数据库引导流式细胞术评价骨髓细胞成熟

摘要

mds 诊断是困难的, 在没有形态学标准或非信息细胞遗传学。mfc 可以帮助优化 mds 诊断过程。为了对临床实践有用, mfc 分析必须基于具有足够特异性和敏感性的参数, 数据应在不同的操作人员之间重现。

摘要

在法国细胞术协会 (afc) 内成立了一个工作组, 以协调多参数流式细胞术 (mfc) 在法国骨髓疾病诊断中的应用。这里介绍的议定书是在2013年9月至2015年11月期间在六个法国诊断实验室 (圣艾蒂安、格雷诺布尔、克莱蒙-费朗、尼斯、里尔和保利-卡尔特斯研究所) 商定并应用的。马赛), 并允许骨髓样品制备和数据采集的标准化。三个成熟数据库被开发了中性粒细胞, 单核细胞和红血球系与骨髓从 "健康" 捐献者 (个人没有任何证据的造血疾病)。对于每个髓系的可靠分析方法应该适用于常规诊断使用。可以以相同的方式分析新案例, 并与通常的数据库进行比较。因此, 定量和定性表型异常可以被确定, 那些超过2sd 的人相比, 正常骨髓样本的数据应被视为指示病理。主要的局限性是使用基于杂交瘤技术的方法获得的单克隆抗体获得的数据与目前用于临床诊断的数据之间的差异较高。为所获得的数据设置技术验证标准可能有助于提高 mfc 在 mds 诊断中的效用。制定这些标准需要对数据库进行分析。减少数据分析中的研究者主体性是该方法的一个重要优点。

引言

在 mds 启动和进展过程中, 没有特定于骨髓细胞增生异常变化的表型标记的情况下, 近年来在评估成熟途径 (表达改变) 的基础上, 提出了一种新的方法。在生产成熟髓细胞的过程中, 或在骨髓 (bm) 细胞隔间 1,²内不同细胞类型的异常分布^{的髓抗原.}

本文提出了一种新的方法, 标准化应用 mfc, 以检测与骨髓增生异常综合征 (mds) 或其他骨髓血液学疾病有关的 bm 骨髓细胞隔间的增生异常变化。本研究还显示了使用成熟数据库进行 mfc 数据分析的效用。

样品制备程序的标准化、数据采集和使用数据库进行分析, 将有助于识别与 bm 骨髓细胞增生异常变化有关的最相关的表型异常。因此, 在开发可用于后续分析的分析策略时, 需要基于标记良好且公认的格式 (自动人口分离器 (aps) 图、直方图和点图) 进行统计选择的子集轮。mds 中强健表型异常的发现将在有或没有最小形态发育不良和没有细胞遗传学异常的病例中缓解诊断。识别允许减少免疫表型面板的歧视性参数可以简化目前的分数², 使其在临床病理实验室的适用性。

这种方法限制了细胞学数据的主观解释, 正如 mds 诊断³中所表明的那样。此步骤是开发用于处理和分析流数据的自动化工具^{的先决条件 4}。

mds 包括一组异质性克隆造血干细胞 (hsc) 疾病, 其中牙代突变与特定的表观修饰语结合生成 mds 苯型。现在人们知道, 随着 hsc 突变, 其他机制也参与了 mds 病理生理学, 如异常免疫介导的炎症和恶性 hsc 与 bm 基质微环境之间的相互作用。然而, 对这些机制的了解仍然很少。mds 广泛的临床和生物学异质性使得诊断和选择最佳治疗方法成为一个挑战。在过去的十年里, 多项研究表明, mfc 在检测发育不良2方面往往比形态学更敏感, 但技术和经济上的限制使这一技术难以标准化, 其结果往往取决于口译人员的经验³。此外, 目前尚不清楚 mfc 如何在有或没有最小形态发育不良的情况下, 在没有细胞遗传学异常的情况下, 或在其他非克隆 bm 的低爆炸计数的低细胞 mds 等边缘病例中, 将天平向 mds 倾斜骨髓衰竭 (即再生障碍性贫血) 等疾病。在爆炸过多的情况下, 也很难区分 mds 的边缘病例和急性髓系白血病 (aml)。由于所有这些原因, 临床指南没有将 mfc 测试集成到 mds 最终诊断中。2011年, 美国国家综合癌症网络 (nccn) 推荐 mfc 用于估计 cd34+ 细胞的百分比, 检测阵发性夜间血红蛋白尿克隆, 以及细胞下 mds 5 中是否存在细胞毒性 t 细胞克隆.这两种情况后两种情况也涉及治疗目标, 因为临床数据显示, 这些患者对免疫抑制治疗有很好的反应^.2017年 nccn 指南引用了国际工作组 (iwg) 的建议, 将 mfc 异常免疫表型检测列为 mds 诊断的共同标准, 但没有制定任何规格⁶。此外, 最近公布的世卫组织分类规定, 仅有 mfc 发现不足以在没有结论性形态和/或细胞遗传学数据^的情况下确定 mds 的初步诊断7。然而, mfc 可以作为一个额外的测试, 显示骨髓细胞成熟模式的失调, 并量化患者在疾病过程中的特定时间 "与正常的距离"。

该方法适用于有兴趣用 mfc 免疫表型评估 bm 骨髓细胞发育不良的临床实验室, 以完善 mds 或其他骨髓异常异常疾病的诊断。

研究方案

以下议定书已得到法国圣艾蒂安大学医院 "独立道德委员会" (独立道德委员会) 的批准。

1. 细胞仪设置

注: 细胞仪设置是根据法国流量建议, 根据欧洲流程序 "欧洲流标准操作协议 (sop) 的仪器设置和补偿 (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php)。

1. 每月仪器设置
   1. 打开细胞仪。确保所有液体水平都是适当的, 并打开 diva 6.1.3。执行流体启动: 在菜单栏中, 选择"细胞仪"流体启动 '。出现提示时, 单击"确定" 。让细胞仪热身至少30分钟。
   2. 性能检查-科技委珠子
      注: 对于这一步骤, 请准备12毫米聚苯乙烯管、cst 珠子和护套液 (见材料表)。
      1. 标记 12 x 75 mm²聚苯乙烯管 "cst"。通过温和的反转或非常温和的涡流混合提供的珠子小瓶。加入标记管: 0.35 毫升护套液和1滴 cst 珠子。轻轻旋涡管, 然后进行采集。如果不立即获得, 请在2-25 的黑暗中将管存放长达8小时。
      2. 执行性能检查: 在菜单栏中, 选择"细胞仪"科技委 '。
      3. 在 cst 模块的"设置"选项卡中: 确认 cst ii 与默认的4-2h-2v 配置相同, 并确认此配置存在使用当前批量 cst 珠子创建的基线。如果不存在基线, 请参阅科技委珠子 ifu。确认此基准尚未过期: 在"安装控制"下, 从下拉菜单中选择"检查性能" 。
      4. 检查"手动加载管" , 然后点击"运行"。确认显示的批号。轻轻旋涡上面准备的稀释珠子, 当出现提示时, 加载稀释后的珠子, 然后单击"确定"。
      5. 性能检查完成后, 请验证 cy光仪性能是否通过。点击"查看报告"。如果结果未通过, 请重新运行性能检查。使用性能跟踪报告日期以 pdf 格式保存报告。
   3. 使用彩虹珠 (材料表) 调整"荧光 pmt 电压" 。
      注: 目标值在题为 "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads" 的欧洲流动标准作业程序 (sop) 中规定。该标准作业程序可在欧洲流动网站 (www.euroflow.org; 公共区域;"协议" 选项卡)。
      1. 通过"每月仪器设置日期" 创建新实验样本 ".
      2. ', 选择与相关管相对应的光学参数和荧光岩 (fitc、pe、perccy5.5、pe-cy7、apc、apc-h7、v450、v500), 并检查所需的采集参数 (日志、a、h 和/或 w)。应用当前的 cst 设置 (右键单击实验的 "细胞仪设置") 。将 fsc 参数的阈值设置为 10, 000。
      3. 在细胞仪上, 在设置目标 mfi 设置的荧光 pmt 电压时关闭补偿;为此, 请在"检查器"中导航到"补偿"选项卡. 通过取消选中"启用补偿"选项来禁用补偿。
      4. 创建一个工作表"目标 mfi" , 其中包含所有必要的点图 (n = 2;fsc 对 ssc、fitc 对 pe)、直方图 (n = 8; 每个荧光探测器一个直方图) 和显示每个荧光通道参考峰值 (mfi 和 cv) 的统计信息。
      5. 在使用前, 在1毫升的蒸馏水和涡流中稀释1滴8峰彩虹珠校准颗粒。无需以"低"流量记录8峰彩虹珠溶液。如果不立即获得, 请在2-25 的黑暗中将管存放长达8小时。
      6. 在 fsc 与 ssc 双变量点图中的 "人口 p1"中, 将单个珠子 "人口 p1" 进入 fct 与 pe 双变量点图中的第8或第7个峰值 (最亮的峰值或向下的峰值, 如题为 "20180302_7th_高峰 _ target _ value _ 彩虹 _ 珠子 "), 并将此大门人口命名为 p2。
      7. 继续获取8峰彩虹珠悬架, 并根据欧洲流文档 "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads" 调整所有荧光通道中的 pmt 电压, 以达到目标 mfi 值。
      8. 达到第8个或第7个峰值的目标 mfi 值后, 记录已达到的目标 mfi 值和相应的最终 pmt 值。获取 5, 000个事件并记录数据。
         注: 必须在下面的步骤 1.2.3 (性能检查-用彩虹珠确认 pmt 值) 中使用 pmt 值。
      9. 记录这些值, 使打印屏幕与工作表"目标 mfi"和仪器设置, 并保存为. jpg 图片。
         注: 创建 "新" 管时, 有时 pmt 值会意外变化。为此, 必须对 pmt 进行双重检查。每次将 pmt 值与笔记进行比较时, 请仔细检查"目标 mfi"值和 pmt 值是否正确!
      10. 保存"应用程序设置"。在浏览器中, 右键单击"cy光仪设置"。从下拉菜单中, 选择"应用程序设置", 然后保存。点击"确定"。如果出现提示, 请单击 "是" 以维护阈值。
          注: 使用默认名称保存应用程序设置。不要重命名设置。
   4. 使用裂解洗过的血液 ( lwb) 调整 "fcs " 和 "ssc 电压" 。
      注: 在这一步骤中, 需要从健康的志愿者、裂解液 (材料表) 和洗涤缓冲液中提供50μl 的外周血 (pb) 样本。
      1. 将50μl 的 pb 放入试管中。加入2毫升新鲜稀释的裂解溶液。轻轻混合 10分钟, 在 rt 孵育。
      2. 离心 5分钟, 540 x g.
      3. 在不干扰细胞颗粒的情况下吸收上清液, 在管内留下约50μl 的残余体积。轻轻混合, 加入2毫升的过滤洗涤液。
      4. 离心 5分钟, 540 x g.
      5. 重复一次步骤 1.1.4.3 1.1.4.4。
      6. 加入250μl 的过滤洗涤缓冲液, 轻轻搅拌。
      7. 在为获取彩虹珠而创建的实验中, 创建一个新的 "样本"新工作表': 绘制双参数 ssc-a/fsc-a 图。
      8. 获取细胞, 在 fsc 与 ssc 双变量点图中启动淋巴细胞, 并调整 fsc 和 ssc 电压, 以达到门控淋巴细胞群的以下平均目标值: fsc:55, 000 (范围 50000-60000) 和 ssc 13, 000 (范围 11, 000-15, 000)。
      9. 获取和记录大约 10, 000个事件的数据。验证门控淋巴细胞的平均 fsc 和 ssc 目标值。如有必要, 重新调整 fsc 和 ssc 电压。
      10. 打印屏幕并存储所获得的目标通道值的打印。
   5. 荧光补偿设置。
      注: 必须在目标 mfi 设置和 fsc/ssc 设置建立后设置单色补偿控制。在这一步骤中, 需要一个来自健康志愿者的 pb、补偿颗粒 (材料表)、裂解溶液和洗涤缓冲液。表 1列出了用于设置荧光补偿矩阵的荧光铬共轭抗体试剂及其参考群体。
      1. 标记每种试剂一管用于设置荧光补偿 (fitc、pe、perccy5.5、apc、v450、vp500、PECy7、apc-h7-cd10、apc-h7-cd14 和 apc-h7-cd71) 和 "blank/un而已染色" 管。
      2. 将50μl 的 pb 放入每个管中, 或在表1所示补偿控制管中滴1滴 "负" 补偿颗粒 + 1 滴 "正" 补偿颗粒。
      3. 在试管中加入适量的抗体试剂。加入过滤后的洗涤缓冲液, 达到每管100μl 的最终体积, 然后轻轻搅拌。在 rt 加活 15分钟, 免受光线影响。
      4. 只在与细胞的试管中加入2毫升新鲜稀释的裂解溶液, 轻轻搅拌。在 rt 生 10分钟, 不受光线影响。
      5. 离心 5分钟, 540 x g.
      6. 在不干扰细胞颗粒的情况下吸吸上清液, 在每个管中留下约50μl 的残余体积。轻轻混合。加入2毫升过滤洗涤缓冲液。
      7. 离心 5分钟, 540 x g.
      8. 在不干扰细胞颗粒的情况下吸吸上清液, 在每个管中留下约50μl 的残余体积。加入过滤后的洗涤缓冲液, 达到每管250μl 的最终体积, 轻轻搅拌。
      9. 创建补偿控制。
         1. 从菜单栏中, 选择 "为获取彩虹珠创建的实验"。创建一个新的 "样本"薪酬设置创建补偿控制 "。
         2. 在生成的对话框中, 选中"包括单独的未染色控制管/井" 复选框。为 fitc、pe、perccy5.5、apc、hv450、hv500 创建通用 (非标签特定) 补偿控制。为 pe-cy7-cd117、apc-h7-cd10、apc-h7-cd14 和 apc-h7-cd71 创建特定的标签补偿控制。点击"确定"。
         3. 在新的工作表中, 创建双参数 ssc-a/fsc-a 图, 绘制淋巴细胞 (p1) 上的门和与将在每个管中检测到的荧光铬相对应的直方图, 并为正峰绘制一个 p2 门。显示层次结构 (右键单击图表并选择"显示人口层次结构") 以可视化 p2 中的事件数, 未染色控制管除外。
         4. 在浏览器中, 展开补偿控制样本。
         5. 涡旋未染色的细胞, 上面准备的 3-5 s. 在细胞仪上安装准备好的未染色细胞。将流速调整为 "中",然后单击"获取数据"。在 fsc-a 与 ssc-a 点图中, 调整 p1 门, 以完全包含淋巴细胞群。右键单击 p1 门。选择"应用于所有补偿控制"。
         6. 在"采集"仪表板中, 单击 "记录数据"以获取 5, 000个事件。对于所有单色染色控制单元, 验证 p2 间隔门是否包含正种群。
         7. 对于 pe-cy7 和 apch7 管, 在直方图上添加一个 p3 间隔门, 并确保它包含负种群, 并且 p2 包含阳性种群。
         8. 计算补偿。从菜单栏中, 选择"实验"薪酬设置计算补偿 "。将补偿矩阵命名为: "补偿日期"。选择"链接并保存"。
         9. 将补偿矩阵保存在目录应用程序设置中: 点击 "cy仪设置"应用程序设置保存 ", 命名补偿矩阵" 补偿日期 " , 然后单击" 确定 "。
         10. 在浏览器中, 点击"cy光仪设置".在检查器中, 导航到"补偿"选项卡. 单击右下角的 "打印"。
             注: 也可以从目录中检索此信息。
         11. 补偿矩阵的控制。
             1. 将所有的单染色管 (apch7 的选择) 混合在一个管中。
             2. 创建一个名为"补偿验证日期"的新实验, 添加新的样本, 点击本实验的"细胞仪设置",然后选择"链接"取消链接"保存在步骤1.1.3.10 中的应用程序设置。获取 50, 000个事件从这个管与新的设置。
             3. 应用新的全局工作表。创建1个点图 FSC-A/SSC-A, 并绘制一个门, 以可视化淋巴细胞和 n x (n-1)/2个其他情节, 重点是淋巴细胞门, 以可视化两个比两个参数。
2. 日常仪器设置
   1. 打开细胞仪。确保所有液体水平都是适当的, 并打开 diva 6.1.3。执行流体启动: 在菜单栏中, 选择"细胞仪"流体启动 '。出现提示时, 单击"确定" 。让细胞仪热身至少30分钟。
   2. 性能检查-cst 珠子: 重复 1.1.2.1 1.1.2.5 的步骤。
   3. 性能检查-用彩虹珠确认 pmt 值。
      1. 将聚苯乙烯管标记为"彩虹珠" , 并检查批号是否为正在使用的批号。将彩虹珠小瓶彻底混合。准备彩虹珠, 在1毫升的去离子或蒸馏水中加入1滴彩虹珠。防止光线照射。
         注: 在采集之前, 继续获取或将管道存放在2-8°c。
      2. 创建一个新的实验: "彩虹珠日期"。
      3. 链接补偿: 右键单击"cy光仪设置", 选择"链接设置", 选择在步骤中创建的适当补偿矩阵1.1.5.9.9 然后选择"覆盖"。
      4. 取消链接补偿: 右键单击"cy光仪设置", 选择"从以前链接的设置中取消链接" , 然后单击"确定"。
      5. 应用"应用程序设置": 右键单击 "cy尺设置", 选择"应用程序设置", 在每月设置过程中应用步骤中创建的设置1.1.3.10 并选择 "保留补偿值"。
      6. 取消选择"启用补偿"。
      7. 在 "使用彩虹珠的工作表模板进行实验" 中创建一个新的 "样本"。在"低" 采集中获取管。
      8. 在珠子采集过程中, 调整 p1 门, 只包括单珠数量。调整 fitc-a/pe-a 点图上的 p2 门, 仅包括单圈珠子群。记录 10, 000个事件。
      9. 检查为 p2 群体获得的 mfi 和 cv 值是否在协议的预定义目标中。否则, 请清洗细胞仪, 然后重新开始手术。将报告另存为 pdf 格式。

2. bm 样品制备

注: 在染色程序之前执行细胞清洗协议。

1. 将一次样品600μl 移入15毫升离心管。
2. 加入10毫升洗涤缓冲液 (pbs + 0.5% bsa [& gt;98 纯度 bsa] + 0.09% nan₃过滤溶液, ph 7.4)。用移液器很好地混合细胞悬浮液。
3. 离心 5分钟, 540 x克(洗 1)。在不干扰细胞颗粒的情况下丢弃上清液。
4. 重复步骤 2.2–2.3 (清洗 2)。
5. 将细胞颗粒悬浮在400μl 的洗涤缓冲液中。
6. 骨数的主干标记。将整个骨干力量抗体转移到聚丙烯管进行流式细胞仪分析, 用患者数据和 "主干" 鉴定。加入350μl 的洗涤样品 (填充面板上所有管所需的洗涤样品的体积)。用移液器混合得很好。
   注: 计算表面膜染色的主干抗体总量 (如表 2所示)。
7. 移液器等量的采样主干混合成3个聚丙烯管进行流式细胞仪分析, 用患者数据和 "管号 1" 到 "管号 3" 进行鉴定。如有必要, 请使用洗涤缓冲液, 以达到每管200μl 的最终体积。
   注意: 注意不要在管壁上留下任何样品痕迹;否则, 这些细胞将不会被染色。如有必要, 对细胞进行涡旋, 并将管离心。
8. 在每个管中, 添加针对细胞表面标记的适当数量的抗体 (主干标记除外), 如表 2所示。用移液器混合得很好。在保护光线的 rt 中孵化30分钟。
9. 加入2毫升的裂解溶液。用移液器混合得很好。在保护光线的 rt 中孵化10分钟。
10. 离心 5分钟, 540 x g. 在不干扰细胞颗粒的情况下丢弃上清液, 在每个管中留下约50μl 的残余体积。用移液器混合得很好。
11. 在细胞颗粒中加入2毫升的洗涤缓冲液。用移液器混合得很好。
12. 重复步骤 2.10–2.11 (洗 2)。
13. 离心 5分钟, 540 x g. 在不干扰细胞颗粒的情况下丢弃上清液, 并在200μl 的 pbs 中重新悬浮细胞颗粒。用移液器混合得很好。
14. 获得细胞, 最好是, 染色后或储存在 4°c, 保护免受光线, 不超过 1小时, 直到测量在流动细胞仪。

3. 数据采集

1. 打开 diva 软件中的新实验, 并根据名称、样本类型和日期对其进行重命名。
2. 创建一个包含3个管的新样品。在实验布局中指定每个管中使用的抗体。
3. 点击右键的 "cy尺设置", 选择"应用程序设置" , 并应用每月设置 (步骤 1.1.3.10) 中获得的值。
4. 打开一个新的全球工作表, 并创建点图: ssc-a/fsc-a, ssc-ac/cd45-hv5-a, ssc-apc-aitc-a、ssc-ac/pe-a、ssc-ac/cdc-cdp-cy5.5、ssc-ac/cd117-a、ssc-ac/apc-apc-a、ssc-ad/hla-drh-drh-ht-a。在 ssc-a/fsc-a 点图中, 创建一个用于选择单元数单元的门。在 ssc-acd45-bv500-a 点图中, 创建选择4个群体的门: 粒细胞、单核细胞、爆炸和淋巴细胞。在以前创建的点图中投影这些群体。
5. 按照步骤1.1.5.9.11.3 中的说明, 为薪酬控制创建新的全局工作表。
6. 获得"中" 收购管, 并记录50万发管。在技术验证 (评估补偿和正确染色) 后, 将数据导出为 fcs3.0 文件。

4. 数据分析

注: 为了构建正常的 bm 数据库, 使用的文件来自健康的捐献者和个人没有任何证据证明造血疾病如下11个从18个文件的中性粒细胞 _ nm 数据库, 10个从18个文件的 mon细胞 _ nm 数据库和14个从18个数据库的文件。如 "代表结果" 部分所示, 丢弃的文件显示了各种技术问题。这些文件使用英菲尼迪软件 (材料表) 进行了单独分析, 符合图 1a(1-3)所描述的中性粒细胞谱系的各种策略 (中性粒细胞 _ maturation. inp),图2 a用于单核细胞谱系 (单核细胞谱), 图3A(1-2)用于红血球谱系 (单核细胞谱系)。

1. 中性粒细胞的分析策略 -中性粒细胞 _ nm 数据库构建
   1. 使用7个门的交叉点识别 cd34+ 中性粒细胞重度爆炸, 允许选择 cd34+ cd117+ hladr + 低 cd10-cd13 + cd11b-事件 (图 1a.1)。将这些事件分配给 "人口层次结构树" 中的 "中性粒细胞"选项卡, 然后取消选中此选项卡, 以便从其余事件 (灰色) 的显示中删除这些单元格 (以蓝色显示)。
   2. 使用图 1 A(2) 所示的六个门的交叉点隔离 cd1117 + cd34 + cd13+ cd11b + 低中性粒细胞前体, 并将其分配给"中性粒细胞"选项卡。
   3. 使用四个门的交叉点识别更成熟的中性粒细胞, 允许区分 cd45 昏暗的 sscint-hi cd117-hladr 细胞及其分配到"中性粒细胞"选项卡。
   4. 取消选中剩余的事件, 使只有中性粒细胞可见, 然后通过单击"文件" 导出此填充导出 "并验证是否检查了所有必需的参数, 并将数据另存为 fcs 文件。
   5. 在由所有导出的 fcs 文件组成的合并文件中, 通过评估每个子群的标记表达式的强度来执行质量检查。使用带有每个文件的中间值的 aps 图和显示的每个子填充的 sd 曲线, 删除2sd 曲线之外的事例 (请参阅 "代表性结果" 部分中的详细信息) (图1b)。
   6. 在生成的包含可见 "中性粒细胞" 的组合文件中, 在 aps 图上绘制 "成熟路径" (左图 1c) , 并另存为. cyt 文件。
      注: 比较成熟图允许根据规范化数据库表示的中性粒细胞 _ nm 数据库中包含的所有文件中的所有参数的可视化。图 2c 右侧的图表显示, 中性粒细胞 _ nm 数据库 (nesecx11) 中包含的所有文件都适合 2 sd, 而不是组的中位数。
2. 单核细胞的分析策略-单核细胞 _ nm 数据库的构建
   1. 使用四个门的交叉点识别单核细胞 (CD117+/-CD64+hi hladr + hi) (图 2a)。将这些事件分配给 "人口层次结构" 树中的"单核化"选项卡。
   2. 取消选中剩余的事件, 使单个细胞仅可见, 然后通过单击"文件" 导出此填充导出 "并验证是否检查了所有必需的参数, 并将数据另存为 fcs 文件。
   3. 在由所有导出的 fcs 文件组成的合并文件中, 通过评估每个子群的标记表达式的强度来执行质量检查, 然后删除2sd 曲线之外的案例 ("代表性结果" 部分中的详细信息) (图 2b)。
   4. 在生成的文件中, "单核细胞" 单元可见, 在 aps 图上绘制 "成熟路径" (左图 2c ), 并将其另存为. cyt 文件。
      注: 比较成熟图允许根据规范化数据库表示的 monc宁 _ nm 数据库中包含的所有文件中的所有参数的可视化。图 2c 右侧显示的图表显示, 包含在 mon细胞 _ nm 数据库 (nect10) 中的所有文件都适合于 2 sd, 而该组的中位数。
3. 有核红细胞分析策略-nrc _ nm 数据库构建
   1. 识别 cd34+ 红血球承诺爆炸使用7个门的交叉口, 允许选择 cd34 + cd117+ hladr + 低 cd101 + cd103 + cd36 + cd71 + 事件 (图 3A(1))。将这些事件分配给 "人口层次结构树" 中的 "nrc" 选项卡, 然后取消选中此选项卡, 以便从其余事件 (灰色) 的显示中删除这些单元格 (用红色描绘)。
   2. 使用四个门的交叉口识别更成熟的 nrc, 该交叉口允许对 CD45-/+dim sscow 进行歧视 CD36+hi CD71+hi CD105+/-cells。将这些事件分配给 "nrc" 选项卡 (图 3A(2))。必须从 nrc 人群中取出血小板 (CD36+hi sscow 细胞) (图 3A(2))。
   3. 取消选中剩余的事件, 使 nrc 单元格仅可见, 然后通过单击"文件" 导出此填充导出 "并验证是否检查了所有必需的参数, 并将数据另存为 fcs 文件。
   4. 在由所有导出的 fcs 文件组成的合并文件中, 通过评估每个子群的标记表达的强度来执行质量检查, 然后删除2sd 曲线之外的案例 (请参阅 "代表性结果" 部分中的详细信息) (图 3b)。
   5. 在生成的文件中, "nrc" 单元格可见, 在 aps 图上绘制 "成熟路径" (左图3 c), 并将其另存为. cyt 文件。
      注: 比较成熟图允许根据规范化数据库表示的 nrc _ nm 数据库中包含的所有文件中的所有参数的可视化。图 3(右侧) 中的图表显示, nrc _ nm 数据库中包含的所有文件 (n = 14) 与组的中值相比, 都适合 2 sd。
4. 利用成熟度数据库评价 bm 骨髓间的成熟度
   1. 打开与利益的血统相对应的. cyt 文件 (即中性粒细胞的中性粒细胞 _ nm _ gmff. cyt, 单核细胞 _ nmff. cyt 为单核细胞谱系, nrc _ nm _ gmff. cyf. cyb)。
   2. 右键单击与兴趣的血统 ("中性粒细胞") 相对应的选项卡下方的"成熟"选项卡单核细胞nrc '), 并将成熟保存到成熟数据库。
   3. 打开一个新的 fcs 文件并执行分析, 如前面所述 (步骤 4.1.1--中性粒细胞的4.1.3、单核细胞细胞的步骤4.2.1 和 nrc 的步骤 4.3.1 4.3.2)。
   4. 为感兴趣的人群绘制成熟路径。
   5. 在"工具" 选项卡 ("数据库分析") 中打开相应的数据库, 并将要分析的填充与相应的成熟度数据库进行比较。检查数据是否与可用数据库兼容: 完全兼容 (绿色三角形);部分兼容性, 在大多数情况下, 参数名称的差异 (黄色三角形);和不兼容 (红色三角形)。
   6. 如果数据兼容或部分兼容, 软件将创建"归一化成熟差异"关系图。若要可视化"参数波段成熟度差异", 请在"关系图" 选项卡中打开一个新关系图, 单击"成熟度"并选择要显示的参数数, 单击"确定" , 然后显示该关系图。右键单击图表;可以在数据可视化、数据库可视化和成熟图可视化中进行更改。
   7. 若要可视化新文件与数据库中包含的数据之间差异的重要性, 请配置缩放 (右键单击"规范化成熟差异"并应用"缩放")。

结果

研究包括在 k-edta 抗凝剂中采集的 54个 bm 样品。在没有任何患者信息的情况下, 对 mfc 数据进行了分析。回顾性研究显示, bm 样本来自7个健康捐献者 (5名男性和2名女性, 中位年龄为 47.4 [35-48], 11 人没有造血疾病的证据 (8名男性和3名女性, 中位年龄为 57.9 [35-72]) 和36例。 病理情况: 贫血和肌酐水平低1例, 贫血3例, 肌酐水平高, 贫血8例, 维生素 b12 缺乏引起贫血1例, 贫血4例, 贫血...

讨论

bm 吸气的质量可能会对最终结果产生影响。bm 吸气的血液稀释会由于没有祖细胞或前体细胞而扭曲不同成熟阶段细胞的分布。在流式细胞仪分析中, 采用大容量裂解法可能有助于 bm 吸气液的正常化, 用于血液稀释。此外, 流动细胞学评价 bm 骨髓发育不良的关键步骤是样品处理和染色、数据采集和解释^2,3。在 bm 收获后, 样品处理和染色应进行至72小时。数?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCanto II flow-cytometer	BD Biosciences, CA, USA	SN: V33896301336	3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuge	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; Model No: 320002001	low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes
Pipetts of 10µL and 200µL
Pasteur pipettes
15 mL Falcon tubes
polypropylene tube for FACS
Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777	clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406	clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, CA, USA	333143	clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, CA, USA	641394	clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD33		345800	clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Lysing Solution 10x Concentrate (IVD)	BD Biosciences, CA, USA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS&T IVD beads	BD Biosciences, CA, USA	656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS	Cytognos, Salamanca, Spain	SPH-RCP-30-5A	lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
Phosphate buffered saline tablets	R&D Systems, Minneapolis, USA	5564
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, France	A9647
Sodium azide 99%	Sigma-Aldrich, France	199931
Infinicyt software version 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Spain