データベース ガイド-フローサイトメトリー評価骨髄骨髄細胞の成熟のため

要約

MDS の診断は非有益な細胞遺伝学または形態学的条件の不在で難しいです。MFC では、MDS の診断プロセスを改良を助けることができます。臨床練習のために便利になる、MFC 分析が十分な特異性と感度、パラメーターに基づく必要があります、データは異なる事業者間再現する必要があります。

要約

フランス語フローサイトメトリー協会 (AFC) 内を開始したワーキング グループは、フランスの骨髄疾患診断のため多項目フローサイトメトリー (MFC) のアプリケーションを調和させるために開発されました。ここで提示されたプロトコルが合意し、2013 年 9 月と 2015 年 11 月の間応用 6 フランス診断所 (サンテティエンヌ、グルノーブル、クレルモン ・ フェラン、ニース、リール、Institut パオリ-Calmettes での大学病院でマルセイユ)、骨髄サンプル準備およびデータ集録の標準化を許可します。3 つの成熟データベースは、好中球、単球と「健康」ドナー個人 (造血疾患の証拠なしの個人) から骨髄で赤芽球系に開発されました。各骨髄系の頑健な解析は日常的診断に該当する必要があります。新しいケースは同じ方法で解析でき、通常のデータベースと比較します。したがって、量的・質的形質異常を識別でき、2SD 通常骨髄のサンプルのデータと比較して上記の病理を示す考慮すべき。主な制限は、ハイブリドーマ技術に基づいて、現在臨床診断に使用方法で得られたモノクローナル抗体を使用して達成データ間の高い変動です。取得したデータの技術的な検証に関する条件を設定 MDS の診断のための MFC のユーティリティを向上させるを助けるかもしれない。これらの基準の確立には、データベースに対して分析が必要です。データ分析で調査官の主観の削減は、この方法の重要な利点です。

概要

近年成熟経路 (の発現の変化の評価に基づく MDS の開始そして進行の間に骨髄系細胞で発生する異形成の変更を特定の表現型マーカーがない場合は、新しいアプローチを提案されています。成熟した骨髄系細胞の生産の間に骨髄性抗原) や骨髄 (BM) 内の別のセル型の異常分布の細胞コンパートメント^1,2。

骨髄異形成症候群 (MDS) やその他の骨髄性血液疾患に関連する BM 骨髄球系細胞コンパートメントの異形成の変化を検出するために MFC の標準化されたアプリケーションのための新しい手法を提案します。本研究では、MFC データ解析のための成熟のデータベースを使用するユーティリティも示しています。

サンプルの準備の手順、データ集録、およびデータベースを用いた解析の標準化 BM 骨髄細胞の異形成の変化に関連する最も関連性の高い表現型異常の同定できるようになります。したがって、適切な標識が、よく知られている形式 (自動人口区切り記号 (APS) 図、ヒストグラム、およびドット プロット) に基づく統計的に選択したサブセットがその後の分析で使用できる解析戦略を開発するため必要丸めます。MDS の堅牢な表現型異常の発見とせず最小限の形態学的異形成や細胞遺伝学的 aberrancies なしの場合診断も和らぐ。肺浸潤パネルの削減を可能にする差別のパラメーターの同定可能性があります、現在スコア²、臨床病理学研究室で彼らの適用性を許可を簡略化します。

このメソッドは、MDS の診断³で通知されて、フローサイトメトリー データの主観的な解釈を制限します。この手順は、処理・解析の流れデータ⁴自動化ツールの開発のための前提条件です。

MDS は、スプライソソームの突然変異が MDS 表現型をもたらす特定のエピジェネティックな修飾子と協力して造血幹細胞 (HSC) 無秩序の異質グループで構成されます。それは今、HSC の突然変異と他のメカニズム異常免疫炎症や悪性造血と BM の間質の微小環境の相互作用など、MDS の病態に関与している知られています。しかし、これらのメカニズムは不十分な理解まま。MDS の広い臨床的および生物学的多様性は、挑戦診断と最適な治療法の選択を作る。過去 10 年間で複数の研究を示している MFC はしばしばより多くである異形成²形態、しかし技術的、経済的制約の検出に敏感な多くの場合異なります結果と標準化が困難なこの手法を作る、³通訳の経験。また、わかりにくい方法 MFC ができる他の非クローン BM から MDS に向かってバランス、細胞遺伝学的異常の有無や境界例低爆発カウント hypocellular MDS などの最小限の形態学的異形成の有無の場合での先端骨髄障害など障害 (すなわち。、再生不良性貧血)。それはまた急性骨髄性白血病 (AML) から爆発の過剰な MDS のボーダーラインのケースを区別することは困難に残る。これらのすべての理由から、臨床ガイドラインは MFC の MDS の最終的な診断テストを統合できません。2011 年、米国国立総合がんネットワーク (NCCN) では、CD34 陽性細胞の割合、発作性夜間血色素尿症クローンの検出と hypocellular MDS⁵の細胞傷害性 T 細胞クローンの存在の推定の MFC をお勧めします。臨床データは、免疫抑制療法⁶にこれらの患者の良い反応を示されているので、これら 2 つの後者の状況は治療目標も含まれます。国際作業グループ (IWG) 勧告を引用して 2017 の NCCN のガイドラインには、MDS の診断のため、任意の仕様⁶をすることがなく、共同の条件間で MFC による異常診療検出が一覧表示されます。さらに、最近公開された WHO 分類は MFC 所見だけでは決定的な形態学的・細胞遺伝学的データ⁷の不在で MDS の第一次診断を確立するのに十分でないことを定めています。ただし、MFC は成熟パターンの骨髄球系細胞の調節不全を示し、患者の病気の経過で特定の時間に通常からの「距離」を定量化追加テストとして使用できます。

このメソッドは、臨床研究所データシートまたは異形成異常とその他の骨髄性疾患の診断を絞り込むために MFC 診療を使用して BM 骨髄細胞の異形成の評価に興味を持って適用されます。

プロトコル

下記プロトコルは、「Comité デ保護デ Personnes」(独立倫理委員会) によって承認されている大学病院のサンテティエンヌ フランスのシュド ・ エスト 1。

1. Cytometer 設定

注: cytometer 設定はフランス流の推奨事項、EuroFlow に従って"EuroFlow 標準オペレーティング (SOP) のプロトコル設定や補償 (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php) に従って行われました。

1. 毎月の機器設定
   1. Cytometer を入れます。すべての流体レベルを適切かつオープン歌姫 6.1.3 ことを確認します。流体工学のスタートアップを実行: メニュー バーでを選択 ' の Cytometer |流体工学スタートアップ '。[OK]が表示されたらクリックします。少なくとも 30 分間のウォーム アップに cytometer を許可します。
   2. パフォーマンス チェック - CST ビーズ
      注: この手順で、12 75 mm ポリスチレン管、CST ビーズとシース液 (材料の表を参照) を準備します。
      1. 12 × 75 mm²ポリスチレン管のラベル 'CST'。穏やかな反転または非常に穏やかなボルテックスによって提供されたビーズ バイアルをミックスします。ラベル付きのチューブに追加: 0.35 mL シース液と CST ビーズの 1 滴。渦管優しくし買収に進みます。すぐに身につけていない場合、暗闇の中で 2-25 ° C で 8 h までのチューブを格納します。
      2. パフォーマンス チェックを実行: メニュー バーでを選択 ' の Cytometer |CST'。
      3. CST モジュールの'設定'タブで: 既定の 2 v 4-2 H 構成のようにカント II を確認し、またこの構成の CST ビーズの現在のロットを使用して作成した基準が存在することを確認します。ベースラインが存在しない場合は、CST ビーズ IFU を参照してください。この基準の有効期限が切れていないことを確認: [ 'セットアップ コントロールドロップダウン ・ メニューから' チェック パフォーマンス 'を選択します。
      4. '手動でチューブをロード'し'実行'をクリックします。ロット番号が表示されるを確認します。優しく渦希薄ビーズ上準備とされたら、希釈のビーズを読み込み、 'OK'をクリックします。
      5. パフォーマンス チェックが完了したら、Cytometer パフォーマンスが渡されることを確認します。レポートを表示]をクリックします。結果が通過しなかった場合、性能チェックを再実行します。パフォーマンス追跡レポートの日付で PDF 形式でレポートを保存します。
   3. '蛍光 PMT 電圧'虹ビーズ (資材表) を調整します。
      注: ターゲット値は"20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads"と題する Euroflow 標準操作手順 (SOP) を規定しています。この SOP は Euroflow サイト (公共エリアで www.euroflow.org; で利用可能です。[プロトコル] タブ)。
      1. 経由で新しいテストを作成 ' 毎月計測器セットアップ デート |供試体 '。
      2. '、光学パラメーターと螢管関係 (FITC、PE、PerCPCy5.5、PE Cy7、APC、APC H7、V450、V500) に対応するを選択し、目的のアクイジション ・ パラメーターをチェック (ログ、A、H または W)。(実験のCytometer 設定の右クリック) 現在の CST 設定を適用します。10,000 で FSC パラメーターのしきい値を設定します。
      3. Cytometer で補正をオフに蛍光 PMT 電圧ターゲット MFI の設定を設定中この目的のため'の検査'に行く、オフ' を有効にする補正」オプション無効にする補償'報酬'タブに移動します。
      4. すべての必要なドット プロットとワークシート' ターゲット MFI'を作成する (n = 2;SSC は、FITC と PE と FSC)、ヒストグラム (n = 各蛍光検出器のための 8; 1 つのヒストグラム) と蛍光チャネルごとにピーク値 (MFI と CV) の参照を示す統計。
      5. 8 ピーク虹ビーズ キャリブレーション粒子を 1 mL の蒸留水と使用前に渦の 1 滴を希釈します。'低'流量にピーク 8 虹ビーズ ソリューションを記録せずに取得します。すぐに身につけていない場合、暗闇の中で 2-25 ° C で 8 h までのチューブを格納します。
      6. ゲート一重項ビーズ対 SSC 2 変量ドット プロット fsc ' 人口 P1'と対 PE 2 変量ドット プロット FITC で 8 または 7 のピーク (明るいピークまたは次の 1 つ下、権利を"20180302_7th_ Euroflow 文書に規定Peak_Target_Values_Rainbow_Beads") と人口 P2 この門の名前します。
      7. 8 ピーク虹ビーズ懸濁液の買収を続行し、Euroflow ドキュメント"20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads"によるとターゲット MFI の値に到達するための蛍光管内 PMT 電圧を調整します。
      8. ターゲット MFI 8 または 7 のピーク値に達すると、一度達成したターゲット MFI と対応する最終的な PMT 値を記録します。5,000 イベントを取得し、データを記録します。
         注: は、ステップ 1.2.3 (パフォーマンス チェック - 虹ビーズ PMT 値の確認) で下使用、PMT 値する必要があります。
      9. ワークシート' ターゲット MFI'と楽器の設定画面し、.jpg 画像を付けて印刷するこれらの値を記録します。
         注:「新しい」のチューブが作成されると、PMT 値変わる可能性がありますが予期せず。このため、PMT のダブル チェックは不可欠です。たびにあなたのノート、 ' ターゲット MFI'値と PMT の値が正しいことを再確認する PMT 値を比較!
      10. 「アプリケーション設定」を保存します。ブラウザーで「Cytometer 設定」を右クリックします。ドロップ ダウン メニューから「アプリケーション設定」を選択し保存します。「OK」をクリックします。メッセージが表示されたらは、しきい値の値を維持するために [はい] をクリックします。
          注: は、既定の名前を使用してアプリケーション設定を保存します。設定は変更されません。
   4. 分離洗浄血 (LWB) で'FCS'と'SSC 電圧」を調整します。
      注: この手順で、健康なボランティア、溶解ソリューション (材料表) と洗浄液から末梢血 (PB) サンプルを 50 μ l 添加が必要です。
      1. Pipets 50 μ L PB の管に。たて希釈溶解液 2 mL を加えます。穏やかに混合し、室温 10 分間インキュベート
      2. 540 x gで 5 分間遠心します。
      3. 上清を吸引管で約 50 μ L 残気量を残して、細胞ペレットを乱すことがなく。穏やかに混合し、フィルター洗浄溶液 2 mL を追加します。
      4. 540 x gで 5 分間遠心します。
      5. もう一度手順 1.1.4.3–1.1.4.4 を繰り返します。
      6. フィルター洗浄バッファーの 250 μ L を加え、優しく混ぜます。
      7. 虹ビーズ獲得のため作成された実験では、新しいを作成する ' 標本 |新しいワークシート ': 双方向パラメトリック SSC A/FSC のグラフを描け。
      8. セルを取得、対 SSC 2 変量ドット プロット FSC でリンパ球をゲートし、ゲートのリンパ球の人口の次の平均目標値に到達する FSC と SSC の電圧調整: FSC: 55,000 (50,000-60,000 の範囲) と SSC: 13,000 (11,000 –15,000 の範囲)。
      9. 取得し、約 10,000 のイベントを使用してデータを記録します。ゲートのリンパ球の平均 FSC と SSC ターゲット値を確認します。必要な場合は、FSC と SSC の電圧を調整してください。
      10. 画面を印刷し、取得するターゲット チャンネルの値の印刷を格納します。
   5. 蛍光補正の設定。
      メモ: 単一染色補正制御をターゲット MFI の設定後設定する必要がありますおよび FSC/SSC 設定が確立されています。このステップでは、健康なボランティア、補償粒子 (材料表) から PB ソリューションを溶解、洗浄バッファーが必要です。蛍光色素標識された抗体試薬蛍光補償行列とその参照の人口をセットアップするために使用の一覧を表 1に示します。
      1. 蛍光補正の設定で使用する試薬ごとの 1 つの管のラベル (FITC、PE、PerCPCy5.5、APC、V450、V500、PECy7 - CD117、APC H7 - cd 10、APC H7 - CD14 と APC H7 - CD71) と「空白/無染色」のチューブ。
      2. ピペット 50 μ L PB 各管にまたは「負の」補償粒子の + 補正制御管の「肯定的」補償粒子の 1 滴 1 滴の表 1に上で示されます。
      3. チューブに抗体試薬の適切な量を追加します。チューブあたり 100 μ L の最終巻に到達し、穏やかに混合フィルター洗浄バッファーを追加します。常温、光から保護されて 15 分間インキュベートします。
      4. セルと管でのみたて希釈溶解液 2 mL を加え、優しく混ぜます。光から保護された RT で 10 分間インキュベートします。
      5. 540 x gで 5 分間遠心します。
      6. 各管で約 50 μ L の残量を残して細胞ペレットを乱すことがなく、上清を吸引します。優しく混ぜます。フィルター洗浄液 2 mL を追加します。
      7. 540 x gで 5 分間遠心します。
      8. 各管で約 50 μ L の残量を残して細胞ペレットを乱すことがなく、上清を吸引します。チューブあたり 250 μ L の最終巻に到達し、穏やかに混合フィルター洗浄バッファーを追加します。
      9. 補正コントロールを作成します。
         1. メニュー バーで、テスト虹ビーズ集録の作成を選択します。新しいを作成する ' 標本 |補償セットアップ |補正コントロールを作成。
         2. 表示されたダイアログ ボックスで'含める別の無染色コントロール チューブ/ウェル'チェック ボックスを選択します。FITC、PE、PerCPCy5.5、APC、HV450、HV500 の一般的な補償 (ラベルに固有ではない) コントロールを作成します。PE-Cy7-CD117、APC H7 - cd 10、APC H7 - CD14 と APC H7 - CD71 のラベル固有補正コントロールを作成します。「OK」をクリックします。
         3. 新しいワークシートで双方向パラメトリック SSC A/FSC のグラフを作成し、リンパ球 (P1) と各管で検出されると陽性ピークの P2 ゲートを描く螢光色素に対応するヒストグラムにゲート。無染色制御管を除いて、P2 のイベント数を視覚化する階層 (グラフと選択' を示す人口階層」の右クリック) を表示します。
         4. ブラウザーで補正コントロール試料を展開します。
         5. 渦無染色の細胞に備えて、上記 3-5 s. インストールの cytometer で準備無染色細胞。流量調整 '媒体' 「取得データ」をクリック。FSC A 対 SSC のドット プロットでリンパ球の人口を完全に包含する P1 ゲートを調整します。P1 ゲートを右クリックします。すべて補正コントロールに適用]を選択します。
         6. '買収'ダッシュ ボードからをクリックして 'レコード データ' 5,000 イベントを取得します。すべてのシングル カラー染色コントロール細胞 P2 間隔ゲートが肯定的な人口を包含することを確認します。
         7. PE Cy7 APCH7 管のヒストグラムに P3 間隔ゲートを追加し、負の人口を包含して P2 が肯定的な人口を包含します。
         8. 賠償額を計算します。メニュー バーからを選択 ' 実験 |補償セットアップ |賠償額を計算 '。補償行列の名前: 「補正日」。「リンクと保存」を選択します。
         9. カタログ アプリケーション設定に補償行列を保存: をクリックして 'の Cytometer 設定 |アプリケーションの設定 |保存 '、補償行列「補正日」の名前、 OKをクリックしますします。
         10. ブラウザーで「Cytometer 設定」をクリックしてします。インスペクターで、右下に『 報酬 』タブをクリックして印刷に移動します。
             注: この情報は、カタログからも取得することができます。
         11. 補償行列の制御。
             1. 1 つの管ですべての単一のステンド グラス チューブをミックス (選択の APCH7)。
             2. の新しい標本を追加'報酬確認日付'] という新しいテストを作成、この実験のCytometer 設定]を右クリックして「リンク |リンクを解除 |アプリケーション設定 ' 1.1.3.10 の手順で保存します。新しい設定でこのチューブから 50,000 イベントを取得します。
             3. 新しいグローバル ワークシートを適用します。1 ドット プロット FSC/SSC-A を作成し、リンパ球を視覚化するゲートを描画と n × (n-1)/2 の他のプロットが 2 つのパラメーターを可視化するリンパ球ゲートに焦点を当てた。
2. 毎日の計測セットアップ
   1. Cytometer を入れます。すべての流体レベルを適切かつオープン歌姫 6.1.3 ことを確認します。流体工学のスタートアップを実行: メニュー バーでを選択 ' の Cytometer |流体工学スタートアップ '。[OK]が表示されたらクリックします。少なくとも 30 分間のウォーム アップに cytometer を許可します。
   2. パフォーマンス チェック - CST ビーズ: 繰り返し手順 1.1.2.1–1.1.2.5。
   3. パフォーマンスを確認する-虹ビーズ PMT 値の確認。
      1. 「虹ビーズ」としてポリスチレン管ラベル付けるし、ロット番号が使用中のものであることを確認します。虹ビーズ バイアルを徹底的に混ぜます。虹ビーズを準備、蒸留水か脱イオン水 1 mL に 1 滴虹ビーズを追加します。光から保護します。
         注: 取得に進むか、取得まで 2-8 ° C でチューブを格納します。
      2. 新しいテストを作成: 「虹ビーズ日付」.
      3. 補償をリンク: ' Cytometer 設定]を右クリックして、 「リンク設定」を選択、1.1.5.9.9 の手順で作成した適切な補償行列を選択、 「上書き」を選択します。
      4. 補正を解除: 「Cytometer 設定」を右クリックして、 '以前リンクされていたセットアップからリンクを解除'を選択、 'OK'をクリックしますします。
      5. 'アプリケーション設定 ': ' Cytometer 設定]を右クリックして、 「アプリケーションの設定」を選択、毎月セットアップ手順 1.1.3.10 で作成した設定を適用、選択 '補正値を維持'。
      6. '補償を有効にする]の選択を解除します。
      7. 虹ビーズのワークシート テンプレートを使用して実験の新しい標本を作成します。'低'の取得にチューブを取得します。
      8. ビーズ買収時に一重項ビーズ人口だけを含むように P1 ゲートを調整します。一重項ビーズ人口だけを含むように FITC A/PE のドット プロットに P2 ゲートを調整します。10,000 のイベントを記録します。
      9. MFI と P2 人口 CV 値では、プロトコルの定義済みのターゲットを確認します。それ以外の場合、cytometer を洗浄し、再び操作を開始します。PDF 形式のレポートを保存します。

2. BM サンプル準備

注: は、細胞の染色手順の直前にプロトコルを洗浄を実行します。

1. 15 mL 遠心管に主なサンプルの 600 μ L をピペットします。
2. 洗浄液 10 mL を追加 (PBS + 0.5 %bsa [> 98% の純粋な BSA] + 0.09% ナン₃フィルタ リング ソリューション、pH 7.4)。ピペットを使用して細胞懸濁液を混ぜます。
3. 540 x g (洗浄 1) で 5 分間遠心します。細胞ペレットを乱すことがなく上澄みを廃棄します。
4. 手順 2.2 – 2.3 (2 洗浄) を繰り返します。
5. 400 μ L の洗浄液で細胞ペレットを中断します。
6. バックボーンのマーカーの染色。FACS 解析、患者データと「バックボーン」識別用ポリプロピレン チューブにバックボーン抗体の全体ボリュームを転送します。洗浄サンプル (パネルのすべての管を満たすために必要な洗浄のサンプルのボリューム) の 350 μ L を追加します。ピペットを使用してよく混ぜます。
   注: は、バックボーン抗体染色 (表 2に示すように)、表面膜の総量を計算します。
7. FACS 解析、患者データと「数 1 チューブ」と特定される 3 ポリプロピレン チューブにサンプル バックボーン ミックス同量をピペット"チューブ番号 3」。必要に応じて、チューブあたり 200 μ L の最終的なボリュームに達するまでに洗浄バッファーを使用します。
   注意:; 管の壁にサンプルの痕跡を残していないに注意してください。それ以外の場合、これらの細胞は汚れていません。必要に応じて、渦セルと遠心チューブ。
8. 各管内で指定したテーブル 2(バックボーン マーカー) を除くセル表面のマーカーに対する抗体の適切な量を追加します。ピペットを使用してよく混ぜます。光から保護された RT で 30 分間インキュベートします。
9. ソリューションを溶解 2 mL を追加します。ピペットを使用してよく混ぜます。光から保護された RT で 10 分間インキュベートします。
10. 540 x gで 5 分間遠心します。各管で約 50 μ L 残気量を残して、細胞ペレットを乱すことがなく上澄みを廃棄します。ピペットを使用してよく混ぜます。
11. 洗浄液細胞ペレットに 2 mL を追加します。ピペットを使用してよく混ぜます。
12. 2.10-2.11 (2 洗浄) の手順を繰り返します。
13. 540 x gで 5 分間遠心します。細胞ペレットを乱すことがなく上澄みを廃棄し、再細胞ペレットを 200 μ L の PBS で中断します。ピペットを使用してよく混ぜます。
14. 4 ° c で 1 h 以上まで流れの cytometer で測定のための光から保護保存または好ましくは、染色後すぐにセルを取得します。

3. データ集録

1. 歌姫ソフトウェアで新しい実験を開き、名、日付とサンプルの種類に応じて名前を変更します。
2. 3 本のチューブを含む新しい標本を作成します。各チューブに使用される抗体実験レイアウトで指定します。
3. ' Cytometer 設定を右クリックして「アプリケーション設定」を選択し、毎月セットアップ (ステップ 1.1.3.10) で取得した値を適用。
4. 新しいグローバル ワークシートを開くし、ドット プロットを作成する: SSC A/FSC A、SSC の/CD45 HV500 A、SSC の/FITC A、SSC の/PE A、SSC の/CD34 PerCP Cy5.5、SSC の/CD117-PECy7-A、SSC の/APC A、SSC の/APCH7 A、SSC の/HLA DR HV450 ASSC/A FSC ドット プロットで一重項セルを選択するゲートを作成します。SSC-A/CD45-BV500-A ドット プロットで 4 個体を選択するゲートを作成: 顆粒球、単球、芽球、リンパ球。以前作成したドット プロットでこれらの集団をプロジェクトします。
5. 手順 1.1.5.9.11.3 に記載された補償制御のための新しいグローバル ワークシートを作成します。
6. 'MEDIUM'獲得と 500,000 レコード イベント/チューブにチューブを取得します。テクニカル検証 (補償・適切な染色の評価) 後に、、FCS3.0 ファイルとしてデータをエクスポートします。

4. データ解析

注: 健常者と造血疾患の兆候なく個人から使用されるファイルのとおり通常の BM データベースを構築するには、Neutrophils_NM の 18 のファイルから 11 データベース、Monocytes_NM データベースのファイルを 18 18 から 14 から 10NRC_NM データベースのファイル。ファイルは破棄代表結果] セクションに記載されている様々 な技術的な問題を示した。ファイルを個別に好中球系統 (プロファイル Neutrophils_Maturation.inp)図 2 を図 1 a(1-3)で描かれている様々 な戦略に適合した Infinicyt ソフトウェア (資材表) を使用して行った Aの単球系譜 (プロファイル Monocytes_Maturation.inp) と図 3赤芽球系細胞系譜 (プロファイル NRC_Maturation.inp) のA(1-2) 。

1. 好中球の解析の戦略 -Neutrophils_NM データベース構築
   1. CD34 陽性好中球コミット爆発 cd34 CD117 + %HLADR + 低 cd 10-CD13 + CD11b-イベント (図 1A.1) を選択できる 7 つの門の交差点を使用してを特定します。人口階層ツリー内で「好中球」タブこれらイベントを割り当て、その後残りのイベント (グレー) の表示 (青色で描かれている) これら細胞を除去するためにこのタブをオフします。
   2. CD117 + CD34-CD13 + CD11b-%HLADR +図 1A(2)に描かれている六つの門の交差点を使用して低好中球前駆細胞を分離し、 「好中球」タブに割り当てます。
   3. CD45dim SSCint こんにちは CD117-%HLADR-細胞の差別と「好中球」タブへの割り当てを可能にする 4 つの門の交差点を使用してより成熟した好中球を識別します。
   4. 好中球のみを表示、したまま、残りのイベントは、をクリックしてこの集団をエクスポート チェック ボックスをオフ ' ファイル |エクスポート 'とすべての必須パラメーターがチェックされ、FCS ファイルとしてデータを保存するを確認します。
   5. すべてのエクスポートされた FCS ファイルから成る結合ファイル、各サブポピュレーションのマーカーの発現の強さを評価することによって品質チェックを実行します。APS を使用して各ファイルの中央分離帯と示すように、各サブポピュレーションの SD 曲線のプロットを削除 (代表結果セクションで詳細を参照してください) 2SD 曲線外ケース (図 1B)。
   6. 「好中球」表示と生成された構成ファイルで APS 図 (左図 1C ) に成熟経路を描画し、.cyt ファイルとして保存します。
      注: 成熟図の比較は、正規化されたデータベースに対して表される Neutrophils_NM データベースに含まれるすべてのファイルからすべてのパラメーターの可視化を使用できます。図 2C右側には、「図は、Neutrophils_NM データベース内すべてファイルが含まれていることを示しています (n = 11) 2 に適合 SD グループの中央値と比較します。
2. 単球 - Monocytes_NM データベース構築の解析の戦略
   1. 単球系細胞を識別する (CD117 CD64 +/+ こんにちは %HLADR + こんにちは) 4 つのゲート (図 2A) の交差部分を使用して。人口階層ツリー内で'Monocytic'タブにこれらのイベントを割り当てます。
   2. 単球細胞のみを表示、したまま、残りのイベントは、をクリックしてこの集団をエクスポート チェック ボックスをオフ ' ファイル |エクスポート 'とすべての必須パラメーターがチェックされ、FCS ファイルとしてデータを保存するを確認します。
   3. マージされたファイルは、すべてのエクスポートされた FCS ファイルから成るでそれぞれの亜種のためのマーカーの発現の強さを評価して品質チェックを実行し、2SD 曲線 (代表結果] セクションに詳細) 外ケースを削除 (図 2B)。
   4. 結果ファイル"Monocytic"セル表示で、APS 図 (図 2C左) に成熟経路を描画し、これを .cyt ファイルとして保存します。
      注: 成熟図の比較は、正規化されたデータベースに対して表される Monocytes_NM データベースに含まれるすべてのファイルからすべてのパラメーターの可視化を使用できます。図 2C右側には、「図は、Monocytes_NM データベース内すべてファイルが含まれていることを示しています (n = 10) 2 に適合 SD グループの中央値と比較します。
3. 有核赤血球 (NRCs) - NRC_NM データベース構築の解析の戦略
   1. Cd34 cd34 CD117 + %HLADR + 低 CD105 + CD33-CD36 + CD71 + イベント (図 3A(1)) の選択できる 7 つの門の交差点を使用してコミット赤芽球爆発を識別します。これらのイベントを人口階層ツリー内で「NRC」タブに割り当てると (グレー) の残りのイベントの表示から (赤で表示)、これらの細胞を除去するためにこのタブをオフ。
   2. 成熟した NRCs CD45 の差別を許可する 4 つの門の交差点を使用してを識別する/SSClow CD36 を薄暗い + + こんにちは CD71 + こんにちは CD105 +/-細胞します。「NRC」タブ (図 3A(2)) にこれらのイベントを割り当てます。血小板 (CD36 + こんにちは SSClow 細胞) NRC 人口 (図 3A(2)) から削除する必要があります。
   3. NRC のセルだけを表示、したまま、残りのイベントは、をクリックしてこの人口をエクスポート チェック ボックスをオフ ' ファイル |エクスポート 'とすべての必須パラメーターがチェックされ、FCS ファイルとしてデータを保存するを確認します。
   4. マージされたファイルは、すべてのエクスポートされた FCS ファイルから成るで 2SD 曲線 (代表結果セクションで詳細を参照してください) (外ケースの除去に続いて、各サブポピュレーションのマーカーの発現の強さを評価することによって品質チェックを実行します。図 3B)。
   5. 「NRC」セル表示で生成されたファイルで APS 図 (図 3C、左) に成熟経路を描画し、.cyt ファイルとして保存します。
      注: 成熟図の比較は、正規化されたデータベースに対して表される NRC_NM データベースに含まれるすべてのファイルからすべてのパラメーターの可視化を使用できます。図 3C右側には、図 NRC_NM データベース内のすべてのファイルが含まれていることを示しています (n = 14) 2 に合う SD グループの中央値と比較します。
4. BM 骨髄コンパートメント成熟データベースを使用しての成熟の評価
   1. 興味の系列に対応する .cyt ファイルを開く(すなわち.、系統の好中球、単球性系統の Monocytes_NM_GMFF.cyt と赤芽球系列の NRCs_NM_GMFF.cyt の Neutrophils_NM_GMFF.cyt)。
   2. 興味の系列に対応するタブの下'成熟'タブを右クリックして (' 好中球 |単球性 |NRC') と成熟成熟にデータベースを保存します。
   3. 新しい FCS ファイルを開くし、前述の分析 (好中球、単球細胞のステップ 4.2.1 のため 4.1.1–4.1.3 のステップし、NRC のため 4.3.1–4.3.2 のステップ)。
   4. 興味の人口のための成熟経路を描画します。
   5. 対応するデータベース'ツール' ] タブ (データベース解析) で開き、対応する成熟データベースで分析する人口を比較します。利用可能なデータベースとの互換性のデータをチェック: 完全な互換性 (緑色の三角形);ほとんどの場合不一致パラメーター (黄色の三角形); 名前の部分的な互換性非互換性 (赤い三角形)。
   6. 互換または部分的な互換データは、ソフトウェアは' 正規化成熟の違いの図を作成します。視覚化して'パラメーター バンドの成熟の違い'、 'ダイアグラム'タブで新しいダイアグラムを開く、 '成熟'をクリックしてが表示されます、] をクリックしてパラメーターの数を選択、 '[ok]'とダイアグラムが表示されます。右クリック、図変更は、データの可視化、可視化データベースと成熟ダイアグラムの視覚エフェクトで行うことができます。
   7. 新しいファイルとデータベースに含まれるデータの間の相違の大きさを可視化、構成ズーム (成熟の相違点を正規化 'を右クリックし、 「ズーム」を適用)。

結果

K-EDTA 血液凝固阻止剤で収穫された 54 の BM サンプルは研究に含まれていた。MFC データは、患者についての情報のない状態で分析されました。BM のサンプルを (男性 5 と 47.4 [35-48] の年齢の中央値と 2 人の女性、(8 男女 57.9 [35-72] の年齢の中央値で 3 名) 造血疾患の証拠と 11 個人や様々 な 36 例 7 の健康なドナーから示した回顧的研究 病理学の条件: 1 ケース貧血と貧血?...

ディスカッション

BM 吸引の質が最終的な結果に影響を与えます。BM 吸引の希釈は、前駆細胞の不在のための成熟のさまざまな段階で細胞や前駆体細胞の分布をゆがめる可能性があります。おそらく大量に溶解法を用いた流れのフローサイトメトリーによる解析で希釈の BM 吸引の正規化で助けるかもしれない。また、フローサイトメトリーによる BM 骨髄異形成の評価のための重要なステップはサンプル処理や?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCanto II flow-cytometer	BD Biosciences, CA, USA	SN: V33896301336	3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuge	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; Model No: 320002001	low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes
Pipetts of 10µL and 200µL
Pasteur pipettes
15 mL Falcon tubes
polypropylene tube for FACS
Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777	clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406	clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, CA, USA	333143	clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, CA, USA	641394	clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD33		345800	clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Lysing Solution 10x Concentrate (IVD)	BD Biosciences, CA, USA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS&T IVD beads	BD Biosciences, CA, USA	656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS	Cytognos, Salamanca, Spain	SPH-RCP-30-5A	lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
Phosphate buffered saline tablets	R&D Systems, Minneapolis, USA	5564
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, France	A9647
Sodium azide 99%	Sigma-Aldrich, France	199931
Infinicyt software version 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Spain