Eğik tarama Lazer Ophthalmoscopy (oSLO) ve optik koherens tomografi (OCT) tarafından Multimodal hacimsel Retina Görüntüleme

Özet

Burada, bir roman görüntüleme multimodal platformu kullanarak bir geniş görüş alanı (FOV) üç boyutlu (3D) floresan ve OCT Retina görüntü almak için bir iletişim kuralı mevcut. Sistem Kurulumu, hizalama yöntemi ve operasyonel iletişim kurallarını tanıtacak. Vivo görüntüleme gösterilecektir ve temsilcisi sonuçları sağlanacaktır.

Özet

Floresans görüntüleme Oftalmoloji içinde yaygın olarak kullanıldığı gibi bir geniş görüş alanı (FOV) üç boyutlu (3D) Floresan Retina görüntü hala state-of--art Retina z-istifleme için gerektirecektir çünkü görüntüleme yöntemleri ile büyük bir meydan okuma olduğunu Hacimsel veri kümesi derleyin. Daha yeni optik koherens tomografi (OCT) ve OCT anjiyografi (OCTA) sistemleri üç boyutlu (3D) anatomik ve vasküler görüntüleri sağlamak için bu sınırlamalar üstesinden gelmek, ama boya ücretsiz doğa, Ekim sızıntı, vasküler gösterge görselleştirmek olamaz disfonksiyon. Bu iletişim kuralı bir roman oblik 3D hacimsel floresans Retina görüntüleme sağlar lazer ophthalmoscopy (oSLO) tekniği tarama açıklar. Görüntüleme sistemi kurulumu bir güvercin kuyruğu kaymak tarafından tarama eğik oluşturur ve son görüntüleme sistemi floresan kesitsel görüntüleri algılamaya açılı hizalar. Sistem lazer tarama yöntemi kullanır ve bu nedenle, bir kolay birleşme, Ekim bir tamamlayıcı hacimsel yapısal görüntüleme yöntemi verir. Vivo görüntüleme sıçan retina üzerinde burada gösterilmiştir. Fluoresein Çözüm intravenöz hacimsel floresein anjiyografi (UYA) üretmek için enjekte edilir.

Giriş

Oftalmoloji ve vizyon bilim büyük yarar modern optik görüntüleme teknikleri beri retina ışık ile kolayca erişilebilir. Floresans Retina Görüntüleme tanı ve yönetim chorioretinal vasküler hastalıklar ikisi de Amerika Birleşik Devletleri'nde körlük nedenleri lider olan diabetik retinopati (DR) ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), gibi önemli bir araçtır.

Ancak, bir büyük görüş alanı (FOV), üç boyutlu (3D) Retina floresans görüntüleme kullanarak görüntüleme elde etmek için hala meydan okuyor. Fundus fotoğraf derinlik çözme yeteneğine sahip değildir ve diffüz ışık reddetmek değil. Sonuç olarak, farklı derinlik gelen sinyalleri karıştırma görüntü kalitesini düşürür. Tarama Lazer ophthalmoscopy (SLO) ve confocal gating¹kullanarak dağınık ışık etkisini azaltmak confocal SLO (cSLO) olabilir. Ancak, SLO veya cSLO onların odak derinliği sınırı nedeniyle 3D insan Retina görüntü elde etmek için zordur. Uyarlamalı optik SLO (AOSLO) insan gözü tarafından tanıtılan wavefront anomalileri için düzelterek mükemmel çözünürlük ve kontrast sağlayabilir. Ancak, AOSLO hala z istifleme için üçboyutlu görüntüleme²gerekir. Optik koherens tomografi (OCT)³ ve OCT anjiyografi (OCTA) sistemleri üç boyutlu (3D) anatomik ve vasküler görüntüleri^4,5,6, ama boya ücretsiz doğa sağlamak için bu sınırlamalar üstesinden gelmek OCT kaçak vasküler işlev bozukluğu göstergesi görselleştirmek olamaz.

Bu iletişim kuralı bir roman multimodal platform için Imaging, yani oblique lazer ophthalmoscopy (oSLO) tarama 3D hacimsel floresans Retina açıklar. Bu görüntüleme sistemi bir eğik tarama bir güvercin kuyruğu kaymak tarafından oluşturulur ve bir son görüntüleme sistemi floresans cross sectional görüntüleri algılamaya bir açıda hizalanır. Sistem lazer yöntemleri tarama kullanır ve bu tekniklerin OCT ile kolay birleşme bir tamamlayıcı hacimsel yapısal görüntüleme yöntemi sağlar. Geçerli derinlik çözünürlüğü sıçan retina yaklaşık 25 µm ve görüş alanı 30 °. Esasen, oSLO, Ekim floresan bir yorum bırakmak ve aynı anda OCT ile kombine edilebilir ve üzerinde büyük bir FOV OCTA.

Bu protokol için oSLO, hizalama ve inşaat yöntemi, sıçan retinanın vivo içinde görüntüleme yöntemi ve temsilcisi sonuçları kurulumunu anlatacağız.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada hayvan bakım ve kullanım Komitesi (ACUC) Boston Tıp Merkezi tarafından onaylanmıştır.

1. sistem kurulumu

1. oSLO sistemi
   1. Bir supercontinuum Lazer kaynağı sistem lazer kaynağı olarak kullanın.
      1. Görünür ışık aralığı (450-650 nm) yüksek dalga boyu aralığı (650-2000 nm) tarafından bir Dikroik ayna (DM1) ayırın. Sonra bir kutuplaşma ışın ayırıcı (PBS) geçen ışın spektrum dağıtıcı prizmalar çifti ile genişletin.
      2. Uyarma dalga boyu aralığı (475-495 nm) seçmek için bir yarık yerleştirin. Filtre uygulanmış ışını prizma eşleştirmek için geri yansıtacak ve tekli mod fiber (SMF 1) ışık çift için bir yansıtıcı ayna kullanın.
      3. Bir Spektrometre çıkış dalga boyu seçimi tekli mod fiber onaylamak için kullanın.
   2. Şekil 2' de gösterildiği gibi iki basamaklı fiber optik bağdaştırıcılar için tekli mod fiber bağlayın. İkinci lif coupler fiber çıkış noktasından birini oSLO sisteme ışık sunar.
   3. Lazer ilk oSLO sisteminde collimate.
      1. Lazer bir galvanometre ayna (GM1) tarafından saptırmak. Geçiş için bir 1:1 teleskop sistemi tarafından ikinci bir galvanometre ayna (GM2) lazer ve daha fazla geçiş göz 3:1 teleskop sistemi tarafından öğrenci için.
      2. Dikroik ayna (DM2) Floresan sinyallerini yansıtacak şekilde 3:1 teleskop sistemi içinde yükleyin.
   4. 3:1 teleskop sistemi ve Dikroik ayna (DM2) optik eksen ofset ve Şekil 3' te gösterilen aydınlatma tarama eğik oluşturmak için özelleştirilmiş güvercin kuyruğu kaymak bağlama. Tam olarak istediğiniz gibi mahsup uzunluğu kontrol için bir kumpas kullanın.
   5. Floresan görüntü optik yol.
      1. Floresans Dikroik ayna ve yavaş tarama de-inceden inceye gözden geçirmek için üçüncü galvanometre ayna geçişi yansıtır.
      2. Işık bir görüntüleme objektif lens için başka bir 1:1 teleskop sistemi tarafından geçiş. Yukarıdaki optik bir çeviri sahnede yükleyin.
         Not: İki ek Çeviri aşamaları üçüncü galvanometre ayna (GM3 görüntüleme en iyi duruma getirme için serbestlik derecesi içinde artıklık sağlamak için) altında yüklenir.
   6. Özgürlük üç derece (rotasyon ve çevirinin iki eksen) olan bir sahne alanı'nda son bir görüntüleme sistemi monte. Düzlemsel bir kamera kesitsel floresans görüntüleri yakalamak için kullanın.
2. Optik koherens tomografi sistemi
   1. Aynı supercontinuum Lazer kaynak sistem lazer kaynağı olarak kullanın.
      1. Yakın kızılötesi (Nur) aralığı (650-900 nm) kalan ışıktan (650-2000 nm) tarafından başka bir Dikroik ayna (DM3) ayırın. Daha fazla bant genişliği 800-900 nm için sınırlamak için uzun geçiş filtresi kullanın. Işın tekli mod fiber (SMF 2) birkaç.
   2. Tekli mod fiber mavi oSLO uyarma ile birleştirmek için iki basamaklı fiber optik bağdaştırıcılar ve diğer giriş portuna bağlayın. Bir değişken nötr yoğunluk filtresi (VNDF), dağılım tazminat plakaları ve bir yansıtıcı ayna vardır OCT başvuru kol ikinci lif coupler ikinci çıkış noktasından ışığına doğrudan.
      Not: Işık başvuru kol döndü ve göz ikinci fiber optik girişli recombines ve sinyal toplamak için OCT Spektrometre teslim edilir.
3. Veri toplama
   1. LabVIEW içinde yazılı ve Octa'yı^7,8,9,10tarama iletişim kuralından değiştiren bir veri edinme sistem yazılımı kullanın. Her B-inceden inceye gözden geçirmek için bir % 80 iş hacmi 500 adımları ile diş çıktı bir analog çıkış kartı (AO1) x denetlemek için gördüm ' hızlı tarama ayna, GM2.
   2. Satır tarama kamera OKT için veri elde etmek için her adımda tetiklemek sadece ileri yönde tarama aynasıdır. 17 µs olmak satır tarama kameranın çekim hızı ayarlayın.
   3. OCTA sinyali almak için 5 kez aynı yerde B-tarama ölçüm yineleyin.
   4. AO çıkış hızı 100 kHz ve OCT A-line hızı 50 kHz koymak. Y kontrol ' yavaş tarama ayna, GM1, bayiliği bir dalga tarafından. De-tarama aynaya GM3, yavaş tarama de-scan GM1 ile eşitleyin.
   5. Düzlemsel kamera başka bir analog çıkış kartı (AO2 her y bir floresan görüntü yakalamak için) tetiklemek ' konum. Kırpma görüntü boyutu veya duyarlılık istediğiniz gibi ve hızını artırmak için komşu piksellerin bin.

2. sistem hizalama

1. Slit mavi uyarma dalga boyu seçmek için oSLO ışık kaynağı olarak ayarlayın. Bir spektrometre için spektral Aralık izlemek için kullanın 475-490 nm.
2. Tarafından ~ 5 mm optik eksen kaydırmaya güvercin Kuyruk Dağı kaydırıcısını ayarlayın. Bu sıçan öğrenci bir sapmasında ~1.7 mm, bir eğik açısı ~ 15 ° retina üzerinde sonuçlanan tarafından sonuçlanır.
3. Floresans algılama optik çeviri aşamasında aynı 5 mm tarafından ayarlayın.
4. Görüntüleme sistemi ~ 30 ° olmak son floresans ayarlayın.
5. Bir güç ölçeri kullanmayı optik güç ölçmek. ≤0.2 mW ve retina hasar neden olmaz OCT lazer gücü ≤0.8 mW mavi oSLO uyarma güç olduğundan emin olun.
   Not: ANSI standardını temel alan, retina için maksimum keyfi etkiyi (MPE) düzeyinde olduğunu ~ 2mW^7,8 ' görünür ışık aralığı. Göre formülle Delori vd. ⁹, MPE yakın kızılötesi ışık için görünür ışık, yaklaşık iki kat daha yüksek yaklaşık 4 mW.

3. in Vivo hayvan deneyi

1. 12-hafta erkek uzun Evans ispiyoncu indüksiyon odanın içine aktarın. % 4.5 isoflurane oksijen fareyle 2 L/dak bir debi ile 10 dakika için bir isoflurane Buharlaştırıcı tarafından anestezi.
   1. Para çekme refleks eksikliği tarafından ayak parmak bir tutam sırasında belirlenen anestezi derinliği onaylayın.
2. İndüksiyon sonra fareyi yer 5-eksen (x, y, z çevirileri, yaw ve saha) tutucu üzerinde. Ek ısı tarafından sıcak su battaniye ya da diğer uygun yöntemi uzun süreli bir deneyde dolaşan bir ısıtmalı sahne kullanımı sağlar. Anestezi isofluorane %1,5 2 litre/dakika bir debi ile deneme kalan kısmı boyunca korumak. Bir indüksiyon odası ile etkin egzoz kullanmadığınızda, indüksiyon odası Alev kapanı veya Aşağıdan çekimli bir tabloya ya da isoflurane çöpçülük edecek bir şnorkel altına yerleştirilmelidir.
3. Öğrenci %1 Tropicamide oftalmik çözüm ile 2 dakika boyunca genişletmek. Gerekirse ek lokal anestezi, sıçan göz % 0.5 Tetracaine HCl oftalmik çözüm uygulayın. En az bir kez her dakika deney sırasında ticari Suni gözyaşları ile nemli göz kulak.
4. Fluoresein tuz (% 10 w/w) veya FITC enjekte (% 10 w/w) seyreltilmiş steril serum fizyolojik (0,1-0,3 mL) ile kuyruk ven ile 1 mL şırınga ve 29G iğne.
5. Lazer kaynak açın. Mavi ışık uyarma sırasında hizalama azaltmak için yer, nötr yoğunluk filtresi. ~0.8 mW olmak OCT ışık ve mavi ışık gücünü ölçmek < 0.01 mW katarakt oluşumunu önlemek için.
6. Başlangıç galvanometre ve hizalama tarama modu. Kornea üzerinde sabit bir lazer nokta yapmak göz topu yüksekliğini ayarlayın. Öğrencinin RIM için lazer kabaca dikey yapmak için fare göz pozisyonunu ayarlayýn ve gözle ~1.5 mm hakkında apikal ortasına lazer ofset.
7. OCT görüntüleri en iyi kalitede ulaşana kadar daha fazla hayvan sahibi ayarlayın. X ' hızlı yön tarama, kesit B-tarama görüntü düz görüntülendiğinden emin olun. Y için geçiş yaparken ' yavaş tarama yön, kesit B-tarama görüntü, eğik tarama nedeniyle hareket ettirildiğinde göründüğünden emin olun.
8. Mavi ışık uyarma için nötr yoğunluk filtresi kaldırmak ve kameradan yem gerçek zamanlı izleyebilirsiniz. Çapraz kesit floresan görüntü gösteren damarlar farklı derinliklerinde görünen görüntülenmesi gerekir.
   1. Görüntüleme sistemi en uygun odak ulaşmak için son floresans odağı ayarlayın. En iyi oSLO görüntü kalitesi ulaşmak için yanal düzlemde göz konumunun ince ayar sağlar.
9. Eşzamanlı OCTA ve hacimsel floresein anjiyografi (UYA) elde etmek hizalama sonra başlayın.
10. Octa'yı ve oSLO Matlab tarafından hacimsel görüntüler oluşturmak. Algoritmalar daha önce ayrıntılı¹⁰dakika sonra açıklanmıştır. Retina vasculatures derinlik çözüldü görüntü segmentasyonu tarafından oluşturmak.
11. Görüntüleme işlemini tamamladıktan sonra lazer çevirmek, hayvan bırakın ve gözünü bazı oftalmik merhem uygulamak ve sonra hayvan kurtarma kutuya koyun.
12. Hayvan başıboş sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar veya kurumsal İlkesi gibi başına bırakmayın.

Sonuçlar

Şekil 4a bir sıçan retina bir kesitsel OCT görüntüsünü gösterir. Şekil 4b -4 c Octa'yı ve oSLO uya aynı anda satın aynı Retina kesitsel görüntülerini göster. OSLO kesitsel SK Ekim B taramaya benzer sağlar. OCTA ile karşılaştırıldığında, oSLO uya kesitsel görüntü açıkça sinir lifi tabakası (NFL) ve ganglion hücre katmanı (un) damarları ve kılcal Dış pleksiform tabaka (OPL) o...

Tartışmalar

Burada, oSLO, tekniği ile 30 ° FOV bir vivo içinde hacimsel floresan Retina Görüntüleme anlatmıştık. Ekim geçerli standart tedavi yöntemi Oftalmoloji, Imaging göre oSLO benzer bir 3D görüntüleme yeteneği sunar henüz OCT duyarlı değil floresans kontrast sağlar. OSLO bu tek bir raster tarama gerektirir ve böylece, Ekim, yapısal ve floresan hacimsel görüntüleme için iki tamamlayıcı teknik sağlayan sorunsuz kombinasyonu sağlar avantajdır.

Bu protokol için i...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supercontinuum Laser Source	NKT Photonics	SuperK EXTREME EXU-OCT6
Dichroic Mirror (DM1)	Thorlabs	DMLP650R
Dichroic Mirror (DM2)	Chroma	ZT514/1064rpc
Dichroic Mirror (DM3)	Thorlabs	DMLP900R
Single Mode Fiber (SMF 1)	Thorlabs	P3-460B-FC-2
Single Mode Fiber (SMF 2)	Thorlabs	P3-780A-FC-2
Optic Fiber Coupler	Thorlabs	TW850R5A2
1:1 Telescope System	Thorlabs	AC254-100-A×2
3:1 Telescope System	Thorlabs	AC254-150-A×2
3:1 Telescope System	Thorlabs	AC254-50-A×2
Galvo Mirrors (GM1,GM2)	Thorlabs	GVS201×2
De-sacn Galvo Mirrors (GM3)	Thorlabs	GVS011
Objective Lens	Olympus	UplanSApo 20×/0.75
Final imaging system	Olympus	UplanFL N 10×/0.3
Final imaging system	Computar	12-36mm/1:2.8
Camera	PCO	Pco.pixelfly usb
Filter	Thorlabs	FEL0800
Mounted Continuously Variable ND Filter	Thorlabs	NDC-50C-4M-A
Line Scan Camera	Thorlabs	SPL2048-140K
Analog Output Board (AO1)	National Instrument	PCI-6731
Analog Output Board (AO2)	National Instrument	PCIe-6351
Long pass filter	Thorlabs	FEL0800