Смешанных объемные сетчатки, Imaging наклонный офтальмоскопия лазерного сканирования (Осло) и оптическая когерентная томография (Окт)

Резюме

Здесь мы представляем протокол получить большое поле зрения (FOV) трехмерной (3D) флуоресценции и OCT сетчатки изображения с помощью Роман изображений Мультимодальная платформа. Мы будем вводить настройки системы, метод выравнивания и оперативные протоколы. В естественных условиях изображений будет продемонстрирована, и представитель результаты будут предоставлены.

Аннотация

Хотя флуоресценции изображений широко используется в офтальмологии, большое поле зрения (FOV) трехмерной (3D) флуоресценции сетчатки изображение по-прежнему является большой проблемой с сетчатки искусства, визуализации формы потому, что они будут требовать, z укладка для Скомпилируйте объемный набор данных. Новая оптическая когерентная томография (Окт) и систем ангиография (OCTA) октября преодолеть эти ограничения представить трехмерные (3D) анатомические и сосудистой изображения, но краска бесплатный характер OCT не может визуализировать утечки свидетельствует о сосудистых дисфункция. Этот протокол описывает Роман косой, сканирование лазерная техника офтальмоскопия (Осло), которая обеспечивает 3D объемного флуоресценции сетчатки изображений. Настройка системы визуализации генерирует косой, сканирование слайдер хвост голубь и выравнивает окончательной визуализации системы под углом для обнаружения флуоресцентные поперечные изображения. Система использует лазерный метод сканирования и таким образом, позволяет легко включение октября как взаимодополняющие объемные структурных изображений модальности. В естественных условиях изображения на сетчатке крыс показано здесь. Флуоресцеин раствора внутривенно вводят производить объемные fluorescein ангиография (vFA).

Введение

Офтальмология и видение науки значительно выиграть от современные оптические методы визуализации, так как могут быть легко доступны сетчатки с светом. Флуоресценции сетчатки изображений является важным инструментом в области диагностики и управления хориоретинальной сосудистых заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия (DR) и возрастной макулярной дегенерации (AMD), оба из которых являются ведущие причины слепоты в Соединенных Штатах.

Однако это все еще сложно приобрести большое поле зрения (FOV), трехмерные (3D) сетчатки изображений с помощью флуоресценции изображений. Фундус фотография не имеют возможности урегулирования глубины и не отвергают диффузный свет. В результате микширование сигналов от разных глубины снижает качество изображения. Сканирующий лазер офтальмоскопия (SLO) и конфокальный SLO (cSLO) может уменьшить эффект рассеянного света с помощью конфокальной шлюзовой¹. Однако это трудно для SLO или cSLO, чтобы получить 3D изображения человека сетчатки вследствие ограничения их глубины фокуса. Адаптивная оптика SLO (AOSLO) может обеспечить превосходное разрешение и контрастность путем исправления аберраций волнового фронта, представленный человеческий глаз. Однако AOSLO по-прежнему потребуется z укладка для объемного изображения². Оптическая когерентная томография (Окт)³ октября ангиография (OCTA) систем и преодолеть эти ограничения представить трехмерные (3D) изображения анатомических и сосудистой^4,5,6, но краска бесплатный характер октября не может визуализировать утечки ориентировочные сосудистые дисфункции.

Этот протокол описывает Роман Мультимодальная платформа для 3D объемного флуоресценции сетчатки воображения, а именно наклонный сканирование лазерная офтальмоскопия (Осло). В этой системе визуализации наклонный сканирование генерируется ползунок хвост голубь, и окончательной визуализации системы выравнивается в угол обнаружения флуоресценции кросс-секционные изображений. Эта система использует лазерные методы проверки, и эти методы позволяют легко включения с октября как взаимодополняющие объемные структурных изображений модальности. Текущее разрешение глубина около 25 мкм в сетчатке крыса и поле зрения составляет 30°. По существу, Осло позволяет флуоресцентные версии OCT и одновременно может сочетаться с октября и оста над большой ПЗ.

В этом протоколе мы будем описывать установку Осло, метод выравнивания и строительства, метод в vivo томография сетчатки крыс и представитель результаты.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены животное уход и использование Комитета (ACUC) из Бостонского медицинского центра.

1. системы установки

1. Система Осло
   1. Используйте в качестве системы лазерного источника суперконтинуум лазерного источника.
      1. Отделите видимого света диапазона (450-650 Нм) от выше диапазона длин волн (650-2000 Нм), дихроичное зеркало (DM1). Расширьте спектр с парой Дисперсионные призмы после луч, проходя через splitter луча поляризации (PBS).
      2. Место щели, чтобы выбрать диапазон волны возбуждения (475-495 нм). Используйте Светоотражающий зеркало, чтобы отразить отфильтрованных луч обратно в призму пар и затем пара свет в одномодового волокна (SMF 1).
      3. Используйте спектрометр для подтверждения выбора длины волны на выходе одномодового волокна.
   2. Одномодового волокна соединить две муфты каскадом волоконно-оптических, как показано на рисунке 2. Один из порта вывода волокна от второго волокна стяжка обеспечивает свет к системе Осло.
   3. Collimate лазер сначала в системе Осло.
      1. Отвлечь лазер, зеркальный гальванометр (GM1). Реле лазер второй зеркальный гальванометр (GM2) 1:1 телескоп системы и далее реле для зрачка глаза системой телескоп 3:1.
      2. Установите дихроичное зеркало (DM2) в системе 3:1 телескоп для отражения сигналов флуоресценции.
   4. Смонтируйте систему телескоп 3:1 и дихроичное зеркало (DM2) на индивидуальные голубь хвост ползунок компенсировать оптической оси и создать косой, сканирование освещенности, как показано на рисунке 3. Используйте суппорт для точного управления смещения длины по желанию.
   5. Флуоресценции изображений оптического пути.
      1. Отражать флуоресценции дихроичное зеркало и реле третьего зеркальный гальванометр для исключения из проверки медленное сканирование.
      2. Реле света изображения объектива другой системой телескоп 1:1. Установка выше оптика на этапе перевода.
         Примечание: Этапы два дополнительных перевода устанавливаются под третьего зеркальный гальванометр (GM3) для обеспечения избыточности в степеней свободы для оптимизации изображения.
   6. Смонтировать систему окончательной визуализации на сцене, которая имеет три степени свободы (вращение и две оси перевода). Используйте плоские камеру для захвата изображений поперечного сечения флуоресценции.
2. Оптическая когерентная томография системы
   1. Используйте один и тот же источник лазера суперконтинуум как системы лазерного источника.
      1. Отделите ближнего инфракрасного диапазона (NIR) (650-900 нм) от остальных света (650-2000 Нм), другой дихроичное зеркало (дм3). Используйте фильтр длинный пас для дальнейшего ограничения пропускной способности до 800-900 нм. Пара пучка в одномодового волокна (SMF 2).
   2. Подключите одномодового волокна к другой входной порт две муфты каскадом волоконно-оптических сочетать с голубой Осло возбуждения. Прямой свет от второго вывода порта второй стяжку волокна на руке ссылка OCT, который имеет фильтр нейтральной плотности переменной (VNDF), дисперсия компенсации пластины и отражающих зеркал.
      Примечание: Свет вернулся из ссылки рука и глаз разбивку на втором муфты оптического волокна и доставляется в Сен-спектрометр для сбора сигнал.
3. Сбор данных
   1. Использование данных приобретение системы программного обеспечения написана в LabVIEW и изменения от сканирующий протокола окта-^7,-^8,-^9,-¹⁰. Для каждого B-скан, 80% ПВ увидел зуб с 500 шагов вывода аналогового вывода Советом (AO1) для управления x' быстрого сканирования зеркало, GM2.
   2. Триггер линии сканирования камеры на каждом шаге для получения данных для развертывания Office только тогда, когда зеркало находится в переднем направлении сканирования. Установите время экспозиции для линии сканирования камеры быть 17 МКС.
   3. Для получения сигнала OCTA, повторите измерение 5 раз в том же месте B-скан.
   4. Установите АО показатель на 100 кГц и уровень OCT-line на 50 кГц. Управление y' медленно сканирования зеркало, GM1, наращивает сигнала. Исключения из сканирования зеркало, GM3, синхронизируйте с GM1 для исключения из проверки медленное сканирование.
   5. Триггер Вселенский камеры Советом еще один аналоговый выход (AO2), чтобы захватить один флуоресцентного изображения на каждом y' местоположение. Кадрирование изображений размер или Бен сосед пикселей для увеличения скорости и чувствительности по желанию.

2. Система выравнивания

1. Отрегулируйте щели в Осло источник света для выбора длины волны голубые возбуждения. Используйте спектрометр для мониторинга спектральный диапазон около 475-490 Нм.
2. Ползунок горе хвост голубь, который Сдвиг оптической оси на ~ 5 мм. Это приведет к смещение на ученик крыса, ~1.7 мм, что приводит к косой угол ~ 15° на сетчатке.
3. Настройте перевод этапе флуоресценции обнаружения оптики, же 5 мм.
4. Отрегулируйте окончательный флюоресценция системы быть ~ 30°.
5. Измерения оптической мощности, с помощью измерителя мощности. Убедитесь, что синий мощность возбуждения Осло ≤0.2 МВт и OCT лазера мощностью ≤0.8 МВт, которая не вызовет повреждения сетчатки.
   Примечание: Основываясь на стандарте ANSI, максимальный разрешительных (ПДВ) для сетчатки соответствует на уровне ~ 2МВт^7,8 в видимом диапазоне света. Согласно формуле, Delori и др. ⁹, ПДВ для ближнего инфракрасного света примерно в два раза выше, чем видимый свет, в около 4 МВт.

3. в естественных условиях животных эксперимент

1. Передача 12-недель крыса мужчина долго Эванс в камеру всасывание. Анестезировать крыс с изофлюрановая 4,5% кислорода в течение 10 минут с скорости потока 2 Л/мин, изофлюрановая испарителем.
   1. Подтвердите глубины анестезии определяется отсутствием ухода рефлекс при межпальцевых пинча.
2. После индукции место крысы на держатель 5-оси (x, y, z переводы, рыскания и тангажа). Обеспечивают дополнительное тепло с помощью Подогреваемый столик, циркулирующих одеяло теплой воды или другой подходящий метод в длительный эксперимент. Поддержание анестезии на 1,5% isofluorane с скорость потока 2 л/мин в течение оставшейся части эксперимента. Когда не используете камеру всасывание активных выхлопа, индукции камеры должны быть помещены на таблицу Обратная тяга или нисходящего движения или под трубку, чтобы очистить изофлюрановая.
3. Разбавить ученик с 1% Тропикамид офтальмологический раствор на 2 минуты. Применить офтальмологический раствор HCl тетракаин 0,5% на крыс глаз для дополнительных местной анестезией, в случае необходимости. Держите глаза, увлажненной с коммерческой искусственные слезы по крайней мере один раз каждую минуту во время эксперимента.
4. Придать флуоресцеин соли (10% w/w) или FITC (10% w/w) разводят в стерильного физиологического раствора (0,1-0,3 мл) через Вену хвост с 1 мл раствора иглу шприца и 29G.
5. Включите источник лазера. Место фильтр нейтральной плотности для ослабления синий свет возбуждения во время выравнивания. Измерения силы света OCT быть ~0.8 МВт и синий свет < 0,01 МВт, чтобы избежать формирования катаракты.
6. Запустите режим проверки и выравнивание гальванометра. Отрегулируйте высоту глаз мяч, чтобы сделать стационарных лазерного пятна на роговице. Отрегулируйте положение глаз крыса сделать обод ученика примерно перпендикулярно лазер и компенсировать лазер в апикальной центр глаза о ~1.5 мм.
7. Далее настройте владельца животного до тех пор, пока Окт изображения достичь оптимального качества. В x' быстрое сканирование направление, убедитесь, что поперечного сечения B-скан изображения отображается плоской. При переключении на y' медленно сканирования направление, убедитесь, что сечение B-скан изображения появляется наклонена, благодаря наклонный сканирования.
8. Удалите фильтр нейтральной плотности для синего света возбуждения и контролировать в реальном времени, кормить из камеры. Крест секционные флуоресцентные изображение должно появиться показаны кровеносных сосудов, появляясь в разных глубинах.
   1. Отрегулируйте фокус заключительном флуоресцирования, визуализации системы для достижения оптимального фокуса. Дать точную регулировку положения глаз в боковой плоскости для достижения оптимального качества изображения Осло.
9. После выравнивания начинают приобретать окта одновременное и объемные fluorescein ангиография (vFA).
10. Постройте объемных изображений для OCTA и Осло на Matlab. В деталях¹⁰ранее описаны алгоритмы. Генерировать сетчатки vasculatures, глубина решена путем сегментации изображений.
11. После завершения обработки изображений, выключите лазер, освободить животных и применять некоторые глазная мазь на глазах и затем поместите животное в окне восстановления.
12. Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency или за институциональной политики.

Результаты

На рисунке 4a показывает поперечного сечения OCT изображение сетчатки крыс. Рисунок 4b -4 c показывают же сетчатки поперечные изображения окта- и Осло vFA, приобретенных в то же время. Осло позволяет поперечного сечения FA аналогии в OC...

Обсуждение

Здесь мы описали Осло, в естественных условиях объемного флуоресцентные сетчатки изображений технику с ПЗ свыше 30 °. По сравнению с октября, текущий стандарт медицинской помощи визуализации метод в офтальмологии, Осло предлагает аналогичные 3D визуализации возможность еще позвол?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supercontinuum Laser Source	NKT Photonics	SuperK EXTREME EXU-OCT6
Dichroic Mirror (DM1)	Thorlabs	DMLP650R
Dichroic Mirror (DM2)	Chroma	ZT514/1064rpc
Dichroic Mirror (DM3)	Thorlabs	DMLP900R
Single Mode Fiber (SMF 1)	Thorlabs	P3-460B-FC-2
Single Mode Fiber (SMF 2)	Thorlabs	P3-780A-FC-2
Optic Fiber Coupler	Thorlabs	TW850R5A2
1:1 Telescope System	Thorlabs	AC254-100-A×2
3:1 Telescope System	Thorlabs	AC254-150-A×2
3:1 Telescope System	Thorlabs	AC254-50-A×2
Galvo Mirrors (GM1,GM2)	Thorlabs	GVS201×2
De-sacn Galvo Mirrors (GM3)	Thorlabs	GVS011
Objective Lens	Olympus	UplanSApo 20×/0.75
Final imaging system	Olympus	UplanFL N 10×/0.3
Final imaging system	Computar	12-36mm/1:2.8
Camera	PCO	Pco.pixelfly usb
Filter	Thorlabs	FEL0800
Mounted Continuously Variable ND Filter	Thorlabs	NDC-50C-4M-A
Line Scan Camera	Thorlabs	SPL2048-140K
Analog Output Board (AO1)	National Instrument	PCI-6731
Analog Output Board (AO2)	National Instrument	PCIe-6351
Long pass filter	Thorlabs	FEL0800