JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В отсутствие морфологические критерии или не информативный цитогенетика трудно диагноз MDS. MFC могут помочь уточнить процесс диагностики MDS. Чтобы стать полезным для клинической практики, анализ MFC должна основываться на параметры с достаточной специфичность и чувствительность, и данных, должна быть воспроизводимой между различными операторами.

Аннотация

Рабочая группа, начатый в рамках французской ассоциации цитометрии (АФК) был разработан для того, чтобы согласовать применение многопараметрических проточной цитометрии (MFC) для диагностики заболеваний миелоидного во Франции. Протокол, представленные здесь был согласованным и прикладной между сентября 2013 года и ноября 2015 года в шести французский диагностических лабораторий (больницы университета Сент-Этьен, Гренобль, Клермон-Ферран, Ницца и Лилль и Institut Паоли-Calmettes в Марсель) и стандартизации костного образец подготовки и сбора данных. Для нейтрофилов, monocytic и эритроидные линий с костного мозга от «здоровой» доноров лиц (лица без каких-либо доказательств кроветворных заболеваний) были разработаны три созревания баз данных. Надежный метод анализа для каждого миелоидного линии должны быть применимы для рутинной диагностики. Новых случаев можно проанализированы таким же образом и сравнивается обычных баз данных. Таким образом могут быть определены количественные и качественные фенотипические аномалии и те выше 2SD, по сравнению с данными нормального костного образцов следует рассматривать свидетельствует о патологии. Основным ограничением является выше изменчивость между данными, с помощью моноклональных антитела, полученные с методами на основе гибридомной технологии и в настоящее время используется в клинической диагностике. Установление критериев для технической проверки полученных данных может помочь повышению полезности MFC для диагностики MDS. Установление этих критериев требует анализа в базе данных. Сокращение следователь субъективности в анализе данных является важным преимуществом данного метода.

Введение

В отсутствие фенотипические маркеры для диспластических изменений, происходящих в миелоидных клеток во время посвящения MDS и прогрессии был предложен новый подход в последние годы на основе оценки путей созревания (измененное выражение Миелоидные антигенов в ходе производства зрелой миелоидных клеток) или ненормальные распределения различных типов клеток внутри костного мозга (БМ) клетки отсеков1,2.

Эта статья представляет новый метод для стандартизированных приложений MFC с целью обнаружения диспластических изменений в отсеках BM миелоидных клеток, связанных с миелодиспластические синдромы (MDS) или другие миелоидного гематологических заболеваний. Это исследование также показывает полезность использования созревания баз данных для анализа данных MFC.

Стандартизация процедуры подготовки образца, сбора данных и анализа с использованием базы данных позволит идентификации наиболее актуальных фенотипические патологий, связанных с диспластических изменений в BM миелоидных клеток. Таким образом для разработки стратегии анализа, который может использоваться в последующих анализа требуются статистически выбранных подмножеств, основанные на четко обозначенные и общепризнанным форматов (автоматический сепаратор населения (APS) диаграммы, гистограммы и точка участков) раундов. Открытие надежные фенотипические аномалии в MDS облегчит диагноз в случаях с или без минимальной морфологических дисплазии и цитогенетического aberrancies. Выявление дискриминационных параметров, позволяя для уменьшения иммунофенотипических панелей может упростить текущей оценки2, позволяя их применимость в лаборатории клинической патологии.

Этот метод ограничивает субъективной интерпретации данных цитометрии, как был подан сигнал в MDS диагноза3. Этот шаг является необходимым условием для разработки автоматизированных средств обработки и анализа потока данных4.

MDS включает в себя разнородную группу расстройств клоновых гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), в которых Сплайсосома мутации сотрудничать с конкретными эпигеномные модификаторы приносить фенотип MDS. Сейчас известно, что, наряду с HSC мутации, другие механизмы участвуют в MDS патофизиологии, например аберрантных иммунной опосредованного воспаление и взаимодействия между злокачественными СКК и стромы микроокружения BM. Однако эти механизмы по-прежнему не ясны. Широкой клинической и биологической неоднородности MDS делает диагностики и выбора оптимальной терапии вызов. В течение последнего десятилетия, несколько исследований показали, что MFC зачастую является более чувствительные для обнаружения дисплазии2 чем морфологии, но технические и экономические трудности делают эту технику трудно стандартизировать, с результатами часто в зависимости от опыт работы переводчиком3. Кроме того неясно, как MFC может склонить чашу весов к MDS в случаях с или без минимальной морфологических дисплазии и в отсутствие цитогенетических отклонений или в спорных случаях такие гипоклеточные MDS, с низким Доменная игр, от других не клоновых BM расстройств, таких как недостаточность костного мозга (т.е., апластическая анемия). Он также по-прежнему трудно дифференцировать пограничных случаев MDS с избытком взрывов от острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). По всем этим причинам клинические руководства не интегрировать MFC тестирования в MDS окончательный диагноз. В 2011 году США национальной всеобъемлющей рака сеть (NCCN) рекомендовал MFC для оценки доли CD34 + клеток, обнаружение клонов пароксизмальная Ночная гемоглобинурия и присутствие цитотоксических Т-клеток клонов в MDS гипоклеточные5. Эти две последние ситуации также включать терапевтической цели потому что клинических данных показали хорошую реакцию этих больных до6иммуносупрессивной терапии. 2017 NCCN Руководство, ссылаясь на рекомендации Международной рабочей группы (МРГ), перечисленные аберрантных Иммунофенотипирование обнаружения библиотекой MFC среди совместно критериев для MDS диагноз, но без внесения каких-либо характеристики6. Кроме того недавно опубликованном ВОЗ классификации гласит, что MFC выводы только не достаточно, чтобы установить первичный диагноз MDS в отсутствие убедительных морфологических и/или цитогенетических данных7. Однако MFC может использоваться как дополнительное испытание показаны dysregulation миелоидных клеток созревания шаблоны и количественного определения «расстояние от нормальных» для пациента в определенное время в течение заболевания.

Этот метод применим в клинических лабораториях заинтересован в оценке дисплазии в BM миелоидных клеток с помощью MFC иммунофенотипирование, для уточнения диагноза в MDS или других миелоидного расстройств с диспластические аномалии.

протокол

Перечисленные ниже протокол был одобрен «Comité de защиты des Personnes» (независимый Комитет по этике) 1 Sud Est с университет Больница Сент-Этьен, Франция.

1. цитометр параметры

Примечание: Параметры цитометр были выполнены согласно Франции потока рекомендации, в соответствии с EuroFlow процедура «операционной EuroFlow стандартный протокол (СОП) для установки инструмента и компенсации (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).

  1. Ежемесячный инструмент установки
    1. Включите цитометр. Обеспечить надлежащие и открытые дива 6.1.3 все уровни жидкости. Выполнять fluidics запуска: в строке меню выберите ' цитометр | Fluidics запуска '. Нажмите кнопку «OK» пробуждано. Разрешить цитометр теплый вверх для по крайней мере 30 мин.
    2. Проверка работоспособности - КНТ бусины
      Примечание: Для этого шага подготовки 12 75 мм пенополистирола трубки, КНТ бусы и оболочка жидкости (см. Таблицу материалы).
      1. Этикетка 12 x 75 мм2 полистирола трубки 'КНТ '. Смешайте предоставленный шарик флакона нежный инверсии или очень нежный vortexing. Добавить в обозначенные трубки: 0,35 мл жидкости оболочкой и 1 капля бисера КНТ. Вихревой трубе мягко и приступить к приобретению. Храните трубки для до 8 ч при температуре 2-25 ° C в темноте, если не приобретают сразу.
      2. Проверка производительности: в строке меню выберите ' цитометр | КНТ '.
      3. В закладке «Setup» модуля КНТ: подтвердить Canto II как в конфигурации по умолчанию 4-2 H-2V и также подтверждают, что базовые, созданные с помощью текущего лота КНТ бисера существует для этой конфигурации. Если базовый план не существует, обратитесь к IFU бусины КНТ. Убедитесь, что базовый уровень еще не истек: под «установки управления», выберите «проверить производительность» из раскрывающегося меню.
      4. Установите «Вручную загрузить трубки» и нажмите «Run». Подтвердите, отображается номер лота. Аккуратно водоворот разреженных бусины подготовлен выше и при запросе загрузки разреженных бусины и нажмите кнопку «OK».
      5. После завершения проверки производительности убедитесь, что выполнен цитометр производительности. Нажмите кнопку «Просмотр отчета». Повторно запустите проверку производительности, если результаты не проходят. Сохраните отчет в формате PDF с датой отчета отслеживания производительности.
    3. Настройка «Флуоресцентные ПЛТ напряжения» с Радуга бисера (Таблица материалов).
      Примечание: Целевые показатели предусмотрены в Euroflow стандартные оперативные процедуры (СОП) под названием «20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads». Данная СОП доступен на сайте Euroflow (www.euroflow.org; в зоне общественного пользования; Закладка Протоколы).
      1. Создайте новый эксперимент через ' ежемесячная дата установки инструмента | Образца '.
      2. ', выберите оптических параметров и флуорохромов, соответствующие трубы соответствующего (FITC, PE, PerCPCy5.5, пе-Cy7, APC, APC-H7, V450, V500) и проверьте параметры желаемого приобретения (журнал, A, H и / или W). Примените текущие параметры КНТ (щелкните правой кнопкой мыши на «цитометр настройки» эксперимента). Установите порог для параметра FSC на 10 000 человек.
      3. На цитометр отключите компенсации при установке флуоресценции ПЛТ напряжений для параметра Целевой МРИ; для этого перейдите в окне «Инспектор», перейдите к закладке «Компенсации» компенсации отключить, сняв флажок «включить компенсации» вариант.
      4. Создание листа «Цель МРИ» с все необходимые точки участков (n = 2; FSC по сравнению SSC, FITC против PE), гистограммы (n = 8; одна гистограмма для каждого детектор флуоресценции) и статистические данные, показывающие ссылка пиковые значения (МРИ и резюме) для каждого канала флуоресценции.
      5. Разбавьте 1 капля 8-пик Радуга бисера Калибровка частиц в 1 мл дистиллированной воды и вихревой перед использованием. Приобрести без записи 8-пик Радуга бисера в «Низкий» скорость потока. Храните трубки для до 8 ч в 2-25 ° c в темноте, если не приобретают сразу.
      6. Ворота синглетно бусы «населения P1» в FSC по сравнению SSC двумерных точка сюжет и 8 или 7 пик в FITC против построения двумерных точка PE (яркий пик или следующий вниз, как это предусмотрено в документе Euroflow, озаглавленном «20180302_7th_ Peak_Target_Values_Rainbow_Beads») и имя это ворота населения P2.
      7. Продолжить на приобретение 8-пики Радуга бисера подвеска и отрегулируйте ПЛТ напряжения во всех каналах флуоресценции для достижения целевых значений МФО согласно Euroflow документ «20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads».
      8. По достижении значения целевого МФО для 8 или 7 пик запись МФО цель достигнута и соответствующие окончательные значения ПЛТ. Приобрести 5000 событий и записи данных.
        Примечание: ПЛТ значения должны использоваться ниже в шаге 1.2.3 (производительности проверить - подтверждение ПЛТ значения с Радуга бисера).
      9. Запишите эти значения, делая печати экрана с настройками листа «Цель МРИ» и документа и сохранить как изображение .jpg.
        Примечание: При создании «Новой» трубки, иногда ПЛТ значения неожиданно. Для этого двойной проверки ПЛТ имеет важное значение. Сравните каждый раз ПЛТ значения к заметкам, дважды проверьте правильность ПЛТ и значения «Цель МРИ» !
      10. Сохраните в «Параметры приложения». В браузере щелкните правой кнопкой мыши на «цитометр настройки». Из раскрывающегося меню выберите «Параметры приложения»и сохранить. Нажмите кнопку «OK». При появлении запроса, нажмите кнопку Да, чтобы сохранить пороговые значения.
        Примечание: Сохраните параметры приложения, используя имя по умолчанию. НЕ изменяйте параметры.
    4. Отрегулируйте «FCS» и «SSC напряжения» кровью лизированных мытый (LWB).
      Примечание: Для этого шага необходимо 50 мкл пример периферической крови (PB) от здоровых добровольцев, лизировать решение (Таблица материалов) и Отмывающий буфер.
      1. Пипец 50 мкл PB в трубку. Добавьте 2 мл свежего разреженных лизировать раствора. Осторожно перемешать и проинкубируйте втечение 10 мин на RT.
      2. Центрифуги для 5 мин на 540 x g.
      3. Аспирационная супернатант не нарушая ячейки Пелле, оставив примерно 50 мкл остаточный объем в трубе. Осторожно перемешать и добавить 2 мл отфильтрованных промывочного раствора.
      4. Центрифуги для 5 мин на 540 x g.
      5. Повторите еще раз 1.1.4.3–1.1.4.4 шаги.
      6. 250 мкл отфильтрованных Отмывающий буфер и осторожно перемешать.
      7. В эксперименте, созданный для приобретения Радуга бисера, создайте новый ' образца | Новый лист ': нарисовать диаграмму Би параметрический SSC-A / FSC-A.
      8. Приобрести клетки, ворота лимфоцитов в FSC по сравнению SSC двумерных точка сюжет и отрегулировать FSC и SSC напряжений достичь следующие средние целевые показатели для населения закрытом лимфоцитов: FSC: 55,000 (диапазон 50 000 – 60 000) и SSC: 13000 (диапазон 11000 –15,000).
      9. Получать и записывать данные с около 10 000 событий. Проверьте означает FSC и SSC целевых значений для закрытого лимфоцитов. При необходимости, скорректировать FSC и SSC напряжения.
      10. Печать экрана и хранения печати значения целевого канала, которые получаются.
    5. Параметры компенсации флуоресценции.
      Примечание: Сингл окрашенных компенсации управления должен быть установлен после настройки целевого МФО и FSC/SSC параметры были установлены. Для этого шага, PB от здоровых добровольцев, компенсация частиц (Таблица материалов), необходимы лизировать решения и отмывающего буфера. Список флюрохром конъюгированных антител реагентов, используемых для настройки матрицы компенсации флуоресценции и их население ссылки, перечислены в таблице 1.
      1. Одна трубка реагент для использования в создании флуоресценции компенсации ярлык (FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, V450, V500, PECy7 - CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 и APC-H7 - CD71) и «пустой/незапятнанное» трубки.
      2. Накапайте 50 мкл PB в каждую пробирку или 1 каплю «негативный» компенсации частиц + 1 капля «позитивные» компенсации частиц в трубах управления компенсации, указанные в таблице 1.
      3. Добавьте соответствующее количество реагента антитела к трубе. Добавьте отфильтрованную Отмывающий буфер для достижения окончательный объем 100 мкл на трубку и осторожно перемешать. Инкубируйте 15 мин на RT, защищенном от света.
      4. Добавить 2 мл свежей разбавленного раствора лизировать только в трубах с клетками и осторожно перемешать. Проинкубируйте втечение 10 мин на RT, защищенном от света.
      5. Центрифуги для 5 мин на 540 x g.
      6. Аспирационная супернатант не нарушая ячейки Пелле, оставив примерно 50 мкл остаточный объем в каждой тюбике. Осторожно перемешать. Добавьте 2 мл отфильтрованных Отмывающий буфер.
      7. Центрифуга 5 мин на 540 x g.
      8. Аспирационная супернатант не нарушая ячейки Пелле, оставив примерно 50 мкл остаточный объем в каждой тюбике. Добавьте отфильтрованную Отмывающий буфер для достижения окончательный объем 250 мкл на трубку и осторожно перемешать.
      9. Создайте элементы управления компенсации.
        1. В строке меню выберите эксперимент, созданные для приобретения Радуга бисера. Создайте новый ' образца | Установки компенсации | Создайте элементы компенсации.
        2. В появившемся диалоговом установите флажок «включить отдельный неокрашенных управления трубка/хорошо» . Создайте универсальный (не ярлык специфические) компенсации элементов управления для FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, HV450, HV500. Создайте компенсации ярлык конкретных элементов для PE-Cy7-CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 и APC-H7 - CD71. Нажмите кнопку «OK».
        3. В новый лист создайте граф Би параметрический SSC-A / FSC-A и нарисуйте ворота на лимфоцитов (P1) и гистограммы соответствует флюрохром, которые будут обнаружены в каждой тюбике и нарисуйте P2 ворота для положительных пик. Отображение иерархии (правый клик на графике и выберите «Показать иерархию населения») для визуализации количество событий в P2, за исключением неокрашенных управления трубки.
        4. В браузере разверните элементы компенсации образца.
        5. Вихревой неокрашенных клетки, подготовлен выше, для 3 – 5 с. установку подготовленный неокрашенных клетки на цитометр. Отрегулируйте скорость потока к 'среднего ' и нажмите кнопку «получить данные». В заговоре против FSC-A SSC-А точка Отрегулируйте P1 ворота полностью охватить население лимфоцитов. Щелкните правой кнопкой мыши на ворота P1. Выберите «Применить к все компенсации управления».
        6. На панели управления «Приобретение» , нажмите кнопку 'запись данных ' приобрести 5000 событий. Для всех окрашенных управления одного цвета ячеек убедитесь, что ворота интервал P2 охватывает позитивные населения.
        7. Для PE-Cy7 и APCH7 труб добавить интервал ворота P3 гистограммы и убедитесь, что оно охватывает негативные населения, и что P2 охватывает позитивные населения.
        8. Расчет компенсации. В строке меню выберите ' эксперимент | Установки компенсации | Рассчитать компенсацию '. Имя матрицы компенсации: «Компенсаций Дата». Выберите «Ссылку и сохранить».
        9. Сохранить компенсации матрицы в настройках приложения каталог: нажмите на 'цитометр параметры | Параметры приложения | Сохранить ', имя компенсации матрицы «Компенсации Дата» и нажмите «OK».
        10. В браузере нажмите на «цитометр настройки». В инспекторе перейдите на вкладку «Компенсации» нажмите кнопку Печать в правом нижнем углу.
          Примечание: Эта информация также может быть проверено из каталога.
        11. Контроль компенсации матрицы.
          1. Смешайте в одной трубе все однотрубные окрашенных (APCH7 по выбору).
          2. Создайте новый эксперимент с именем «Компенсации контрольная дата», добавить новый образец, щелкните прямо на «цитометр настройки» этого эксперимента и выбрать ' ссылка | Разорвать связь | Параметр приложения ' сохранен на шаге 1.1.3.10. Приобрести 50000 событий от этой трубки с новыми параметрами.
          3. Применение нового глобального листа. Создайте 1 точка участок FSC-A/SSC-A и нарисуйте ворота для визуализации лимфоцитов и n x (n-1) / 2 других участков сосредоточена на лимфоциты ворота для визуализации по два параметры.
  2. Ежедневные инструмент установки
    1. Включите цитометр. Обеспечить надлежащие и открытые дива 6.1.3 все уровни жидкости. Выполнять fluidics запуска: в строке меню выберите ' цитометр | Fluidics запуска '. Нажмите кнопку «OK» пробуждано. Разрешить цитометр теплый вверх для по крайней мере 30 мин.
    2. Проверка работоспособности - КНТ бусы: повторить шаги 1.1.2.1–1.1.2.5.
    3. Проверка работоспособности - подтверждение ПЛТ значений с Радуга бисера.
      1. Метки полистирол трубка как «Радуга бисера» и проверьте, что номер лота в использовании. Тщательно перемешайте Радуга бисера флакона. Подготовить Радуга бисера, добавьте 1 каплю Радуга бисера в 1 мл дистиллированной или деионизированной воды. Защищайте от света.
        Примечание: Перейти к приобретение или хранение трубку 2-8 ° c до приобретения.
      2. Создайте новый эксперимент: «Радуга бисера Дата».
      3. Связать компенсаций: щелкните правой кнопкой мыши на «цитометр настройки», выберите «ссылка установки», выберите Матрица соответствующей компенсации, созданный на шаге 1.1.5.9.9 и выберите «Заменить».
      4. Отсоединить компенсации: щелкните правой кнопкой мыши на «цитометр настройки», выберите «Удалить связь из ранее связанные настройки» и нажмите кнопку «OK».
      5. Применить «Параметры приложения»: щелкните правой кнопкой мыши на «цитометр настройки», выберите «Параметры приложения», применять параметр, созданной на шаге 1.1.3.10 во время установки ежемесячный и выберите 'сохранять значение компенсации '.
      6. Отмените выбор, «Включить компенсацию».
      7. Создание нового образца в эксперименте с шаблон листа для Радуга бисера. Приобрести трубку в «Низкий» приобретения.
      8. Во время приобретения бусы Отрегулируйте P1 ворота включить только синглетно шарик населения. Отрегулируйте P2 ворота на участке FITC-A / PE-A точка включить только синглетно шарик населения. Запись 10000 событий.
      9. Проверьте, что МФО и CV значения, полученные для P2 населения находятся в предварительно определенных целей протокола. В противном случае мыть цитометр и начать операцию снова. Сохраните отчет в формате PDF.

2. BM пробоподготовки

Примечание: Выполнение стирки протокол перед процедурой окрашивания клеток.

  1. Пипетка 600 мкл первичной пробы в пластиковых пробирок 15мл.
  2. Добавить 10 мл отмывающего буфера (PBS + 0,5% BSA [> 98% чистой BSA] + 0,09% НАН3 фильтруют раствора, рН 7,4). Перемешайте суспензию клеток, также с помощью пипетки.
  3. Центрифуги для 5 мин на 540 x g (мыть 1). Выбросите супернатант не нарушая Пелле ячейки.
  4. Повторите шаги 2.2-2.3 (мыть 2).
  5. Приостановите Пелле клеток в 400 мкл отмывающего буфера.
  6. Пятнать позвоночника маркеров. Передать весь объем костяк антител полипропиленовые трубы для анализа СУИМ, отождествляется с данные пациента и «костяк». 350 мкл промывают образца (объем промывают выборки, необходимо заполнить все трубы на панели). Смеси хорошо с помощью пипетки.
    Примечание: Вычислите общий объем позвоночника антител для поверхности мембраны, окрашивание (как показано в таблице 2).
  7. Пипетка равное количество образцов костяк смесь в 3 полипропиленовые трубы для анализа СУИМ, отождествляется с данные пациента и «труба номер 1» для «трубка № 3». При необходимости, используйте Отмывающий буфер для достижения окончательный объем 200 мкл в трубку.
    Предупреждение: Будьте осторожны, чтобы не оставить следов образца на стенках труб; в противном случае эти клетки не быть окрашены. При необходимости, вихревой клетки и центрифуги трубки.
  8. В каждой тюбике добавьте соответствующий объем антитела, направленные против клеток поверхностных маркеров (за исключением маркеров позвоночника), как указано в таблице 2. Смеси хорошо с помощью пипетки. Инкубируйте 30 мин на RT, защищенном от света.
  9. Добавьте 2 мл лизировать решения. Смеси хорошо с помощью пипетки. Проинкубируйте втечение 10 мин на RT, защищенном от света.
  10. Центрифуги для 5 мин на 540 x g. Выбросите супернатант не нарушая ячейки Пелле, оставив примерно 50 мкл остаточный объем в каждой тюбике. Смеси хорошо с помощью пипетки.
  11. Добавьте 2 мл отмывающего буфера ячейка Пелле. Смеси хорошо с помощью пипетки.
  12. Повторите шаги 2.10 – 2.11 (мыть 2).
  13. Центрифуги для 5 мин на 540 x g. Отменить супернатант не нарушая Пелле клеток и вновь приостановить Пелле клеток в 200 мкл PBS. Смеси хорошо с помощью пипетки.
  14. Приобретать клетки, предпочтительно, сразу же после окрашивания или хранить при 4 ° C, защищать от света, для не более чем за 1 ч до измеряется в проточный цитометр.

3. сбор данных

  1. Открыть новый эксперимент в Diva программного обеспечения и переименовать его имя, тип образца и дата.
  2. Создание нового образца, содержащие 3 трубки. Укажите в макете эксперимент антитела, которые используются в каждой тюбике.
  3. Щелкните прямо на «цитометр настройки», выберите «Параметры приложения» и применить значения, полученные в ежемесячных Setup (шаг 1.1.3.10).
  4. Откройте новый лист глобальных и создавать участки точка: SSC-A / FSC-A, SSC-A / CD45-HV500-A, SSC-A / FITC-A, SSC-A / PE-A, SSC-A / CD34-PerCP-Cy5.5, SSC-A / CD117-PECy7-A, SSC-A / APC-A, SSC-A / APCH7-A, SSC-A / HLA-DR-HV450-A. В сюжете точка SSC-A/FSC-A Создайте ворота для выбора ячейки синглетного. Создайте в сюжет точка SSC-A/CD45-BV500-A, ворота для выбора 4 населения: гранулоцитов, моноцитов, взрывов и лимфоцитов. Проект этих групп населения в участки точка, созданный ранее.
  5. Создайте новый глобальный лист для компенсации элемента управления, как описано в шаге 1.1.5.9.11.3.
  6. Приобрести трубку в «Средних» приобретение и запись 500,000 события/трубки. После технической проверки (оценки компенсации и правильное окрашивание) экспорт данных в файлы FCS3.0.

4. анализ данных

Примечание: Для создания нормальной BM баз были используемые файлы от здоровых доноров и частных лиц без каких-либо доказательств кроветворных заболеваний следующим 11 из 18 файлов для Neutrophils_NM базы данных, 10 из 18 файлов для базы данных Monocytes_NM и 14 из 18 файлы базы данных NRC_NM. Файлы удаляются, показали различные технические проблемы, как представлено в разделе представитель результаты. Файлы индивидуально были проанализированы с использованием программного обеспечения Infinicyt (Таблица материалов), отвечающей различным стратегиям, изображенные на рисунке 1A(1-3) для нейтрофилов линии (профиль Neutrophils_Maturation.inp), на рисунке 2 A Моноцит линии (профиль Monocytes_Maturation.inp), и Рисунок 3A(1-2) для эритроидных клеток линии (профиль NRC_Maturation.inp).

  1. Стратегия анализа для нейтрофилов -Neutrophils_NM базы строительства 
    1. Идентифицировать CD34 + нейтрофилов, совершенные взрывов с использованием пересечение семь врат, позволяя выбор CD34 + CD117 + HLADR + низкая CD10 - CD13 + CD11b-события (1 рисунока.1). Назначьте эти события на вкладку «Нейтрофилов» в дереве иерархии населения и затем снимите эту вкладку, чтобы удалить эти клетки (изображены синим цветом) от отображения оставшихся событий (серый).
    2. Изолировать CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + Низкий нейтрофилов прекурсоров с помощью пересечение 6 стробов, как показано на рисунке 1A(2) и назначить их на вкладке «Нейтрофилов» .
    3. Определите более Зрелые нейтрофилы, с помощью пересечение четверо ворот, позволяя для дискриминации CD45dim SSCint Привет CD117-HLADR-клеток и их отнесение к вкладке «Нейтрофилов» .
    4. Снимите оставшиеся события, сохраняя только нейтрофилы видимым, затем экспортировать этот населения, нажав ' файл | Экспорт ' и проверка, что все необходимые параметры проверяются и сохранить данные в виде файлов FCS.
    5. В объединенный файл, состоящий из всех экспортированных файлов FCS выполните проверку качества путем оценки интенсивности выражения маркеров для каждой подгруппе населения. С помощью APS участки с медианы для каждого файла и SD кривые для каждого субпопуляция показано, удалите случаев вне 2SD кривых (см. подробности в разделе представитель результаты) (рис. 1Б).
    6. В составе файле с «Нейтрофилов «видимым Нарисуйте путь созревания на APS диаграмме (рис. 1C слева) и сохраните как файл .cyt.
      Примечание: Сравнение созревания диаграмма позволяет визуализировать все параметры из всех файлов, включенных в базу данных Neutrophils_NM, представленные против нормализованной базы данных. Схема представлена на рис. 2C, справа, показывает, что все файлы включены в базу данных Neutrophils_NM (n = 11) вписывается в 2 SD по сравнению со средней группы.
  2. Стратегия анализа для моноциты - строительство базы данных Monocytes_NM
    1. Определить monocytic линии клетки (CD117 + CD64 / + Привет HLADR + Привет) с помощью пересечение четырех ворот (рисA). Назначьте эти события на вкладку «Monocytic» в дереве иерархии населения.
    2. Снимите оставшиеся события, сохраняя только monocytic клетки видна, затем экспортировать этот населения, нажав ' файл | Экспорт ' и проверка, что все необходимые параметры проверяются и сохранить данные в виде файлов FCS.
    3. В объединенный файл, состоящий из всех экспортированных файлов FCS, выполнить проверку качества путем оценки интенсивности выражения маркеров для каждой категории, а затем удалить случаев вне 2SD кривых (подробности в разделе представитель результаты) (Рисунок 2 B).
    4. В результирующий файл с «Monocytic» клетки видна Нарисуйте путь созревания на схеме APS (рис. 2C слева) и сохраните его как файл .cyt.
      Примечание: Сравнение созревания диаграмма позволяет визуализировать все параметры из всех файлов, включенных в базу данных Monocytes_NM, представленные против нормализованной базы данных. Схема представлена на рис. 2C, справа, показывает, что все файлы включены в базу данных Monocytes_NM (n = 10) вписывается в 2 SD по сравнению со средней группы.
  3. Стратегия анализа для ядерных клеток красного (NRCs) - строительство базы данных NRC_NM
    1. Идентифицировать CD34 + эритроидные совершенных взрывов с использованием пересечение семь ворот, которые позволяют выбор CD34 + CD117 + HLADR + низкая CD105 + CD33 - CD36 + CD71 + события (рис. 3A(1)). Назначьте эти события «НСБ» вкладку в дереве иерархии населения и затем снимите эту вкладку, чтобы удалить эти клетки (показано красным цветом) от отображения оставшихся событий (серый).
    2. Определить более зрелой NRCs с помощью пересечение четверо ворот, которые позволяют дискриминации CD45-/ + яркость SSClow CD36 + Привет CD71 + Привет CD105 + / клеток. Назначьте эти события на закладке «СРН» (рис. 3A(2)). Тромбоциты (CD36 + Привет SSClow клетки) должны быть удалены от СРН населения (рис. 3A(2)).
    3. Снимите оставшиеся события, сохраняя только СРН клетки видна, затем экспортировать этот населения, нажав ' файл | Экспорт ' и проверка, что все необходимые параметры проверяются и сохранить данные в виде файлов FCS.
    4. В объединенный файл, состоящий из всех экспортированных файлов FCS выполните проверку качества путем оценки интенсивности выражения маркеров для каждого субпопуляция, последующим удалением случаев вне 2SD кривых (подробности см. в разделе представитель результаты) ( Рисунок 3 B).
    5. В результирующий файл с «СРН» клетки видна Нарисуйте путь созревания на схеме APS(рис. 3C, слева) и сохраните его как файл .cyt.
      Примечание: Сравнение созревания диаграмма позволяет визуализировать все параметры из всех файлов, включенных в базу данных NRC_NM, представленные против нормализованной базы данных. Схема представлена на рис. 3C, справа, показывает, что все файлы включены в базу данных NRC_NM (n = 14) вписывается в 2 SD по сравнению со средней группы.
  4. Оценка созревания в BM миелоидного отсеков с использованием баз данных созревания
    1. Откройте файл .cyt, соответствующий lineage интерес (т.е.., Neutrophils_NM_GMFF.cyt для нейтрофилов линии, Monocytes_NM_GMFF.cyt для monocytic линии и NRCs_NM_GMFF.cyt для эритроидные линии).
    2. Щелкните правой кнопкой мыши на вкладке «Созревания» под вкладкой соответствует линии интерес (' нейтрофилов | Monocytic | СРН ') и сохраните базу созревания для созревания.
    3. Откройте новый файл FCS и проводить анализ, как объяснил previously (шаг 4.1.1–4.1.3 для нейтрофилов, шаг 4.2.1 для Monocytic клеток, и шаг 4.3.1–4.3.2 для СРН).
    4. Нарисуйте путь созревания для населения интерес.
    5. Откройте соответствующую базу данных на вкладке «Инструменты» (анализ базы данных) и сравните населения анализируемым с соответствующей базой данных созревания. Проверка данных для совместимости с имеющаяся база данных: полная совместимость (зеленый треугольник); частичная совместимость, в большинстве случаев расхождений во имя параметров (желтый треугольник); и несовместимости (красный треугольник).
    6. Если данные совместимых или частично совместимых, программное обеспечение создает схему «нормированный созревания различия» . Чтобы визуализировать «параметр Группа созревания различия», открыть новую схему «Схема» вкладке, нажмите кнопку «Созревания» и выбрать сколько параметров отображения, нажмите кнопку «OK» и диаграмме появляются. С правой кнопкой мыши на диаграмме; можно внести изменения в визуализации данных, база данных визуализации и созревания диаграммы визуализации.
    7. Чтобы визуализировать значимость различий между новый файл и включены в базу данных, настройте масштаб (щелкните правой кнопкой мыши на «нормированный созревания различия» и применить «Увеличить»).

Результаты

В исследование были включены 54 BM образцы собраны в K-ЭДТА антикоагулянтом. MFC данные были проанализированы в отсутствие любой информации о пациентах. Ретроспективное исследование показало, что BM образцы из 7 здоровых доноров (5 кобелей и 2 суки с средний возраст 47,4 [35-48], 11...

Обсуждение

Качество BM аспирата может повлиять на окончательные результаты. Гемодилюции аспирата BM может исказить распределение ячейки на разных стадиях созревания ввиду отсутствия прародителей или прекурсоров. Возможно используя основную лизировать метод может помочь в нормализации BM пунктат...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов. Цитометрии отдел, Лаборатория гематологии больницы университета города Сент-Этьен является членом консорциума EuroFlow.

Благодарности

Антитела, используемые в данном исследовании были предоставлены BD бионауки. Авторы хотели бы поблагодарить своего коллегу, д -р Паскаль Flandrin-Gresta, от отдела молекулярной биологии, Лаборатория гематологии, университета больнице Сент-Этьен, Франция, которые предоставили экспертов для интерпретации данных NGS для второго MDS случай. Авторы благодарны за клинициста гематологов за их интерес и участие в этом исследовании и для больных и здоровых доноров за их согласие на участие в этом исследовании. Авторы хотели бы также поблагодарить фонд «Реми де Les масс» для финансовой поддержки для публикации.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BD FACSCanto II flow-cytometerBD Biosciences, CA, USASN: V338963013363-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R CentrifugeAWEL Industries, FRSN: 910120016; Model No: 320002001low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes
Pipetts of 10µL and 200µL
Pasteur pipettes
15 mL Falcon tubes
polypropylene tube for FACS
Mouse Anti-Human HLA-DRBD Biosciences, CA, USA655874clone L243
Mouse BALB/c IgG2a, κ
Fluorochrome Horizon V450
(Ex max 404 nm/
Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45BD Biosciences, CA, USA560777clone HI30
Mouse IgG1, κ
Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/
Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16BD Biosciences, CA, USA656146clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ
Fluorochrome FITC
(Ex max 494 nm/
Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13BD Biosciences, CA, USA347406clone L138
Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ
Fluorochrome PE
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34BD Biosciences, CA, USA347222clone 8G12
Mouse BALB/c IgG1, κ
Fluorochrome PerCP-Cy5.5
(Ex max 482 nm/
Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117BD Biosciences, CA, USA339217clone 104D2
Mouse BALB/c IgG1
Fluorochrome PE-Cy7
(Ex max 496 nm/
Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11bBD Biosciences, CA, USA333143clone D12
Mouse BALB/c IgG2a, κ
D12, Fluorochrome APC
(Ex max 650 nm/
Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10BD Biosciences, CA, USA646783clone HI10A
Mouse BALB/c IgG1, κ
Fluorochrome APC-H7
(Ex max 496 nm/
Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD35BD Biosciences, CA, USA555452clone E11
Mouse IgG1, κ
Fluorochrome FITC
(Ex max 494 nm/
Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64BD Biosciences, CA, USA644385clone 10.1
Mouse BALB/c IgG1, κ
Fluorochrome PE
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD300eImmunostepIREM2A-T100clone UP-H2
Mouse BALB/c IgG1, k
Fluorochrome APC
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD14BD Biosciences, CA, USA641394clone MoP9
Mouse BALB/c IgG2b, κ
Fluorochrome APC-H7
(Ex max 496 nm/
Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD36BD Biosciences, CA, USA656151clone CLB-IVC7
Mouse IgG1, κ
Fluorochrome FITC
(Ex max 494 nm/
Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105BD Biosciences, CA, USA560839clone 266
Mouse BALB/c IgG1, κ
Fluorochrome PE
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD33345800clone P67.6
Mouse BALB/c IgG1, κ
Fluorochrome APC
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71BD Biosciences, CA, USA655408clone M-A712
Mouse BALB/c IgG2a, κ
Fluorochrome APC-H7
(Ex max 496 nm/
Em max 785nm)
Lysing Solution 10x Concentrate (IVD)BD Biosciences, CA, USA349202
FACSFlow Sheath FluidBD Biosciences, CA, USA342003
FACSDiva CS&T IVD beadsBD Biosciences, CA, USA656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKSCytognos, Salamanca, SpainSPH-RCP-30-5Alots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)BD Biosciences, CA, USAref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3BD Biosciences, CA, USA
Phosphate buffered saline tabletsR&D Systems, Minneapolis, USA5564
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-Aldrich, FranceA9647
Sodium azide 99%Sigma-Aldrich, France199931
Infinicyt software version 1.8.0.eCytognos, Salamanca, Spain

Ссылки

  1. Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes. Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).
  2. Porwit, A., et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow). Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).
  3. Westers, M. T., et al. Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS. Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).
  4. Meehan, S., et al. AutoGate: automating analysis of flow cytometry data. Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).
  5. Greenberg, P. L., et al. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).
  6. Greenberg, P. L., et al. Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).
  7. Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. (2), 86-128 (2017).
  8. . https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html Available from: https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html (2018)
  9. . . Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).
  10. . . EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).
  11. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).
  12. van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).
  13. Matarraz, S. Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).
  14. Westers, M. T. Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group). Haematologica. 102, 308-319 (2017).
  15. Shen, Q., et al. Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response. European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

141MFCMDSMFC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены