line Scan Camera	Thorlabs	SPL2048-140K
Analog Output Board (AO1)	National Instrument	PCI-6731
Analog Output Board (AO2)	National Instrument	PCIe-6351
Long pass filter	Thorlabs	FEL0800