قاعدة البيانات--تسترشد التدفق الخلوي لتقييم نضج الخلية النقوي نخاع العظام

Carmen Mariana Aanei; Marie-Christine Jacob; Richard Veyrat-Masson; Tiphanie Picot; Maria Alessandra Rosenthal-Allieri; Anne-Catherine Lhoumeau; Michel Ticchioni; Florent Dumezy; Lydia Campos Catafal

doi:10.3791/57867

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

من الصعب تشخيص حركة الديمقراطيين الاشتراكيين في غياب المعايير المورفولوجية أو سيتوجينيتيكس غير مفيدة. MFC يمكن أن تساعد في تحسين عملية التشخيص حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. لتصبح مفيدة للممارسة السريرية، يجب أن تعتمد التحليل MFC على المعلمات مع خصوصية وحساسية كافية، وينبغي أن تكون البيانات قابل لإعادة الإنتاج بين مختلف العاملين.

Abstract

ووضعت مجموعة عمل بدأت داخل الرابطة الفرنسية الخلوي (الاتحاد الآسيوي) من أجل تنسيق تطبيق مولتيباراميتير التدفق الخلوي (MFC) لتشخيص الأمراض النقوي في فرنسا. كان البروتوكول المعروضة هنا المتفق عليها وتطبيقها بين عام 2013 في أيلول/سبتمبر وتشرين الثاني/نوفمبر عام 2015 في ستة مختبرات التشخيص الفرنسية (مستشفيات جامعة سانت إتيان، غرينوبل، كليرمون فران، نيس، وليل ومعهد Paoli-كالميتيس في مرسيليا) ويسمح بتوحيد اقتناء البيانات وإعداد عينة نخاع العظام. ووضعت ثلاث قواعد بيانات النضج العَدلات، مونوسيتيك، والأنساب محمر مع نخاع العظام من المانحين "صحية" الأفراد (الأفراد دون أي دليل على وجود مرض المكونة للدم). ينبغي أن تكون طريقة قوية للتحليل لكل النسب النقوي المطبقة للاستخدام التشخيصي الروتيني. يمكن تحليلها بنفس الطريقة الحالات الجديدة ومقارنتها بقواعد البيانات المعتادة. وهكذا، يمكن التعرف على التشوهات المظهرية الكمي والنوعي وتلك المذكورة أعلاه 2SD مقارنة مع بيانات عينات نخاع العظم الطبيعي ينبغي أن يدل على علم الأمراض. أن القيد الرئيسي هو تباين أعلى بين البيانات يتحقق باستخدام الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها بطرق تعتمد على تقنيات هيبريدوما والمستخدمة حاليا في التشخيص السريري. وضع معايير تقنية التحقق من صحة البيانات المكتسبة قد تساعد في تحسين الأداة المساعدة من MFC لتشخيص حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. ويتطلب إنشاء هذه المعايير التحليل مقابل قاعدة بيانات. أن الحد الذاتية المحقق في تحليل البيانات ميزة هامة لهذا الأسلوب.

Introduction

في غياب المظهرية علامات محددة للتغيرات ديسبلاستيك التي تحدث في خلايا النقوي أثناء بدء حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، والتقدم، تم اقتراح نهج جديد في السنوات الأخيرة استناداً إلى تقييم مسارات النضج (التعبير غيرت من النقوي المستضدات خلال إنتاج خلايا ناضجة النقوي) أو التوزيع غير طبيعي لأنواع مختلفة من الخلايا داخل نخاع العظم (بي أم) خلية المقصورات¹^،².

تقدم هذه المقالة طريقة جديدة لتطبيق MFC موحدة من أجل الكشف عن التغييرات ديسبلاستيك في المقصورات خلية النقوي BM تتصل myelodysplastic المتلازمات (حركة الديمقراطيين الاشتراكيين) أو غيرها من أمراض الدم النقوي. وتبين هذه الدراسة أيضا مدى فائدة استخدام قواعد بيانات النضج لتحليل البيانات MFC.

توحيد نماذج إعداد الإجراء والحصول على البيانات، والتحليل باستخدام قواعد البيانات سوف تسمح بتحديد شذوذ المظهرية الأكثر صلة تتعلق بالتغييرات ديسبلاستيك في الخلايا BM النقوي. ولذلك، مجموعات فرعية مختارة إحصائيا استناداً إلى صيغ المسمى جيدا والمعترف بها جيدا (فاصل السكان تلقائي (الجزائرية) مخططات ورسوم بيانية ومؤامرات دوت) مطلوبة من أجل وضع استراتيجية تحليل التي يمكن استخدامها في التحليل اللاحق جولات. اكتشاف تشوهات المظهرية قوية في حركة الديمقراطيين الاشتراكيين سيخفف التشخيص في الحالات مع أو دون الحد الأدنى من خلل التنسج المورفولوجية ودون أبرانسيس الخلوية الوراثية. يمكن تبسيط تحديد المعلمات التمييزية السماح للحد الألواح إيمونوفينوتيبيك الحالي عشرات²، يسمح بتطبيقها في مختبرات علم الأمراض السريرية.

هذا الأسلوب يحد تفسيرات ذاتية لبيانات الخلوي، وقد تم الإشارة في حركة الديمقراطيين الاشتراكيين تشخيص³. هذه الخطوة شرط أساسي لتطوير أدوات مؤتمتة لتجهيز وتحليل تدفق البيانات⁴.

حركة الديمقراطيين الاشتراكيين تضم مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات الاستنساخ من الخلية الجذعية المكونة للدم (HSC) التي تتعاون بها طفرات سبليسيوسومي مع المعدلات جينية محددة تسفر عن النمط الظاهري حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. ومن المعروف الآن أن، جنبا إلى جنب مع الطفرات HSC، آليات أخرى تشارك في حركة الديمقراطيين الاشتراكيين الفيزيولوجيا المرضية، مثل التهاب المناعي بوساطة الشاذة والتفاعلات بين هسكس الخبيثة والمكرويه اللحمية بي أم. بيد أن هذه الآليات لا تزال غير مفهومة. يجعل التغايرية السريرية والبيولوجية على نطاق واسع لحركة الديمقراطيين الاشتراكيين بالتشخيص واختيار العلاج الأمثل تحديا. في العقد الماضي، وقد أظهرت الدراسات المتعددة أن MFC غالباً أكثر حساسية في الكشف عن خلل التنسج² من التشكل، ولكن القيود التقنية والاقتصادية تجعل من الصعب على توحيد، مع النتائج غالباً ما اعتماداً على هذه التقنية تجربة مترجم³. وبالإضافة إلى ذلك، من غير الواضح كيف MFC يمكن ترجيح كفة الميزان نحو حركة الديمقراطيين الاشتراكيين في الحالات مع أو بدون الحد الأدنى من خلل التنسج المورفولوجية وفي غياب الاختلالات الخلوية الوراثية، أو في الحالات الحدية مثل هيبوسيلولار حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، مع عد انفجار منخفضة، من غيرها BM غير الاستنساخ اضطرابات مثل فشل نخاع العظم (أي.، فقر الدم اللاتنسجي). كذلك ما زال من الصعب التفريق بين الحالات الحدية لحركة الديمقراطيين الاشتراكيين مع وجود فائض انفجارات من سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال). ولجميع هذه الأسباب، لا تدمج المبادئ التوجيهية السريرية الاختبار MFC إلى التشخيص النهائي حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. في عام 2011، أوصى الولايات المتحدة وطنية شاملة سرطان شبكة (NCCN) MFC لتقدير النسبة المئوية للخلايا CD34 +، والكشف عن استنساخ انتيابيه الانتيابي، ووجود من استنساخ خلايا T السامة للخلايا في حركة الديمقراطيين الاشتراكيين هيبوسيلولار⁵. هاتين الحالتين الأخير ينطوي أيضا على هدف علاجي لأن البيانات السريرية أظهرت استجابة جيدة لهؤلاء المرضى للعلاج كآبته⁶. سرد المبادئ التوجيهية NCCN 2017، مستشهداً بتوصيات الفريق العامل الدولي (الفريق العامل)، إيمونوفينوتيبينج الشاذة الكشف بواسطة MFC بين المعايير المشتركة لتشخيص حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، ولكن دون إجراء أي مواصفات⁶. وباﻹضافة إلى ذلك، تصنيف منظمة الصحة العالمية نشرت مؤخرا ينص على أن النتائج MFC وحدها ليست كافية لإثبات تشخيص الأولية لحركة الديمقراطيين الاشتراكيين في غياب بيانات قاطعة المورفولوجية و/أو الخلوية الوراثية⁷. ومع ذلك، يمكن استخدام MFC كاختبار إضافية تظهر التقلبات خلية النقوي أنماط النضوج وقياس "المسافة من العادي" لمريض في وقت محدد في مسار المرض.

ينطبق هذا الأسلوب في المختبرات السريرية المهتمة بالأمر في تقييم خلل التنسج في الخلايا BM النقوي استخدام MFC إيمونوفينوتيبينج، بغية تحسين التشخيص في حركة الديمقراطيين الاشتراكيين أو غيرها من اضطرابات النقوي مع شذوذ ديسبلاستيك.

Protocol

قد أقرها البروتوكول المذكورة أدناه "لجنة دي حماية الأشخاص" (لجنة الأخلاقيات المستقل) 1 Est سود من جامعة مستشفى سانت إتيان "، فرنسا".

1-سيتوميتير إعدادات

ملاحظة: الإعدادات cytometer أجريت وفقا للتوصيات "تدفق فرنسا"، وفقا للإجراء يوروفلوو "معيار يوروفلوو التشغيل بروتوكول (SOP) لإعداد الصك والتعويض (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).

إعداد الصك الشهري
1. قم بتشغيل في سيتوميتير. التأكد من وجود جميع مستويات السوائل المناسبة وفتح المغنية 6.1.3. أداء بدء التشغيل فلويديكس: في شريط القوائم، حدد ' سيتوميتير | فلويديكس بدء تشغيل '. انقر فوق 'موافق' عندما تتم مطالبتك. السماح سيتوميتير الحارة لمالا يقل عن 30 دقيقة.
2. فحص الأداء-الخرز لجنة العلم والتكنولوجيا
  ملاحظة: لهذه الخطوة، وإعداد 12 أنبوب البوليستيرين 75 مم، الخرز لجنة العلم والتكنولوجيا، والسوائل غمد (انظر الجدول للمواد).
  1. تسمية أنبوب البوليستيرين² 12 × 75 مم 'لجنة العلم والتكنولوجيا'. مزيج القنينة حبة المتوفر بانعكاس لطيف أو فورتيكسينج لطيف جداً. أضف إلى الأنبوبة المسماة: 0.35 مل من "سائل غمد" وقطره 1 من الخرز لجنة العلم والتكنولوجيا. دوامة الأنبوب بلطف والشروع في اقتناء. تخزين الأنبوبة ليصل إلى 8 س في 2-25 درجة مئوية في الظلام في حالة عدم الحصول على الفور.
  2. إجراء تدقيق الأداء: في شريط القوائم، حدد ' سيتوميتير | لجنة العلم والتكنولوجيا '.
  3. في علامة التبويب 'الإعداد' وحدة لجنة العلم والتكنولوجيا: تأكيد "الثاني كانتو" كما هو الحال في التكوين الافتراضي 4-ح 2-2V وأيضا التأكد من عدم وجود خط أساس التي تم إنشاؤها باستخدام الشحنة الحالية من حبات لجنة العلم والتكنولوجيا لهذا التكوين. في حالة عدم وجود خط أساس، أشير إلى IFU الخرز لجنة العلم والتكنولوجيا. وتؤكد أن هذا الأساس لم تنته: تحت 'مراقبة الإعداد'، حدد 'التحقق من الأداء' من القائمة المنسدلة.
  4. تحقق من 'تحميل أنبوب يدوياً' وانقر فوق 'تشغيل'. تأكد من عرض رقم الشحنة. بلطف ودوامه الخرز المخفف أعد أعلاه وعند مطالبتك بذلك، تحميل الخرز المخفف، وانقر فوق 'موافق'.
  5. عند الانتهاء من التحقق من الأداء، تأكد من أن تمرير "الأداء سيتوميتير". انقر فوق 'عرض تقرير'. إعادة تشغيل تدقيق الأداء إذا لم يمر النتائج. حفظ التقرير في تنسيق PDF مع "تاريخ التقرير تتبع الأداء".
3. ضبط 'PMT الفلورسنت الفولتية' مع "الخرز قوس قزح" (جدول المواد).
  ملاحظة: القيم المستهدفة هي المنصوص عليها في يوروفلوو إجراءات التشغيل القياسية (SOP) بعنوان "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads". هذا سوب متاح على الموقع يوروفلوو (www.euroflow.org; في المجال العام؛ تبويب البروتوكولات).
  1. إنشاء تجربة جديدة عبر '"تاريخ إعداد صك الشهري" | عينة '.
  2. '، اختر معلمات الضوئية وفلوروتشروميس المقابلة للأنابيب المعنية (فيتك، PE، PerCPCy5.5، PE Cy7، آسيا والمحيط الهادئ، APC-H7، V450, V500)، والتحقق من معلمات اقتناء المرجوة (سجل،، ح و/أو W). تطبيق الإعدادات الحالية للعلم (الحق انقر فوق 'إعدادات سيتوميتير' من التجربة). تعيين العتبة للمعلمة FSC 10 آلاف.
  3. في سيتوميتير، إيقاف التعويض أثناء إعداد fluorescence الفولتية PMT لتحديد "مؤسسة مونتانيار المستهدفة"؛ ولهذا الغرض، تذهب في 'المفتش'، انتقل إلى علامة التبويب 'التعويض' تعويض تعطيل عن طريق تأشير 'تمكين تعويضاً' الخيار.
  4. إنشاء ورقة عمل 'مؤسسة مونتانيار الهدف' مع جميع المؤامرات دوت اللازمة (n = 2؛ منتدى التعاون الأمني مقابل التعاون بين بلدان الجنوب، فيتك مقابل PE)، رسوم بيانية (n = 8؛ وواحد من الرسم البياني لكل كاشف الأسفار) وإحصاءات تبين المرجع قيم الذروة (مؤسسة مونتانيار والسيرة الذاتية) لكل قناة الأسفار.
  5. تمييع قطره 1 8-ذروة قوس قزح الخرز المعايرة الجسيمات في 1 مل من الماء المقطر ودوامه قبل الاستخدام. اكتساب دون تسجيل الحل الخرز قوس قزح 8-ذروة معدل تدفق 'منخفضة' . تخزين الأنبوبة ليصل إلى 8 ح في ˚C 2-25 في الظلام في حالة عدم الحصول على الفور.
  6. بوابة القميص الخرز 'السكان P1' في منتدى التعاون الأمني مقابل الأرض دوت المتغيرين SSC وذروة الثامنة أو السابعة في فيتك مقابل الأرض دوت المتغيرين PE (ذروة ألمع أو المرحلة التالية أسفل، كما هو منصوص عليه في وثيقة يوروفلوو بعنوان "20180302_7th_ Peak_Target_Values_Rainbow_Beads ")، واسم هذه البوابة P2 السكان.
  7. مواصلة الحصول على تعليق حبة قوس قزح 8-قمم وضبط الفولتية PMT في جميع الأسفار القنوات للوصول إلى هدف مؤسسة مونتانيار القيم وفقا للوثيقة يوروفلوو "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads".
  8. حالما يتم التوصل إلى القيم "المستهدفة مؤسسة مونتانيار" لذروة السابعة أو الثامنة، سجل "مؤسسة مونتانيار المستهدف" تحقيقه والقيم المناظرة في PMT النهائي. وتكتسب أحداث 5,000 وتسجيل البيانات.
    ملاحظة: أن PMT القيم يجب أن يمكن استخدام أدناه في الخطوة 1.2.3 (تحقق الأداء-تأكيد قيم PMT مع الخرز قوس قزح).
  9. تسجيل هذه القيم جعل طباعة الشاشة مع إعدادات 'مؤسسة مونتانيار الهدف' وصك ورقة العمل وحفظ كصورة.jpg.
    ملاحظة: عندما يتم إنشاء أنبوب "جديدة"، في بعض الأحيان قيم PMT تختلف بشكل غير متوقع. لهذا، من الضروري التحقق المزدوج من PMT. مقارنة كل الوقت القيم PMT للملاحظات الخاصة بك، تأكد من صحة القيم 'مؤسسة مونتانيار الهدف' وقيم PMT!
  10. حفظ 'إعدادات التطبيق'. في المستعرض، انقر بالزر الأيمن على 'إعدادات سيتوميتير'. من القائمة المنسدلة، حدد 'إعدادات التطبيق'، وحفظ. انقر فوق 'موافق'. إذا تمت مطالبتك، انقر فوق نعم للحفاظ على قيم العتبة.
    ملاحظة: حفظ "إعدادات التطبيق" باستخدام الاسم الافتراضي. عدم إعادة تسمية الإعدادات.
4. ضبط 'FCS' و 'SSC الفولتية' مع تفكيك الدم المغسول (LWB).
  ملاحظة: لهذه الخطوة، هناك حاجة 50 ميكروليتر من عينة الدم المحيطي (PB) من التوصل إلى حل سليم المتطوعين، ليسينج (جدول المواد) والغسيل المخزن المؤقت.
  1. بيبيتس 50 ميليلتر من الجريدة الرسمية في أنبوب. إضافة 2 مل من محلول ليسينج الطازج المخفف. المزيج بلطف واحتضان لمدة 10 دقائق في الرايت
  2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 540 س ز.
  3. نضح المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية، ترك حوالي 50 ميليلتر حجم المتبقية في الأنبوب. المزيج بلطف وإضافة 2 مل من محلول الغسيل التي تمت تصفيتها.
  4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 540 س ز.
  5. كرر مرة أخرى 1.1.4.3–1.1.4.4 الخطوات.
  6. إضافة 250 ميليلتر من المخزن المؤقت للغسيل المصفاة وتخلط بلطف.
  7. في التجربة التي تم إنشاؤها لاقتناء "الخرز قوس قزح"، إنشاء جديدة من ' عينة | ورقة عمل جديدة ': رسم رسم بياني SSC-A/A--منتدى التعاون الأمني ثنائي حدودي.
  8. الحصول على الخلايا، وبوابة اللمفاوية في منتدى التعاون الأمني مقابل الأرض دوت المتغيرين SSC وضبط الفولتية منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب للوصول إلى القيم المستهدفة يعني التالية للسكان اللمفاويات المبوب: منتدى التعاون الأمني: 55,000 (مجموعة 50,000 – 60,000)، والتعاون بين بلدان الجنوب: 13,000 (طائفة 11,000 –15,000).
  9. حيازة وتسجيل البيانات مع الأحداث حوالي 10,000. تحقق من القيم المستهدفة يعني منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب لبوابات الخلايا الليمفاوية. إعادة ضبط الجهد منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب إذا لزم الأمر.
  10. طباعة الشاشة وتخزين طباعة قيم القناة المستهدفة التي تم الحصول عليها.
5. إعدادات تعويض الأسفار.
  ملاحظة: يجب أن يتم تعيين عناصر التعويض الملطخة بمفرده بعد الإعدادات "مؤسسة مونتانيار المستهدفة" وتم إنشاء منتدى التعاون الأمني/SSC الإعدادات. ويلزم لهذه الخطوة، الجريدة الرسمية من متطوعة صحية، "تعويض الجسيمات" (جدول المواد)، ليسينج الحل والغسيل المخزن المؤقت. يتم سرد القائمة من جسم مترافق fluorochrome الكواشف المستخدمة لإعداد مصفوفات التعويض الأسفار وسكانها المرجعية في الجدول 1.
  1. أنبوب واحد كل كاشف لاستخدامها في إعداد التعويض fluorescence تسمية (فيتك، PE، PerCPCy5.5، وآسيا والمحيط الهادئ، V450، V500، PECy7-CD117، آسيا والمحيط الهادئ-H7-CD10، آسيا والمحيط الهادئ-H7-CD14 وآسيا والمحيط الهادئ-H7-CD71) وأنبوب "فارغة/أونستينيد".
  2. بيبيت 50 ميليلتر من الجريدة الرسمية في كل أنبوب أو قطره 1 "السلبية" تعويض الجسيمات + 1 قطره من الجسيمات التعويض "إيجابية" في أنابيب التحكم التعويض المشار إليها أعلاه في الجدول 1.
  3. إضافة القدر المناسب من جسم الكاشف للأنبوب. إضافة المخزن المؤقت الغسيل التي تمت تصفيتها للوصول إلى وحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر كل أنبوب وتخلط برفق. احتضان لمدة 15 دقيقة في الرايت، محمية من الضوء.
  4. إضافة 2 مل من محلول ليسينج الطازج المخفف فقط في الأنابيب مع الخلايا وتخلط بلطف. احتضان لمدة 10 دقيقة في الرايت، محمية من الضوء.
  5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 540 س ز.
  6. نضح المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية ترك حوالي 50 ميليلتر حجم المتبقية في كل أنبوبة. المزيج بلطف. إضافة 2 مل من المخزن المؤقت للغسيل التي تمت تصفيتها.
  7. الطرد المركزي 5 دقائق في 540 س ز.
  8. نضح المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية ترك حوالي 50 ميليلتر حجم المتبقية في كل أنبوبة. إضافة المخزن المؤقت الغسيل التي تمت تصفيتها للوصول إلى وحدة تخزين نهائي من 250 ميليلتر كل أنبوب وتخلط برفق.
  9. إنشاء عناصر التعويض.
    1. من شريط القوائم، حدد التجربة التي تم إنشاؤها لاقتناء "الخرز قوس قزح". إنشاء جديدة من ' عينة | إعداد التعويض | إنشاء عناصر التعويض.
    2. في مربع الحوار الناتج, حدد خانة الاختيار 'التحكم أونستينيد منفصلة تشمل أنبوب/جيدا' . إنشاء عناصر التعويض (تسمية محددة لا) عامة فيتك، PE، PerCPCy5.5، وآسيا والمحيط الهادئ، HV450، HV500. إنشاء عناصر التحكم الخاصة بتسمية تعويض PE-Cy7-CD117، آسيا والمحيط الهادئ-H7-CD10، آسيا والمحيط الهادئ-H7-CD14 وآسيا والمحيط الهادئ-H7-CD71. انقر فوق 'موافق'.
    3. في ورقة عمل جديدة، إنشاء رسم بياني SSC-A/A--منتدى التعاون الأمني ثنائي حدودي ورسم بوابة على الخلايا الليمفاوية (P1) والرسم البياني المقابلة فلوروتشرومي التي سيتم الكشف عنها في كل أنبوب ورسم بوابة P2 لذروة الإيجابية. عرض التسلسل الهرمي (انقر على الحق في الرسم البياني، وحدد 'إظهار التسلسل الهرمي السكان') لتصور عدد الأحداث في P2، باستثناء أنبوب "التحكم أونستينيد".
    4. في المستعرض، قم بتوسيع العينة "ضوابط التعويض".
    5. دوامة إعداد الخلايا أونستينيد، أعلاه، لتثبيت 3 – 5 س. الخلايا أونستينيد مستعدة على سيتوميتير. ضبط معدل التدفق إلى 'المتوسطة' ، وانقر فوق 'الحصول على بيانات'. في مقابل منتدى التعاون الأمني بالمؤامرة دوت بالتعاون بين بلدان الجنوب، وضبط البوابة P1 ليشمل كامل السكان اللمفاويات. انقر بالزر الأيمن على بوابة P1. حدد 'تطبيق لجميع التعويضات السيطرة'.
    6. من لوحة 'شراء' ، انقر فوق '"سجل البيانات"' للحصول على أحداث 5,000. لكافة الخلايا التحكم الملون أحادي اللون، تحقق من أن بوابة P2 الفاصل الزمني ليشمل السكان إيجابية.
    7. PE Cy7 وأنابيب APCH7، إضافة بوابة P3 الفاصل زمني للرسم البياني وضمان أنه يشمل السكان سلبيا، وأن يشمل P2 السكان إيجابية.
    8. حساب التعويض. من شريط القوائم، حدد ' التجربة | إعداد التعويض | حساب التعويض '. اسم مصفوفة التعويض: 'تاريخ التعويضات'. حدد 'الارتباط وحفظ'.
    9. حفظ مصفوفة التعويض في "إعدادات التطبيق في النشرة المصورة": انقر فوق '"إعدادات سيتوميتير"| إعدادات التطبيق | حفظ '، واسم مصفوفة التعويض ' تاريخ التعويض ' ثم انقر فوق ' موافق '.
    10. في المستعرض، انقر فوق 'إعدادات سيتوميتير'. في المفتش، انتقل إلى علامة التبويب 'التعويض' "انقر فوق طباعة" في الزاوية اليمنى السفلي.
      ملاحظة: هذا يمكن أيضا استرداد المعلومات من النشرة المصورة.
    11. مراقبة مصفوفة التعويض.
      1. خلط في أنبوب واحد كل أنبوب الملون واحدة (APCH7 الاختيار).
      2. إنشاء تجربة جديدة المسمى 'تاريخ التحقق التعويض'، وإضافة عينات جديدة، انقر فوق اليمين في 'إعدادات سيتوميتير' من هذه التجربة واختر ' الارتباط | إلغاء ارتباط | إعداد التطبيق ' بحفظه في الخطوة 1.1.3.10. اكتساب 50,000 الأحداث من هذا الأنبوب مع الإعدادات الجديدة.
      3. تطبيق "ورقة العمل العالمي" الجديد. إنشاء 1 دوت الأرض منتدى التعاون الأمني-A/SSC-أ ورسم بوابة لتصور الخلايا الليمفاوية ون س (n-1)/2 قطع أخرى ركزت على بوابة لمفاوية لتصور المعلمات اثنين باثنين.
إعداد الصك اليومية
1. قم بتشغيل في سيتوميتير. التأكد من وجود جميع مستويات السوائل المناسبة وفتح المغنية 6.1.3. أداء بدء التشغيل فلويديكس: في شريط القوائم، حدد ' سيتوميتير | فلويديكس بدء تشغيل '. انقر فوق 'موافق' عندما تتم مطالبتك. السماح سيتوميتير الحارة لمالا يقل عن 30 دقيقة.
2. فحص الأداء-"الخرز لجنة العلم والتكنولوجيا": تكرار 1.1.2.1–1.1.2.5 الخطوات.
3. فحص الأداء-تأكيدا لقيم PMT مع الخرز قوس قزح.
  1. تسمية أنبوب البوليستيرين ك 'قوس قزح الخرز' وتأكد من أن رقم الشحنة في الاستخدام. مزيج دقيق القنينة "حبة قوس قزح". إعداد "الخرز قوس قزح"، إضافة 1 قطره من "الخرز قوس قزح" 1 مل من الماء المقطر أو منزوع. حماية من الضوء.
    ملاحظة: الشروع في اقتناء أو تخزين الأنبوب في ˚C 2-8 حتى اقتناء.
  2. إنشاء تجربة جديدة: 'قوس قزح الخرز تاريخ'.
  3. ربط التعويضات: الحق انقر فوق 'إعدادات سيتوميتير'وتحديد 'إعداد الارتباط'وتحديد التعويض المناسب المصفوفة التي تم إنشاؤها في الخطوة 1.1.5.9.9 وحدد 'الكتابة'.
  4. إلغاء ارتباط التعويض: الحق انقر فوق 'إعدادات سيتوميتير'وحدد 'إلغاء الارتباط من الإعداد المرتبطة سابقا' وانقر فوق 'موافق'.
  5. تطبيق 'إعدادات التطبيق': الحق انقر فوق 'إعدادات سيتوميتير'وتحديد 'إعدادات التطبيق'وتطبيق الإعداد التي تم إنشاؤها في الخطوة 1.1.3.10 أثناء "الإعداد الشهرية" وحدد 'الاحتفاظ بقيمة التعويض'.
  6. قم بإلغاء تحديد 'تمكين تعويض'.
  7. إنشاء نموذج جديد في التجربة مع قالب ورقة عمل بالنسبة "الخرز قوس قزح". الحصول على الأنبوب في اقتناء 'منخفضة' .
  8. خلال اقتناء الخرز، ضبط البوابة P1 ليشمل السكان حبة القميص فقط. ضبط بوابة P2 على الأرض دوت فيتك-A/PE-A ليشمل السكان حبة القميص فقط. سجل الأحداث 10,000.
  9. تحقق من أن مؤسسة مونتانيار والقيم الذاتية التي تم الحصول عليها للسكان P2 في أهداف محددة مسبقاً للبروتوكول. وبخلاف ذلك، تغسل في سيتوميتير وبدء العملية مرة أخرى. حفظ التقرير كتنسيق PDF.

2. إعداد نموذج بي أم

ملاحظة: تنفيذ الخلية الغسيل البروتوكول قبل الإجراء المصبوغة.

"الماصة؛" 600 ميليلتر من العينة الأولية في أنبوب الطرد مركزي 15 مل.
أضف 10 مل من الغسيل المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + 0.5% جيش صرب البوسنة [> 98 ٪ نقية جيش صرب البوسنة] + 0.09% نان₃ تصفية الحل، درجة الحموضة 7.4). خلط جيدا باستخدام ماصة تعليق خلية.
أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 540 س ز (الغسيل 1). تجاهل المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية.
كرر الخطوات من 2.2 – 2.3 (يغسل 2).
تعليق بيليه الخلية في 400 ميليلتر للغسيل المخزن المؤقت.
تلوين علامات العمود الفقري. نقل وحدة التخزين بأكملها من الأجسام المضادة العمود الفقري لأنبوب البوليبروبيلين لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، وحددت مع بيانات المريض و "العمود الفقري". إضافة 350 ميليلتر من عينة غسلها (حجم العينة غسلها المطلوبة لملء جميع الأنابيب في الفريق). كذلك استخدام ماصة مزيج.
ملاحظة: حساب الحجم الإجمالي للعمود الفقري الأجسام المضادة للغشاء السطحي تلطيخ (كما هو موضح في الجدول 2).
"الماصة؛" كميات متساوية من مزيج عينة-العمود الفقري في 3 أنابيب البولي بروبلين لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، وحددت مع بيانات المريض و "أنبوب رقم 1" إلى "الأنبوب رقم 3". إذا لزم الأمر، استخدام المخزن المؤقت للغسيل للوصول إلى وحدة تخزين نهائي من 200 ميليلتر كل أنبوب.
تنبيه: كن حريصا على عدم ترك أي أثر للعينة على جدران الأنابيب؛ وبخلاف ذلك، سوف لا الملون هذه الخلايا. إذا لزم الأمر، دوامة الخلايا وأجهزة الطرد المركزي الأنبوب.
في كل أنبوب، إضافة وحدة التخزين المناسبة للأجسام المضادة الموجهة ضد علامات خلية السطحية (باستثناء علامات العمود الفقري)، ك محدد في الجدول 2. كذلك استخدام ماصة مزيج. احتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت محمية من الضوء.
إضافة 2 مل من ليسينج الحل. كذلك استخدام ماصة مزيج. احتضان لمدة 10 دقيقة في الرايت محمية من الضوء.
أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 540 س ز. تجاهل المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية، ترك حوالي 50 ميليلتر حجم المتبقية في كل أنبوبة. كذلك استخدام ماصة مزيج.
إضافة 2 مل الغسيل المخزن المؤقت إلى بيليه الخلية. كذلك استخدام ماصة مزيج.
كرر الخطوات 2، 10 – 2.11 (يغسل 2).
أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 540 س ز. تجاهل المادة طافية بدون إزعاج بيليه الخلية وإعادة تعليق بيليه الخلية في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. كذلك استخدام ماصة مزيج.
الحصول على الخلايا، ويفضل أن يكون ذلك، فورا بعد تلطيخ أو تخزين عند 4 درجة مئوية، محمية من الضوء، للا يزيد عن 1 ح حتى يقاس في سيتوميتير التدفق.

3. الحصول على البيانات

فتح "تجربة جديدة" في مجال البرمجيات المغنية وتسميتها حسب الاسم، ونوع العينة والتاريخ.
قم بإنشاء نموذج جديد يحتوي على 3 أنابيب. تحديد الأجسام المضادة المستخدمة في كل أنبوبة في "تخطيط التجربة".
انقر فوق الحق في 'إعدادات سيتوميتير'واختر 'إعدادات التطبيق' وتطبيق القيم التي تم الحصول عليها في "الإعداد الشهرية" (الخطوة 1.1.3.10).
افتح "ورقة عمل" جديدة عالمية وإنشاء قطع دوت: SSC-أ/منتدى التعاون الأمني-أ، SSC-أ/CD45-HV500-أ، SSC-أ/فيتك-أ، SSC-أ/PE-أ، SSC-أ/CD34-بيركب-Cy5.5، SSC-أ/CD117-PECy7-أ، SSC-أ/APC-أ، SSC-أ/APCH7-أ، SSC-أ/هلا-الدكتور-HV450-ألف. في المؤامرة دوت SSC-A/منتدى التعاون الأمني-A، إنشاء بوابة لتحديد الخلايا القميص. في المؤامرة دوت SSC-A/CD45-BV500-A، إنشاء بوابات لتحديد السكان 4: الخلايا الليمفاوية وانفجارات، المحببة ووحيدات. مشروع هؤلاء السكان في نقطة المؤامرات التي تم إنشاؤها مسبقاً.
قم بإنشاء "ورقة عمل عالمية" جديدة لتعويض عنصر التحكم كما هو موضح في الخطوة 1.1.5.9.11.3.
الحصول على الأنبوب في اقتناء 'المتوسط' وسجل 500,000 الأحداث/الأنبوبة. بعد التحقق من التقنية (تقييم التعويض وتلطيخ السليم)، تصدير البيانات كملفات FCS3.0.

4. تحليل البيانات

ملاحظة: لبناء قواعد البيانات بي أم عادية كانت الملفات المستخدمة من المانحين صحية ومن الأفراد دون أي دليل لمرض المكونة للدم على النحو التالي 11 من 18 ملفات Neutrophils_NM من قاعدة البيانات، 10 من 18 صورة لقاعدة البيانات Monocytes_NM و 14 من 18 ملفات قاعدة البيانات NRC_NM. تجاهل الملفات أظهرت مختلف المشاكل التقنية، كما عرضت في قسم النتائج الممثل. حللت الملفات منفردة باستخدام البرمجيات إينفينيسيت (جدول المواد)، مطابقة لمختلف الاستراتيجيات المبينة في الشكل 1A(1-3) للنسب العَدلات (Neutrophils_Maturation.inp الشخصية)، رقم 2 أ لنسب الوحيدات (Monocytes_Maturation.inp الشخصية)، و الرقم 3A(1-2) للنسب خلية محمر (NRC_Maturation.inp الشخصية).

استراتيجية التحليل العَدلات --بناء قاعدة بيانات Neutrophils_NM
1. تحديد CD34 + العَدلات ارتكبت انفجارات استخدام تقاطع سبعة أبواب، مما يتيح اختيار CD34 + CD117 + هلادر + منخفض CD10-CD13 + CD11b-الأحداث (الشكل 1ألف-1). تعيين هذه الأحداث إلى علامة التبويب 'العَدلات' في "شجرة التسلسل الهرمي للسكان"، وبعد ذلك قم بإلغاء تحديد علامة التبويب هذه من أجل إزالة هذه الخلايا (المبينة باللون الأزرق) من عرض الأحداث المتبقية (رمادي).
2. عزل CD117 + CD34-CD13 + CD11b-هلادر + السلائف العَدلات منخفض باستخدام تقاطع بين البوابات الستة كما هو مبين في الشكل 1A(2) وتعيينها على علامة التبويب 'العَدلات' .
3. تحديد العَدلات أكثر نضجاً استخدام تقاطع أربع بوابات، مما يسمح للتمييز ضد CD45dim ستشينت-مرحبا CD117-هلادر-الخلايا وانتدابهم إلى علامة التبويب 'العَدلات' .
4. قم بإلغاء تحديد الأحداث المتبقية، الإبقاء فقط العَدلات مرئية، ثم تصدير هذه الفئة من السكان بواسطة النقر فوق ' الملف | تصدير ' والتحقق من أن كافة المعلمات المطلوبة يتم إيداع وحفظ البيانات كملفات FCS.
5. في ملف مدمجة تتكون من جميع الملفات المصدرة في سفح المنحدر القاري، إجراء فحص جودة عن طريق تقييم كثافة التعبير عن علامات لكل يتدنى. استخدام APS المؤامرات مع المتوسطات لكل ملف ومنحنيات SD لكل يتدنى سيظهر، إزالة الحالات خارج منحنيات 2SD (انظر التفاصيل في قسم النتائج الممثل) (الشكل 1ب).
6. في ملف يتكون الناتج مع "العَدلات" مرئياً، رسم "مسار النضج" في رسم تخطيطي لوكالة الأنباء الجزائرية (الشكل 1ج اليسار) وحفظ ملف كملف.cyt.
  ملاحظة: يسمح مقارنة "الرسم التخطيطي نضج" التصور من كافة المعلمات من كافة الملفات المضمنة في قاعدة Neutrophils_NM ممثلة ضد قاعدة البيانات الموحدة. المخطط في الشكل 2ج، الجانب الأيمن، يظهر أن كافة الملفات المدرجة في قاعدة البيانات Neutrophils_NM (n = 11) يصلح في 2 SD مقارنة مع متوسط المجموعة.
استراتيجية التحليل وحيدات-بناء قاعدة بيانات Monocytes_NM
1. تحديد خلايا السلالة مونوسيتيك (CD117--/+ CD64 + مرحبا هلادر + مرحبا) استخدام تقاطع أربع بوابات (الشكل 2أ). قم بتعيين هذه الأحداث إلى علامة التبويب 'مونوسيتيك' في "شجرة التسلسل الهرمي للسكان".
2. قم بإلغاء تحديد الأحداث المتبقية، حفظ الخلايا مونوسيتيك فقط مرئية، ثم تصدير هذه الفئة من السكان بواسطة النقر فوق ' الملف | تصدير ' والتحقق من أن كافة المعلمات المطلوبة يتم إيداع وحفظ البيانات كملفات FCS.
3. في ملف مدمجة تتكون من جميع الملفات المصدرة في سفح المنحدر القاري، إجراء فحص جودة عن طريق تقييم كثافة التعبير عن علامات لكل يتدنى، ثم إزالة الحالات خارج منحنيات 2SD (التفاصيل في قسم النتائج الممثل) (الشكل 2 ب).
4. في الملف الناتج مع "مونوسيتيك" الخلايا المرئية، رسم "مسار النضج" على الرسم التخطيطي لوكالة الأنباء الجزائرية (الشكل 2ج اليسار) وحفظ هذا ملف كملف.cyt.
  ملاحظة: يسمح مقارنة "الرسم التخطيطي نضج" التصور من كافة المعلمات من كافة الملفات المضمنة في قاعدة Monocytes_NM ممثلة ضد قاعدة البيانات الموحدة. المخطط في الشكل 2ج، الجانب الأيمن، يظهر أن كافة الملفات المدرجة في قاعدة البيانات Monocytes_NM (n = 10) يصلح في 2 SD مقارنة مع متوسط المجموعة.
استراتيجية لتحليل للخلايا الحمراء المنواه (سوسيولوجيا)-بناء قاعدة بيانات NRC_NM
1. تحديد محمر ارتكبت انفجارات CD34 + استخدام تقاطع بين البوابات السبع التي تتيح اختيار CD34 + CD117 + هلادر + منخفض CD105 + CD33-CD36 + CD71 + الأحداث (الشكل 3A(1)). قم بتعيين هذه الأحداث إلى علامة التبويب "مجلس اللاجئين النرويجي" في "شجرة التسلسل الهرمي للسكان" وثم قم بإلغاء تحديد علامة التبويب هذه من أجل إزالة هذه الخلايا (المبينة باللون الأحمر) من عرض الأحداث المتبقية (رمادي).
2. تحديد المراسلين أكثر نضجاً استخدام تقاطع بين البوابات الأربع التي تسمح بالتمييز من CD45--/+ خافت CD36 سكلوو + مرحبا CD71 + مرحبا CD105 +/--الخلايا. قم بتعيين هذه الأحداث إلى علامة التبويب "مجلس اللاجئين النرويجي" (الشكل 3A(2)). الصفائح الدموية (CD36 + مرحبا سكلوو الخلايا) يجب إزالتها من المجلس النرويجي للاجئين السكان (الشكل 3A(2)).
3. قم بإلغاء تحديد الأحداث المتبقية، حفظ الخلايا المجلس النرويجي للاجئين فقط مرئية، ثم تصدير هذه الفئة من السكان بواسطة النقر فوق ' الملف | تصدير ' والتحقق من أن كافة المعلمات المطلوبة يتم إيداع وحفظ البيانات كملفات FCS.
4. في ملف مدمجة تتكون من جميع الملفات المصدرة في سفح المنحدر القاري، إجراء فحص جودة عن طريق تقييم كثافة التعبير عن علامات لكل يتدنى، متبوعاً بإزالة الحالات خارج ((انظر التفاصيل في قسم النتائج الممثل) منحنيات 2SD الشكل 3 ب).
5. في الملف الناتج مع "مجلس اللاجئين النرويجي" الخلايا المرئية، رسم "مسار النضج" على الرسم التخطيطي لوكالة الأنباء الجزائرية (الشكل 3جيم، اليسار) وحفظ هذا ملف كملف.cyt.
  ملاحظة: يسمح مقارنة "الرسم التخطيطي نضج" التصور من كافة المعلمات من كافة الملفات المضمنة في قاعدة NRC_NM ممثلة ضد قاعدة البيانات الموحدة. المخطط في الشكل 3جيم، الجانب الأيمن، يظهر أن كافة الملفات المدرجة في قاعدة البيانات NRC_NM (n = 14) يصلح في 2 SD مقارنة مع متوسط المجموعة.
تقييم نضج في المقصورات النقوي BM استخدام "قواعد البيانات نضوج"
1. افتح الملف.cyt المقابلة لنسب الفائدة (أي.، Neutrophils_NM_GMFF.cyt للنسب العَدلات، Monocytes_NM_GMFF.cyt للنسب مونوسيتيك، و NRCs_NM_GMFF.cyt للنسب محمر).
2. زر الماوس الأيمن فوق علامة التبويب 'نضوج' أسفل علامة التبويب المقابلة لنسب الفائدة (' العَدلات | مونوسيتيك | المجلس النرويجي للاجئين ') وحفظ قاعدة بيانات النضج إلى النضج.
3. فتح ملف جديد FCS وإجراء التحليل كما هو موضح سابقا (الخطوة 4.1.1–4.1.3 العَدلات، خطوة 4.2.1 للخلايا مونوسيتيك، والخطوة 4.3.1–4.3.2 للمجلس النرويجي للاجئين).
4. رسم مسار النضج لسكان الفائدة.
5. افتح قاعدة البيانات المقابلة في علامة التبويب 'أدوات' (تحليل قاعدة البيانات) وقارن بين السكان يتم تحليلها مع "نضوج قاعدة البيانات" المطابقة. التحقق من صحة البيانات للتوافق مع قاعدة البيانات المتاحة: استكمال التوافق (المثلث الأخضر)؛ التوافق الجزئي، في معظم الحالات تناقضات باسم المعلمات (مثلث أصفر)؛ وعدم التوافق (مثلث أحمر).
6. إذا كانت البيانات متوافقة أو متوافقة جزئية، ينشئ البرنامج الرسم التخطيطي 'تطبيع' نضوج الاختلافات . تصور 'الاختلافات نضوج الفرقة المعلمة'وفتح رسم تخطيطي جديد في التبويب 'المخطط' ، انقر فوق 'نضوج' واختر كم عدد المعلمات ليتم عرضها، انقر فوق 'موافق' والمخطط تظهر. مع انقر على الحق في الرسم التخطيطي؛ يمكن إجراء تغييرات في البيانات التصور، وقاعدة بيانات التصور والتصور التخطيطي النضوج.
7. لتصور أهمية الاختلافات بين الملف الجديد والبيانات المدرجة في قاعدة البيانات، قم بتكوين تكبير (انقر بالزر الأيمن على 'تطبيع' نضوج الخلافات وتطبيق 'تكبير').

النتائج

شملت العينات BM 54 تحصد في كيدتا تخثر الدم في الدراسة. تم تحليل البيانات MFC في غياب أي معلومات عن المرضى. أظهرت دراسة استعادية أن العينات BM من المانحين صحية 7 (5 من الذكور والإناث 2 مع عمر وسيط من 47.4 [35-48]، والأفراد 11 مع أي دليل على وجود مرض المكونة للدم (8 من الذكور والإناث 3 مع عمر...

Discussion

نوعية أسبيراتي بي أم يمكن أن تؤثر على النتائج النهائية. تخفيف الدم أسبيراتي بي أم يمكن أن تشوه توزيع الخلايا في مراحل مختلفة من النضج بسبب الغياب من فروعه أو خلايا السلائف. ربما تستخدم الجزء الأكبر ليسينج الأسلوب قد تساعد في تطبيع تبين BM لتخفيف الدم في تحليل تدفق سيتوميتريك. وبالإضافة إلى ?...

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية. إدارة التدفق الخلوي، مختبر أمراض الدم في "مستشفى جامعة من سانت إتيان" عضو في اتحاد يوروفلوو.

Acknowledgements

الأجسام المضادة التي استخدمت في هذه الدراسة قدمت "العلوم دينار بحريني". الكتاب أود أن أشكر زميلهم، الدكتور باسكال فلاندرين-جريستا، من قسم البيولوجيا الجزيئية، مختبر أمراض الدم، جامعة مستشفى سانت إتيان "، فرنسا"، الذين قدموا الخبرة لتفسير البيانات خ ع و للمرة الثانية حالة حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. الكتاب شاكرون للطبيب هيماتولوجيستس للاهتمام والمشاركة في هذه الدراسة، والمرضى والجهات المانحة صحية لموافقتها على المشاركة في هذه الدراسة. الكتاب أيضا يود أن يشكر مؤسسة "Les بعثة الاتحاد الأفريقي دي ريمي" للدعم المالي للنشر.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCanto II flow-cytometer	BD Biosciences, CA, USA	SN: V33896301336	3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuge	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; Model No: 320002001	low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes
Pipetts of 10µL and 200µL
Pasteur pipettes
15 mL Falcon tubes
polypropylene tube for FACS
Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777	clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406	clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, CA, USA	333143	clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, CA, USA	641394	clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD33		345800	clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Lysing Solution 10x Concentrate (IVD)	BD Biosciences, CA, USA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS&T IVD beads	BD Biosciences, CA, USA	656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS	Cytognos, Salamanca, Spain	SPH-RCP-30-5A	lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
Phosphate buffered saline tablets	R&D Systems, Minneapolis, USA	5564
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, France	A9647
Sodium azide 99%	Sigma-Aldrich, France	199931
Infinicyt software version 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Spain

References

Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes. Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).
Porwit, A., et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow). Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).
Westers, M. T., et al. Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS. Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).
Meehan, S., et al. AutoGate: automating analysis of flow cytometry data. Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).
Greenberg, P. L., et al. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).
Greenberg, P. L., et al. Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).
Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. (2), 86-128 (2017).
. https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html Available from: https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html (2018)
. . Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).
. . EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).
Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).
van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).
Matarraz, S. Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).
Westers, M. T. Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group). Haematologica. 102, 308-319 (2017).
Shen, Q., et al. Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response. European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

141 MFC myelodysplastic MFC

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: