Datenbank-geführte Durchflusszytometrie zur Auswertung von Knochenmark myeloische Zellen Reifung

Zusammenfassung

Die MDS-Diagnose ist schwierig bei fehlender morphologischer Kriterien oder nicht-informativen Zytogenetik. MFC könnte dazu beitragen, den MDS diagnostischen Prozess zu verfeinern. Nützlich für die klinische Praxis zu werden, die MFC-Analyse muss auf Parametern beruhen mit ausreichender Spezifität und Sensitivität und Daten sollten zwischen verschiedenen Betreibern reproduzierbar sein.

Zusammenfassung

Eine Arbeitsgruppe innerhalb der französischen Zytometrie Verband (AFC) initiiert wurde entwickelt, um die Anwendung der multiparameter Durchflusszytometrie (MFC) in Einklang zu bringen für die myeloischen Krankheit Diagnose in Frankreich. Die hier vorgestellten Protokoll war vereinbarten und angewandte September 2013 bis November 2015 in sechs französischen diagnostische Laboratorien (Universitätskliniken von Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nizza, und Lille und Institut Paoli-Calmettes in Marseille) und erlaubt die Standardisierung von Knochenmark Probe Vorbereitung und Datenerfassung. Für Neutrophilen, monozytären, und erythroiden Linien mit Knochenmark von "gesunden" Spenders Einzelpersonen (Individuen ohne Nachweis einer hämatopoetischen Krankheit) wurden drei Reifung Datenbanken entwickelt. Eine robuste Methode zur Analyse für jedes myeloid Abstammung sollte für den Routineeinsatz diagnostische Anwendung finden. Neuerkrankungen können auf die gleiche Weise analysiert und mit den üblichen Datenbanken verglichen. So, quantitative und qualitative phänotypische Anomalien identifiziert werden können und den oben genannten 2SD im Vergleich mit Daten des normalen Knochenmarkproben gezogen werden bezeichnend für Pathologie. Die größte Beschränkung ist die höhere Variabilität zwischen den Daten mit Hilfe der monoklonale Antikörper erhalten mit den Methoden basieren auf Hybridom-Technologien und derzeit in der klinischen Diagnostik eingesetzt. Festlegung von Kriterien für technische Validierung der gewonnenen Daten kann dazu beitragen das MFC-Dienstprogramm für die MDS-Diagnostik. Die Festlegung dieser Kriterien erfordert eine Analyse anhand einer Datenbank. Die Reduzierung der Ermittler Subjektivität in der Datenanalyse ist ein wichtiger Vorteil dieser Methode.

Einleitung

In Ermangelung der phänotypischen Marker speziell für die dysplastischen Veränderungen in myeloische Zellen während MDS Initiation und Progression schlägt ein neuer Ansatz in den letzten Jahren, basierend auf der Auswertung der Reifung Bahnen (veränderte Expression von myeloische Antigene bei der Herstellung von Reifen myeloische Zellen) oder abnorme Verteilung der verschiedenen Zelltypen im Knochenmark (BM) Zelle Fächer^1,2.

Dieser Artikel stellt eine neue Methode für standardisierte Anwendung von MFC um dysplastische Veränderungen in BM myeloische Zellen Fächer im Zusammenhang mit myelodysplastischen Syndromen (MDS) oder anderen myeloischen hämatologischen Krankheiten zu erkennen. Diese Studie zeigt auch das Dienstprogramm Reifung Datenbanken für MFC Datenanalyse zu verwenden.

Standardisierung der Vorbereitung Beispielprozedur, Datenerfassung und Analyse mit den Datenbanken würde es der relevantesten phänotypischen Anomalien im Zusammenhang mit dysplastische Veränderungen in BM myeloische Zellen ermöglichen. Daher sind statistisch ausgewählte Teilmengen basierend auf gut beschriftet und anerkannter Formaten (automatische Bevölkerung Separator (APS) Diagramme, Histogramme und Punkt plottet) erforderlich für die Entwicklung einer Strategie-Analyse, die in der nachfolgenden Analyse verwendet werden können Runden. Die Entdeckung der robuste phänotypischen Anomalien bei MDS würde in Fällen mit oder ohne minimale morphologische Dysplasie und zytogenetische Aberrancies die Diagnose erleichtern. Identifikation der diskriminierenden Parameter ermöglicht die Reduzierung der Immunophenotypic Platten kann die aktuelle Resultate², deren Anwendbarkeit im klinischen Pathologie-Labor bei schönem vereinfachen.

Diese Methode schränkt die subjektiven Interpretationen der Zytometrie Daten, wie in MDS Diagnose³signalisiert worden. Dieser Schritt ist eine Voraussetzung für die Entwicklung von automatisierten Tools für die Verarbeitung und Analyse fließen Daten⁴.

MDS umfasst eine heterogene Gruppe von klonalen hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Störungen in denen Spliceosome Mutationen mit spezifische epigenetische Modifikatoren den MDS-Phänotyp Ausbeute Zusammenwirken. Es ist nun bekannt, dass zusammen mit HSC Mutationen, MDS Pathophysiologie, z. B. abweichende immunvermittelte Entzündung und Wechselwirkungen zwischen malignen HSCs und die stromale Mikroumgebung des BM andere Mechanismen beteiligt sind. Diese Mechanismen bleiben jedoch schlecht verstanden. Die breite klinische und biologische Heterogenität der MDS macht die Diagnose und die Wahl der optimalen Therapie zu einer Herausforderung. In den letzten zehn Jahren mehrere Studien haben gezeigt, dass MFC oft mehr empfindlich bei der Aufdeckung von Dysplasie² als Morphologie, aber technische und wirtschaftliche Abhängigkeiten erschweren diese Technik zu standardisieren, mit Ergebnissen oft abhängig von der Erfahrung der Dolmetscher³. Darüber hinaus ist unklar, wie MFC kann Zünglein an der Waage in Richtung MDS in Fällen mit oder ohne minimale morphologische Dysplasie und fehlender zytogenetischer Anomalien oder in Grenzfällen wie Hypocellular MDS, mit einer niedrigen Explosion zählen, von anderen nicht-klonale BM Störungen wie Knochenmarkdepression (i.e., aplastische Anämie). Es bleibt auch schwierige Grenzfälle des MDS mit einem Überschuss von Blasten von akuter myeloischer Leukämie (AML) zu unterscheiden. Aus all diesen Gründen integrieren MFC Tests in die endgültige Diagnose MDS nicht die klinischen Leitlinien. Im Jahr 2011 empfohlen die US nationale umfassende Krebs Network (NCCN) MFC für die Schätzung von den Prozentsatz von CD34 + Zellen, Erkennung von paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie Klone und Vorhandensein von zytotoxischen T-Zell-Klone in Hypocellular MDB-⁵. Diesen beiden letzteren Fällen beinhalten auch ein therapeutisches Ziel, da klinische Daten haben eine gute Reaktion der Patienten auf immunsuppressive Therapie⁶gezeigt. Die 2017 NCCN-Richtlinien, unter Berufung auf die internationalen arbeiten Group (IWG) Empfehlungen aufgeführt aberranten Immunphänotypisierung Erkennung von MFC zu den KO Kriterien für MDS-Diagnose, ohne jedoch irgendwelche Spezifikationen-⁶. Außerdem legt die kürzlich veröffentlichte WHO-Klassifikation, dass MFC Erkenntnisse allein nicht ausreichen, Primärdiagnose von MDS bei fehlender schlüssigen morphologischen und/oder zytogenetische Daten⁷zu etablieren. MFC ist jedoch als ein zusätzlicher Test zeigt die Dysregulation der myeloischen Zellen Reifung Muster und Quantifizierung den "Abstand von" normal "" für einen Patienten zu einem bestimmten Zeitpunkt im Krankheitsverlauf einsetzbar.

Diese Methode ist anwendbar bei klinischen Labors interessiert bei der Bewertung der Dysplasie bei BM myeloische Zellen unter Verwendung von MFC Immunphänotypisierung, um die Diagnose MDS oder anderen myeloischen Erkrankungen mit dysplastischen Anomalien zu verfeinern.

Protokoll

Die unten aufgeführten Protokoll genehmigt wurde, durch das "Comité de Protection des Personnes" (unabhängigen Ethik-Kommission) Sud-Est 1 aus Universität Krankenhaus Saint-Etienne, Frankreich.

(1) Cytometer Einstellungen

Hinweis: Die Cytometer Einstellungen erfolgten nach Frankreich fließen Empfehlungen nach EuroFlow Verfahren "EuroFlow Standard Operating Protocol (SOP) für Inbetriebnahme und Entschädigung (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).

1. Monatliche Inbetriebnahme
   1. Schalten Sie die Cytometer. Sicherstellen Sie, dass alle Flüssigkeitsstände angemessen und offene Diva 6.1.3. Fluidics Neustart durchführen: Wählen Sie in der Menüleiste ' Cytometer | Fluidics Startup'. Klicken Sie auf "OK" , wenn Sie dazu aufgefordert werden. Lassen Sie Cytometer mindestens 30 min. warmlaufen.
   2. Performance-Check - CST-Perlen
      Hinweis: Für diesen Schritt bereiten Sie 12 75 mm Polystyrol Rohr, CST-Perlen und Scheide Flüssigkeit (siehe Tabelle der Materialien vor).
      1. Beschriften Sie ein 12 x 75 mm² Polystyrol Rohr "CST'. Mischen Sie das mitgelieferte Wulst Fläschchen durch sanfte Umkehrung oder sehr sanft aufschütteln. Hinzufügen der beschrifteten Röhre: 0,35 mL Scheide Flüssigkeit und 1 Tropfen der CST-Perlen. Wirbel die Röhre vorsichtig und gehen Sie zum Erwerb. Speichern Sie das Rohr für bis zu 8 h bei 2-25 ° C im Dunkeln, wenn nicht sofort erwerben.
      2. Die Performance-Check durchführen: Wählen Sie in der Menüleiste ' Cytometer | CST'.
      3. Im Register "Setup" des Moduls CST: Canto II wie in der Standard-4-2 H-2V-Konfiguration zu bestätigen und auch bestätigen, dass Basispläne mithilfe der aktuellen Menge CST Perlen erstellt für diese Konfiguration vorhanden ist. Wenn eine Basislinie nicht vorhanden ist, beziehen sich auf die CST Perlen IFU. Bestätigen Sie, dass diese Grundwerte nicht abgelaufen ist: Wählen Sie unter "Setup-Control", "Performance überprüfen" aus dem Dropdown-Menü.
      4. Überprüfen Sie "Schlauch manuell laden" und klicken Sie auf "Ausführen". Bestätigen Sie die Lot-Nummer angezeigt. Sanft Wirbel die verdünnten Perlen bereit oben und wenn Sie aufgefordert werden, laden Sie die verdünnten Perlen und klicken Sie auf "OK".
      5. Wenn die Leistungsprüfung abgeschlossen ist, überprüfen Sie, ob Cytometer Performance durchlaufen. Klicken Sie auf "Bericht anzeigen". Führen Sie die Performance-Check erneut aus, wenn die Ergebnisse nicht bestanden haben. Speichern Sie den Bericht im PDF-Format mit dem Vorstellungstermin Tracking-Bericht.
   3. Stellen Sie "Fluoreszierende PMT Spannungen" mit Regenbogen Perlen (Table of Materials).
      Hinweis: Die Zielwerte sind in Euroflow Standard Operating Procedure (SOP) unter dem Titel "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads" festgelegt. Diese SOP zur Verfügung Euroflow (Www.euroflow.org; im öffentlichen Bereich; Registerkarte "Protokolle").
      1. Erstellen Sie ein neues Experiment über "monatliche Instrument Einstellungsdatum | Probe ".
      2. ", wählen Sie die optischen Parameter und Fluorochromes Rohre (FITC, PE, PerCPCy5.5, PE-Cy7, APC, APC-H7, V450, V500) entspricht, und überprüfen Sie die gewünschte Aufnahmeparameter (Log, A, H und / oder W). Wenden Sie aktuelle CST-Einstellungen (Klicken Sie rechts auf "Cytometer Einstellungen" des Experiments an). Setzen Sie den Schwellenwert für FSC-Parameter bei 10.000.
      3. Deaktivieren Sie auf die Cytometer Entschädigung beim Einstellung Fluoreszenz PMT Spannungen für Target MFI Einstellung; zu diesem Zweck gehen in die "Inspektor", navigieren Sie zu der "Ausgleich" -tab. deaktivieren Entschädigung durch deaktivieren "aktivieren Ausgleichs" Option.
      4. Erstellen Sie ein Arbeitsblatt "Target MFI" mit allen notwendigen Punkt plottet (n = 2; FSC gegen SSC, FITC gegen PE), Histogramme (n = 8; ein Histogramm für jeden Fluoreszenz-Detektor) und Statistik zeigt die Referenz Spitzenwerte (MFI und CV) für jeden Kanal Fluoreszenz.
      5. 1 Tropfen der 8-Gipfel Regenbogen Perlen Kalibrierung Partikel in 1 mL destilliertem Wasser und Vortex vor Gebrauch zu verdünnen. Erwerben Sie, ohne Aufzeichnungslösung der 8-Gipfel Regenbogen Perlen auf "LOW" Durchfluss. Speichern Sie das Rohr für bis zu 8 h bei 2-25 ° c im Dunkeln, wenn nicht sofort erwerben.
      6. Tor Singulett Perlen "Bevölkerung P1" in der FSC gegen SSC bivariate Dot-Plot und die 8. oder 7. Peak in der IRB im Vergleich zu PE-bivariate Dot-Plot (den hellsten Gipfel oder die nächste nach unten, wie sie in der Euroflow Dokument mit dem Titel "20180302_7th_ vorgesehen ist Peak_Target_Values_Rainbow_Beads") und dieses Tor Bevölkerung P2 zu nennen.
      7. Weiterhin die Übernahme der 8-Peaks Regenbogen Perlen Suspension und passen Sie PMT Spannungen in allen Kanälen der Fluoreszenz, MFI Zielwerte nach Euroflow Dokument "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads" zu erreichen.
      8. Wenn Ziel MFI-Werte für das 8. oder 7. Peak erreicht werden, Aufzeichnen der Ziel-MFI erreicht und den entsprechenden Endwerte PMT. Notieren Sie die Daten und erwerben Sie 5.000 Veranstaltungen.
         Hinweis: Dass PMT muss Werte werden unten im Schritt 1.2.3 (Performance Check - Bestätigung der PMT Werte mit Regenbogen Perlen) verwendet.
      9. Notieren Sie diese Werte, so dass einen Print screen mit Arbeitsblatt ' Target MFI' und Instrument-Einstellungen und speichern als jpg-Bild.
         Hinweis: Wenn eine "Neue" Rohr erstellt wird, variieren manchmal die PMT-Werte unerwartet. Hierzu ist es unerlässlich, eine doppelte Überprüfung der PMT. Vergleichen Sie jedes Mal die PMT-Werte auf Ihre Notizen, überprüfen Sie, dass ' Target MFI' und PMT Werte richtig sind!
      10. Speichern Sie die "Anwendungseinstellungen". Im Browser mit der rechten Maustaste auf "Cytometer Einstellungen". Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü "Einstellungen", und speichern. Klicken Sie auf "OK". Wenn Sie aufgefordert werden, klicken Sie auf Ja, um die Grenzwerte zu halten.
          Hinweis: Speichern Sie die Anwendungseinstellungen unter dem Standardnamen. Umbenennen Sie die Einstellungen nicht.
   4. Passen Sie die "FCS" und "SSC Spannungen" mit lysierten gewaschenen Blut (LWB).
      Hinweis: Für diesen Schritt 50 µL einer peripheren Blutprobe (PB) von einem gesunden Freiwilligen, Lysiereinrichtung Lösung (Table of Materials) und waschen Puffer werden benötigt.
      1. Mehrkanalpipette 50 µL der PB in ein Rohr. 2 mL frisch verdünnte Lysiereinrichtung Lösung hinzugeben. Vorsichtig mischen und 10 min bei RT inkubieren
      2. Zentrifuge für 5 min bei 540 X g.
      3. Aspirieren Sie überstand, ohne die Zelle Pellet, verlassen etwa 50 µL Restvolumen in der Röhre zu stören. Mischen Sie vorsichtig und 2 mL gefilterte Waschlösung.
      4. Zentrifuge für 5 min bei 540 X g.
      5. Wiederholen Sie noch einmal die Schritte 1.1.4.3–1.1.4.4.
      6. Fügen Sie 250 µL Puffer gefilterte waschen und mischen Sie vorsichtig.
      7. Im Experiment erstellt für Regenbogen Perlen Erwerb, erstellen Sie eine neue "Probe | Neues Arbeitsblatt ': zeichnen Sie ein Bi-parametrische SSC-A / FSC-A-Diagramm.
      8. Erwerben Sie die Zellen, Tor die Lymphozyten im FSC gegen SSC bivariate Dot-Plot und passen Sie FSC und SSC Spannungen um die folgenden mittleren Zielwerte für die gated Lymphozytenpopulation erreichen: FSC: 55.000 (Bereich 50.000-60.000) und SSC: 13.000 (Bereich 11.000 –15,000).
      9. Erwerben Sie und notieren Sie die Daten mit ca. 10.000 Veranstaltungen. Überprüfen Sie die mittlere FSC und SSC Zielwerte für nichtöffentliche Lymphozyten. Nachjustieren Sie FSC und SSC Spannung.
      10. Bildschirm drucken und Speichern des Druck der Kanal Zielwerte, die abgerufen werden.
   5. Fluoreszenz Kompensation Einstellungen.
      Hinweis: Die Single-gefärbten Entschädigung Steuerelemente müssen festgelegt werden, nach dem Ziel MFI-Einstellungen und FSC/SSC-Einstellungen eingerichtet. Für diesen Schritt eine PB von gesunder Freiwilliger Entschädigung Partikel (Table of Materials), Lyse Lösung und Waschpuffer benötigt. Die Fluorochrom-konjugierten Antikörpern Reagenzien verwendet, um die Fluoreszenz Kompensation Matrizen und ihre Referenz-Populationen sind aufgeführt in der Tabelle 1.
      1. Beschriften Sie eine Röhre pro Reagens verwendet werden, bei der Einrichtung von Fluoreszenz Kompensation (FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, V450, V500, PECy7 - CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 und APC-H7 - CD71) und ein "Blank/unbefleckt" Rohr.
      2. Pipettieren 50 µL der PB in jedem Rohr oder 1 Tropfen der "negativen" Entschädigung Partikel + 1 Tropfen der "positiven" Entschädigung Partikel in die Entschädigung Kontrollröhrchen oben in Tabelle 1angegeben.
      3. Fügen Sie entsprechende Menge der Antikörper-Reagenz auf das Rohr. Fügen Sie gefilterte waschen Puffer zu einem Endvolumen von 100 µL pro Röhre erreichen und vorsichtig mischen. Inkubieren Sie für 15 min bei RT, vor Licht geschützt werden.
      4. 2 mL frisch verdünnte Lysiereinrichtung Lösung nur in den Röhren mit den Zellen hinzufügen und vorsichtig mischen. Inkubieren Sie für 10 min bei RT, vor Licht geschützt werden.
      5. Zentrifuge für 5 min bei 540 X g.
      6. Aspirieren Sie überstand, ohne die Zelle Pellet verlassen etwa 50 µL Restvolumen in jedem Röhrchen zu stören. Mischen Sie vorsichtig. 2 mL Puffer gefilterte waschen hinzugeben.
      7. Zentrifugieren Sie 5 min bei 540 X g.
      8. Aspirieren Sie überstand, ohne die Zelle Pellet verlassen etwa 50 µL Restvolumen in jedem Röhrchen zu stören. Fügen Sie gefilterte waschen Puffer zu einem Endvolumen von 250 µL pro Röhre erreichen und vorsichtig mischen.
      9. Ersatz-Steuerelemente zu erstellen.
         1. Wählen Sie aus der Menüleiste Experiment für Regenbogen Perlen Erwerb erstellt. Erstellen Sie eine neue "Probe | Ersatz-Setup | Ersatz-Steuerelemente erstellen.
         2. Wählen Sie in dem daraufhin angezeigten Dialogfeld das Kontrollkästchen "Include separate ungefärbten Steuerung Rohr/gut" . Generischen (nicht-Label-spezifisch) Entschädigung Steuerelemente für FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, HV450, HV500 zu erstellen. Erstellen Sie Label-spezifische Vergütung Steuerelemente für PE-Cy7-CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 und APC-H7 - CD71. Klicken Sie auf "OK".
         3. Erstellen Sie in einem neuen Arbeitsblatt ein Bi-parametrische SSC-A / FSC-A-Diagramm und zeichnen Sie ein Tor auf Lymphozyten (P1) und das Histogramm Fluorochrom, das wird in jedem Röhrchen erkannt und ziehen ein P2-Tor für die positive Spitze entspricht. Zeigen Sie die Hierarchie (rechter Mausklick auf ein Diagramm und wählen Sie "zeigen Bevölkerung Hierarchie") um die Anzahl der Ereignisse in P2, mit Ausnahme der ungefärbten Kontrollröhrchen zu visualisieren.
         4. Erweitern Sie im Browser die Entschädigung Steuerelemente Probe.
         5. Vortex ungefärbten Zellen, vorbereitet oben, S. 3 – 5 installieren bereiten ungefärbten Zellen auf die Cytometer. Passen Sie die Durchflussmenge "Medium" und klicken Sie auf "Daten zu erwerben". Passen Sie in der FSC-A Vs SSC-A Dot-Plot das P1 Tor um die Lymphozytenpopulation vollständig umgibt. Mit der rechten Maustaste auf die P1-Tor. Wählen Sie "Auf jegliche Entschädigung Kontrolle anwenden".
         6. Aus dem "Erwerb" -Armaturenbrett, klicken Sie auf "Record-Daten" 5.000 Veranstaltungen erwerben. Sicherzustellen Sie für alle die einfarbig gebeizt Kontrollzellen, dass die P2-Intervall-Tor die positiven Bevölkerung umfasst.
         7. Für die PE-Cy7 und APCH7 Rohre das Histogramm ein P3 Intervall Tor hinzu und sicherzustellen Sie, dass es negative Bevölkerung umfasst und die P2 die positiven Bevölkerung umfasst.
         8. Entschädigung zu berechnen. Wählen Sie aus der Menüleiste "Experiment | Ersatz-Setup | Entschädigung zu berechnen '. Die Entschädigung-Matrix zu nennen: "Entschädigungen Datum". Wählen Sie "Link und speichern".
         9. Die Vergütungsmatrix in den Anwendungseinstellungen Katalog zu speichern: Klicken Sie auf "Cytometer Einstellungen | Anwendungseinstellungen | Speichern ', Vergütungsmatrix 'Entschädigung Datum' zu nennen, und klicken Sie auf "OK".
         10. Klicken Sie im Browser auf "Cytometer-Einstellungen". Navigieren Sie im Inspektor in die "Entschädigung" Registerkarte klicken Sie auf Print in der unteren rechten Ecke.
             Hinweis: Diese Informationen kann auch aus dem Katalog abgerufen werden.
         11. Kontrolle der Entschädigung Matrix.
             1. Mischen in eine Röhre die einzige gefärbte Röhre (APCH7 Wahl).
             2. Erstellen Sie ein neues Experiment namens "Entschädigung Überprüfungsdatum", neue Probe hinzufügen, klicken Sie rechts auf die "Cytometer Einstellungen" dieses Experiments und Wählen Sie "Link | Unlink | Anwendungseinstellung " im Schritt 1.1.3.10 gespeichert. Erwerben Sie 50.000 Veranstaltungen aus diesem Röhrchen mit den neuen Einstellungen.
             3. Ein neues globales Arbeitsblatt anwenden. 1 Dot-Plot FSC-A/SSC-A erstellen und zeichnen Sie ein Tor um die Lymphozyten zu visualisieren und n x (n-1) / 2 weitere Grundstücke konzentrierte sich auf die Lymphozyten-Tor, zwei Mal zwei Parameter zu visualisieren.
2. Tägliche Inbetriebnahme
   1. Schalten Sie die Cytometer. Sicherstellen Sie, dass alle Flüssigkeitsstände angemessen und offene Diva 6.1.3. Fluidics Neustart durchführen: Wählen Sie in der Menüleiste ' Cytometer | Fluidics Startup'. Klicken Sie auf "OK" , wenn Sie dazu aufgefordert werden. Lassen Sie Cytometer mindestens 30 min. warmlaufen.
   2. Performance-Check - CST Perlen: wiederholen Sie die Schritte 1.1.2.1–1.1.2.5.
   3. Performance-Check - Bestätigung der PMT-Werte mit Regenbogen Perlen.
      1. Beschriften Sie ein Polystyrol Rohr als "Regenbogen Perlen" und überprüfen Sie, dass die Chargennummer der gebräuchlich ist. Mischen Sie das Regenbogen-Bead-Fläschchen. Bereiten Sie die Rainbow-Perlen, Tropfen Sie 1 Regenbogen Perlen auf 1 mL entionisiertem oder destilliertem Wasser. Vor Licht schützen.
         Hinweis: Gehen Sie zum Erwerb oder lagern Sie das Rohr auf 2-8 ˚C bis zum Erwerb.
      2. Erstellen eines neuen Experiments: "Regenbogen Perlen Datum".
      3. Die Entschädigungen zu verknüpfen: Rechtsklick auf "Cytometer Einstellungen", wählen Sie "Link-Setup", wählen Sie die angemessene Entschädigung Matrix erstellt in Schritt 1.1.5.9.9 und wählen Sie "Überschreiben".
      4. Unlink Entschädigung: Rechtsklick auf "Cytometer Einstellungen", wählen Sie "Verknüpfung aufheben aus dem zuvor verknüpfte Setup" und klicken Sie auf "OK".
      5. "Anwendungseinstellungen"gelten: Rechtsklick auf "Cytometer Einstellungen", wählen Sie "Anwendungseinstellungen", übernehmen Sie die Einstellung im Schritt 1.1.3.10 während der monatlichen Setup erstellt und "halten die Korrekturwert".
      6. Deaktivieren Sie die Option "Enable Entschädigung".
      7. Erstellen Sie eine neue Probe in das Experiment mit Arbeitsblattvorlage für Regenbogen Perlen. Erwerben Sie das Rohr in der Übernahme von "Niedrig" .
      8. Während der Erwerb von Perlen passen Sie das P1 Tor um nur den Singulett-Perlenpopulation erweitert. Einstellen Sie die P2-Luftklappe auf der FITC-A / PE-A Dot-Plot sollen nur der Singulett-Perlenpopulation. 10.000 Ereignisse aufzeichnen.
      9. Überprüfen Sie, dass die MFI und der CV-Werte, die für P2 Bevölkerung in den vordefinierten Zielen des Protokolls sind. Andernfalls waschen Sie die Cytometer und starten Sie den Vorgang erneut. Speichern Sie den Bericht als PDF-Format.

2. BM Probenvorbereitung

Hinweis: Führen Sie die Zelle waschen Protokoll kurz vor dem Färbeverfahren.

1. 600 µL Einzelprobe in ein Zentrifugenröhrchen 15 mL Pipette.
2. Fügen Sie 10 mL Waschpuffer (PBS + 0,5 % BSA [> 98 % reine BSA] + 0,09 % NaN₃ gefiltert Lösung, pH 7.4). Mischen Sie gut mit einer Pipette Zellsuspension.
3. Zentrifuge für 5 min bei 540 X g (Wash 1). Den Überstand ohne zu stören die Zelle Pellet zu verwerfen.
4. Wiederholen Sie die Schritte 2.2-2.3 (waschen, 2).
5. Unterbrechen Sie die Zelle Pellet in 400 µL Waschpuffer.
6. Färbung des Rückgrat Marker. Übertragen Sie das gesamte Volumen der Rückgrat Antikörper auf ein Polypropylen Rohr für FACS-Analyse identifiziert die Patientendaten und das "Rückgrat". Fügen Sie 350 µL Probe gewaschen (das Volumen der gewaschenen Probe erforderlich, um die Rohre auf dem Panel zu füllen). Mischen Sie gut mit einer Pipette.
   Hinweis: Berechnen Sie das Gesamtvolumen der Rückgrat Antikörper zur Oberfläche Membran Färbung (siehe Tabelle 2).
7. Gleiche Mengen von der Probe-Backbone-Mix in 3 Polypropylenröhrchen für FACS Analyse identifiziert mit den Patientendaten und "Rohr Nummer 1" Pipette "Rohr Nummer 3". Verwenden Sie ggf. Waschen Puffer um zu einem Endvolumen von 200 µL pro Röhre zu erreichen.
   Achtung: Achten Sie darauf, keine Spuren der Probe an den Wänden der Rohre zu hinterlassen; Andernfalls werden diese Zellen nicht befleckt werden. Falls erforderlich, Wirbel der Zellen und die Zentrifuge der Röhre.
8. Fügen Sie in jedem Röhrchen das entsprechende Volumen der Antikörper gegen Oberflächenmarker Zelle (mit Ausnahme der Rückgrat-Marker), als gemäß Tabelle 2. Mischen Sie gut mit einer Pipette. Inkubieren Sie für 30 min bei RT vor Licht geschützt werden.
9. Hinzugeben Sie 2 mL Lyse Lösung. Mischen Sie gut mit einer Pipette. Inkubieren Sie für 10 min bei RT vor Licht geschützt werden.
10. Zentrifuge für 5 min bei 540 X g. Den Überstand ohne zu stören die Zelle Pellet, verlassen etwa 50 µL Restvolumen in jedem Röhrchen zu verwerfen. Mischen Sie gut mit einer Pipette.
11. Hinzugeben Sie 2 mL Waschpuffer zum Zelle Pellet. Mischen Sie gut mit einer Pipette.
12. Wiederholen Sie die Schritte 2.10 – 2.11 (waschen, 2).
13. Zentrifuge für 5 min bei 540 X g. Den Überstand ohne zu stören die Zelle Pellet verwerfen und erneut aussetzen der Zelle Pellet in 200 µL PBS. Mischen Sie gut mit einer Pipette.
14. Erwerben Sie die Zellen, vorzugsweise sofort nach dem Färben oder Lagerung bei 4 ° C, lichtgeschützt, nicht mehr als 1 h bis in das Durchflusszytometer gemessen.

3. Datenerfassung

1. Öffnen Sie ein neues Experiment in Diva Software und benennen sie nach Name, Art der Probe und das Datum.
2. Erstellen Sie eine neue Probe mit 3 Röhren. Geben Sie in das Experiment Layout die Antikörper in jedem Röhrchen verwendet.
3. Klicken Sie rechts auf die "Cytometer Einstellungen"und wählen Sie "Anwendungseinstellungen" gelten Sie die Werte, die in monatlichen Setup (Schritt 1.1.3.10).
4. Ein neues globales Arbeitsblatt öffnen und erstellen Sie den Punkt plottet: SSC-A / FSC-A, SSC-A / CD45-HV500-A, SSC-A / FITC-A, SSC-A / PE-A, SSC-A / CD34-PerCP-Cy5.5, SSC-A / CD117-PECy7-A, SSC-A / APC-A, SSC-A / APCH7-A, SSC-A / HLA-DR-HV450-A. Erstellen Sie in der SSC-A/FSC-A-Dot-Plot ein Tor um Singulett Zellen auszuwählen. In der SSC-A/CD45-BV500-A-Dot-Plot erstellen Tore um 4 Populationen auszuwählen: Granulozyten, Monozyten, Explosionen und Lymphozyten. Diese Populationen in den Punkt-Parzellen, die zuvor erstellte Projekt.
5. Erstellen Sie ein neues globales Arbeitsblatt zur Entschädigung Steuerung, wie in Schritt 1.1.5.9.11.3 beschrieben.
6. Erwerben Sie das Rohr in "MEDIUM" Erfassung und Aufzeichnung 500.000 Veranstaltungen/Schlauch. Exportieren Sie nach technische Prüfung (Bewertung der Entschädigung und die richtige Färbung) die Daten als FCS3.0 Dateien.

(4) Datenanalyse

Hinweis: Um die normalen BM-Datenbanken konstruieren verwendete Dateien von gesunden Spendern und von den Einzelpersonen ohne Beweise für eine hämatopoetische Krankheit waren wie folgt 11 von 18 Dateien für die Neutrophils_NM-Datenbank, 10 von 18 Dateien für Monocytes_NM Datenbank und 14 von 18 Dateien für NRC_NM-Datenbank. Die Dateien verworfen zeigte verschiedene technische Probleme, wie im Abschnitt Vertreter Ergebnisse präsentiert. Die Dateien wurden einzeln analysiert mit Hilfe der Infinicyt Software (Table of Materials), Anpassung an die verschiedenen Strategien, dargestellt in Abbildung 1A(1-3) für die Neutrophilen Abstammung (Profil Neutrophils_Maturation.inp), Abbildung 2 A Monocyte Abstammung (Profil Monocytes_Maturation.inp) und Abbildung 3A(1-2) für erythroiden Zelle Abstammung (Profil NRC_Maturation.inp).

1. Strategie der Analyse für Neutrophile -Neutrophils_NM-Datenbank-Bau 
   1. CD34 + Neutrophilen begangen Blasten mit einer Kreuzung von sieben Toren, so dass die Auswahl von CD34 + CD117 + HLADR + niedrige CD10 - CD13 + CD11b-Events (Abbildung 1a. 1) zu identifizieren. Ordnen Sie diese Ereignisse zur Registerkarte "Neutrophilen" in der Bevölkerung Hierarchiestruktur und deaktivieren Sie danach diese Registerkarte um diese Zellen (in blau dargestellt) entfernen aus der Anzeige der verbleibenden Veranstaltungen (grau).
   2. Isolieren Sie der CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + niedrige Neutrophilen Vorstufen mit einer Kreuzung von sechs Toren, wie in Abbildung 1A(2) dargestellt und weisen sie zur Registerkarte "Neutrophilen" .
   3. Mehr Reife Neutrophile mit einer Kreuzung der vier Tore, so dass für die Unterscheidung von CD45dim SSCint-Hallo CD117-HLADR-Zellen und deren Zuordnung zur Registerkarte "Neutrophilen" zu identifizieren.
   4. Deaktivieren Sie die restlichen Ereignisse, halten nur die Neutrophilen sichtbar, dann exportieren dieser Population durch Anklicken "Datei | Export " und überprüfen, ob alle erforderlichen Parameter geprüft werden und die Daten als FCS-Dateien speichern.
   5. Führen Sie in einer zusammengeführten Datei bestehend aus allen exportierten FCS-Dateien einen Qualitäts-Check durch die Intensität des Ausdrucks der Marker für jedes Subpopulation auswerten. Mit APS Parzellen mit Mittelstreifen für jede Datei und SD-Kurven für jeden Subpopulation gezeigt, entfernen Sie die Fälle außerhalb der 2SD Kurven (siehe Details im Abschnitt Vertreter Ergebnisse) (Abbildung 1B).
   6. Zeichnen Sie in der resultierenden aus Datei mit "Neutrophile" sichtbar den Weg der Reifung auf ein APS-Diagramm (Abbildung 1C links) und als .cyt-Datei zu speichern.
      Hinweis: Ein Vergleich Reifung Diagramm ermöglicht die Visualisierung aller Parameter von alle Dateien in der Neutrophils_NM-Datenbank für die normalisierte Datenbank vertreten. Das Diagramm in Abbildung 2C, rechts, präsentiert zeigt, dass alle Dateien in der Neutrophils_NM-Datenbank enthalten (n = 11) passen 2 SD Median der Gruppe gegenüber.
2. Strategie der Analyse für Monozyten - Monocytes_NM Datenbank Bau
   1. Die Linie monozytären Zellen zu identifizieren (CD117 + / CD64 + Hallo HLADR + Hallo) mit einer Kreuzung von vier Toren (Abb. 2A). Ordnen Sie diese Ereignisse zur Registerkarte "Monocytic" in der Bevölkerung Hierarchiestruktur.
   2. Deaktivieren Sie die restlichen Ereignisse, halten nur die monozytären Zellen sichtbar, dann exportieren dieser Population durch Anklicken "Datei | Export " und überprüfen, ob alle erforderlichen Parameter geprüft werden und die Daten als FCS-Dateien speichern.
   3. In einer zusammengeführten Datei bestehend aus allen exportierten FCS-Dateien, ausführen eine Qualitätsprüfung durch die Intensität des Ausdrucks der Marker für jedes Subpopulation auswerten, dann entfernen Sie die Fälle außerhalb der 2SD Kurven (Einzelheiten im Abschnitt "Vertreter Ergebnisse") (Abbildung 2 ( B).
   4. Zeichnen Sie in der resultierenden Datei mit "Monocytic" Zellen sichtbar den Weg der Reifung auf dem APS-Diagramm (Abbildung 2C links) und speichern Sie diese als .cyt-Datei.
      Hinweis: Ein Vergleich Reifung Diagramm ermöglicht die Visualisierung aller Parameter von alle Dateien in der Monocytes_NM-Datenbank für die normalisierte Datenbank vertreten. Das Diagramm in Abbildung 2C, rechts, präsentiert zeigt, dass alle Dateien in der Monocytes_NM-Datenbank enthalten (n = 10) passen 2 SD im Vergleich mit der Median der Gruppe.
3. Strategie der Analyse für kernhaltigen Erythrozyten (NRCs) - NRC_NM-Datenbank-Bau
   1. CD34 + erythroiden begangen Blasten mit einer Kreuzung von sieben Tore, die es die Auswahl von CD34 + CD117 + HLADR + niedrige CD105 + CD33 - CD36 + CD71 + Events (Abbildung 3A(1) ermöglichen) zu identifizieren. Ordnen Sie diese Ereignisse zur Registerkarte "NRC" in der Bevölkerung Hierarchiestruktur und deaktivieren Sie dann diese Registerkarte um diese Zellen (rot dargestellt) zu entfernen aus der Anzeige der verbleibenden Veranstaltungen (grau).
   2. Identifizieren Sie reifer NRCs mit einer Kreuzung der vier Tore, mit denen die Diskriminierung von CD45-/ + dim SSClow CD36 + Hallo CD71 + Hallo CD105 + /-Zellen. Ordnen Sie diese Ereignisse zur Registerkarte "NRC" (Abbildung 3A(2)). Die Thrombozyten (CD36 + Hallo SSClow Zellen) der NRC-Bevölkerung (Abbildung 3A(2)) entleert werden.
   3. Deaktivieren Sie die restlichen Ereignisse, halten nur die NRC Zellen sichtbar, dann exportieren dieser Population durch Anklicken "Datei | Export " und überprüfen, ob alle erforderlichen Parameter geprüft werden und die Daten als FCS-Dateien speichern.
   4. Führen Sie in einer zusammengeführten Datei bestehend aus allen exportierten FCS-Dateien einen Qualitäts-Check durch die Intensität des Ausdrucks der Marker für jedes Subpopulation, gefolgt von der Beseitigung der Fälle außerhalb der 2SD Kurven (Details siehe im Abschnitt "Vertreter Ergebnisse") (Auswertung Abbildung 3 ( B).
   5. Zeichnen Sie in der resultierenden Datei mit "NRC" Zellen sichtbar den Weg der Reifung auf dem APS-Diagramm (Abbildung 3C, links) und speichern Sie diese als .cyt-Datei.
      Hinweis: Ein Vergleich Reifung Diagramm ermöglicht die Visualisierung aller Parameter von alle Dateien in der NRC_NM-Datenbank für die normalisierte Datenbank vertreten. Das Diagramm in Abbildung 3C, rechts dargestellten zeigt, dass alle Dateien in der NRC_NM-Datenbank enthalten (n = 14) passen 2 SD Median der Gruppe gegenüber.
4. Bewertung der Reifung in BM myeloische Fächern der Reifung Datenbanken
   1. Öffnen Sie die .cyt-Datei entsprechend der Abstammung von Interesse (d. h.., Neutrophils_NM_GMFF.cyt für Neutrophilenzahl Abstammung, Monocytes_NM_GMFF.cyt für monozytären Abstammung und NRCs_NM_GMFF.cyt für erythroiden Abstammung).
   2. Mit der rechten Maustaste auf "Reifung" Registerkarte "unter der Registerkarte für die Abstammung von Interesse (" Neutrophile | Monozytären | NRC') und speichern Sie die Reifung zur Reifung-Datenbank.
   3. Öffnen Sie eine neue Datei FCS und Analysen durchführen, wie bereits erläutert (4.1.1–4.1.3 für Neutrophile, Schritt 4.2.1 für monozytären Zellen und einzeln 4.3.1–4.3.2 für NRC).
   4. Zeichnen Sie die Reifung Bahn für die Bevölkerung von Interesse.
   5. Öffnen Sie die entsprechende Datenbank in der Registerkarte "Tools" (Datenbank-Analyse) und vergleichen Sie die Bevölkerung mit den entsprechenden Reifung Datenbank analysiert werden. Überprüfen Sie die Daten für die Kompatibilität mit der verfügbaren Datenbank: komplette Kompatibilität (grünes Dreieck); teilweise Kompatibilität, in den meisten Fällen Abweichungen im Namen der Parameter (gelbes Dreieck); und Inkompatibilität (rotes Dreieck).
   6. Wenn die Daten kompatible oder teilweise kompatible sind, erstellt die Software das Diagramm "normalisiert Reifung Unterschiede" . Um visualisieren "Parameter Band Reifung Unterschiede", öffnen Sie ein neues Diagramm im "Diagramm" Registerkarte, klicken Sie auf "Reifung" und wählen wie viele Parameter angezeigt werden, klicken Sie auf erscheinen "OK" und im Diagramm. Mit der rechten Maustaste in das Diagramm; Visualisierung von Daten, Datenbank Visualisierung und Reifung Diagramm Visualisierung können Änderungen vorgenommen werden.
   7. Um die Bedeutung der Unterschiede zwischen der neuen Datei und in der Datenbank enthaltenen Daten zu visualisieren, konfigurieren Sie einen Zoom (mit der rechten Maustaste auf "normalisiert Reifung Unterschiede" und "Zoom"gelten).

Ergebnisse

Die 54 BM-Proben im K-EDTA Antikoagulans geerntet wurden in die Studie einbezogen. Die MFC-Daten wurden in Ermangelung von Informationen über die Patienten analysiert. Retrospektive Studie zeigte, dass die BM-Proben von 7 gesunden Spendern (5 Rüden und 2 Hündinnen mit einem Durchschnittsalter von 47,4 [35-48], 11 Personen ohne Anzeichen einer hämatopoetischen Krankheit (8 Männer und 3 Frauen mit einem Durchschnittsalter von 57,9 [35-72]) und 36 Fälle mit verschiedenen pathologische...

Diskussion

Die Qualität der BM Aspirat könnte auf das Endergebnis auswirken. Die Polopiryna der BM-Aspirat könnte die Verteilung der Zellen in verschiedenen Stadien der Reifung aufgrund des Fehlens von Vorfahren oder Vorstufen verfälschen. Normalisierung der BM Aspiraten für Polopiryna im Fluss durchflusszytometrischen Analyse kann helfen, wahrscheinlich einen Großteil Lyse Methode beschäftigt. Darüber hinaus sind die entscheidenden Schritte zur Bewertung von BM myeloische Dysplasie durch Durchflusszytometrie die Probe Vera...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCanto II flow-cytometer	BD Biosciences, CA, USA	SN: V33896301336	3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuge	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; Model No: 320002001	low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes
Pipetts of 10µL and 200µL
Pasteur pipettes
15 mL Falcon tubes
polypropylene tube for FACS
Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777	clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406	clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, CA, USA	333143	clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, CA, USA	641394	clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD33		345800	clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Lysing Solution 10x Concentrate (IVD)	BD Biosciences, CA, USA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS&T IVD beads	BD Biosciences, CA, USA	656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS	Cytognos, Salamanca, Spain	SPH-RCP-30-5A	lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
Phosphate buffered saline tablets	R&D Systems, Minneapolis, USA	5564
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, France	A9647
Sodium azide 99%	Sigma-Aldrich, France	199931
Infinicyt software version 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Spain