Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نحن بالتفصيل طريقة لتصوير الخلايا الحية للرقابة الخاضعة للتنظيم. ويستخدم هذا الأسلوب فيتك-ديكستران، التي تتراكم في العضيات يحلول المتصلة، كمراسل. كما يسمح هذا الأسلوب البسيط التمييز بين أنماط مختلفة من الرقابة الخاضعة للتنظيم في الخلايا التي يصعب التلاعب وراثيا.

Abstract

ينظم الرقابة هي عملية الذي هو الإفراج عن البضائع، التي يتم تخزينها في الحبيبات الافرازية (SGs)، استجابة لمشغل افرازية. ينظم الرقابة الأساسية للاتصال بين الخلايا وآلية رئيسية لإفراز العصبية والهرمونات، ووسطاء التهابات وغيرها من المركبات، من مجموعة متنوعة من الخلايا. معروفة على الأقل ثلاث آليات متميزة لتنظيم الرقابة: الرقابة الكاملة، حيث الصمامات سان جرمان واحدة تماما مع غشاء البلازما، قبله وتشغيل الرقابة، حيث الصمامات سان جرمان واحد عابر مع غشاء البلازما، ومجمع الرقابة، أين SGs عدة تلتحم مع بعضها البعض، قبل أو بعد الانصهار سان جرمان مع غشاء البلازما. النوع من التنظيم الرقابة التي يضطلع بها خلية غالباً ما تمليه نوع المشغل الافرازية. ومع ذلك، في العديد من الخلايا، مشغل افرازية واحدة يمكن تنشيط وسائط متعددة من الرقابة الخاضعة للتنظيم في وقت واحد. رغم وفرة وأهمية عبر أنواع الخلايا والأنواع، الآليات التي تحدد أنماط مختلفة من إفراز دون حل إلى حد كبير. واحدة من التحديات الرئيسية التي تواجه في التحقيق في أوضاع مختلفة للرقابة الخاضعة للتنظيم، هو الصعوبة في التمييز بينهما، فضلا عن استكشاف لهم بشكل منفصل. هنا يصف لنا استخدام fluorescein isothiocyanate (فيتك)-ديكستران كمراسل الرقابة، والخلية الحية التصوير، وتفرق بين مسارات مختلفة للرقابة الخاضعة للتنظيم، مع التركيز على مجمع الرقابة، استناداً إلى مدى متانة و المدة للأحداث التي وقعت في اكسوسيتيك.

Introduction

ينظم الرقابة هو الآلية الرئيسية التي الإفراج عن البضائع بسهولة من خلية افرازية ردا على مشغل معين. البضائع قبل تشكيلها والمحتبس في الحويصلات الافرازية، الذي يتم تخزينه حتى مشغل التبديلات إشارة للإفراج عن محتوى SGs. ينتج أنواع مختلفة من إشارات في أوضاع مختلفة للرقابة الخاضعة للتنظيم، أو قد تحدث أوضاع مختلفة للرقابة الخاضعة للتنظيم في وقت واحد. يعرف ثلاث طرق رئيسية لتنظيم الرقابة: الرقابة الكاملة، الذي ينطوي على الانصهار الكامل من الحبيبية الافرازية واحد مع غشاء البلازما؛ قبله تديره والرقابة، الذي ينطوي على الانصهار عابر الحبيبية الافرازية مع غشاء بلازما تليها إعادة تدويرها؛ ومجمع الرقابة، التي تتسم بالانصهار هوموتيبيك عدة من قبل شركة SGs (أي، الرقابة مولتيجرانولار) أو متسلسلة (أي، الرقابة التسلسلية) إلى الانصهار مع غشاء البلازما1. مجمع الرقابة يعتبر الوضع الأكثر شمولاً لشحن الإصدار2، كما أنه يسمح لإفراز سريع لنقل البضائع، بما في ذلك من شركة SGs التي تقع القاصي من غشاء البلازما. وقد تم توثيق الرقابة المركبة في كل خلايا إفرازات والغدد الصماء3،4،5،6،7،،من89، وكذلك في الخلايا المناعية. في الخلايا المناعية، مثل الحمضات10،،من1112 والعدلات13، يسمح الرقابة مركبة إطلاق سراح سريعة وقوية من الوسطاء المطلوبة لقتل مسببات الأمراض الغازية مثل البكتيريا أو الطفيليات. نشر خلايا ماست (MCs) الرقابة مجمع للإفراج عن كفاءة الوسطاء التحريضية المخزنة مسبقاً خلال الاستجابات المناعية الفطرية والحساسية المفرطة، وأخرى الحساسية14،،من1516 , 17-نظراً لأوضاع مختلفة للرقابة يمكن أن تحدث في نفس الوقت18،19، فقد أصبح يشكل تحديا للتمييز بينهما في الوقت الحقيقي أو لتحديد آلياتها الانصهار كل منهما، ومن ثم توضيح آلياتها الأساسية.

نقدم هنا أسلوب، يقوم على خلية حية تحميل تصوير الخلية فيتك-ديكستران، الذي يسمح بتتبع الوقت الحقيقي للأحداث اكسوسيتيك والتمييز بين أساليب مختلفة. على وجه الخصوص، لدينا أسلوب يسمح رصد الرقابة مجمع الخالصة.

فيتك-ديكستران هو المتقارن من فلوروفوري حساسة لدرجة الحموضة فيتك مع ديكستران السكاريد غلوكان. ديكسترانس المسمى فلوريسسينتلي تبين أن إدخال الخلية ميكروبينوسيتوسيس20،21 وماكروبينوسيتوسيس،من2223. المقصورات اندوسيتيك الناضجة في lysosomes، قد ثبت أن فيتك-ديكستران يتراكم في يحلول مع لا تدهور واضح. ومع ذلك، منذ فيتك fluorophore جداً حساسة لدرجة الحموضة24، والتجويف يحلول الحمضية، يروي fluorescence فيتك-ديكستران عند بلوغ يحلول24. وبالتالي، إنشاء ديكسترانس كما يحلول استهداف البضائع، جنبا إلى جنب مع حساسية الأس الهيدروجيني فيتك، قد أرست الأساس لاستخدام فيتك-ديكستران في الدراسات يحلول الرقابة25،،من2627 , 28 , 29.

في العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك الإشراف، العَدلات، الحمضات، والخلايا cytotoxic T، والأجسام الصباغية، وغيرها، SGs عرض ميزات الليزوزومية، وتصنف على أنها ذات الصلة يحلول العضيات (لروس) أو lysosomes الافرازية30،31 . نظراً لروس درجة حموضة لومينال حمضية، يمكن استخدام فيتك-ديكستران لتصور هذه الرقابة، نتيجة لأعلى درجة الحموضة المرتبطة اكستيريوريزيشن من لروس. وفي الواقع، فيتك-ديكستران قد استخدمت لرصد الرقابة في الإشراف18،،من3233. في هذا الأسلوب، فيتك-ديكستران هو إضافة إلى ثقافة الخلية، تناولت بالخلايا pinocytosis وفرزها إلى شركة SGs. كما في ليسوسوميس، مروي fluorescence فيتك في شركة SGs عندما يكونون داخل الخلية. بيد عند الانصهار سان جرمان مع غشاء البلازما وما يترتب عليها من التعرض إلى الوسط الخارجي، يستعيد فيتك-ديكستران الأسفار كارتفاع درجة الحموضة سان جرمان، السماح بتتبع الأحداث اكسوسيتيك بسيطة بخلية حية مجهرية. هنا، علينا تعديل هذا الأسلوب لتمكين تعقب فريدة من مجمع الرقابة.

طريقتين أخرى استخدمت سابقا لتتبع الرقابة المركبة. المجهر الإلكتروني هو الطريقة الأولى تميز الهياكل اكسوسيتيك التي اقترح حدوث أوضاع مختلفة للرقابة. على وجه الخصوص، أدت الملاحظات "أنفاق الافرازية" في البنكرياس خلايا أسينار34 والإشراف35،،من3637 إلى فرضية الرقابة مجمع. ولكن بينما دقة عالية من المجهر الإلكتروني لديه القدرة على الكشف عن حويصلات تنصهر فيها، لا تتبع ديناميات على الانصهار وبالتالي يتعذر تحديد ما إذا كان أنها مطابقة للانصهار سان جرمان خلال الرقابة مركب أو مزيج من حبيبات أعيد القبض عليهم بعد الالتقام بهم. هو التغلب على هذه العقبة في الأساليب الأخرى التي يمكن قياس الرقابة في الخلايا الحية، مثل تصحيح المشبك القياسات لغشاء البلازما السعة11،13،،من3839 أو أمبيروميتري 40 لوسائل الإعلام. ومع ذلك، لقط التصحيح يتطلب مجموعة خاصة وقد لا تكون مناسبة لجميع أنواع الخلايا. قياسات أمبيروميتري قادرين على تتبع الرقابة إلا إذا أفرج عن الشحنة في مقربة جداً من مسرى. ولذلك، استخدام التصوير خلية يعيش يقدم ميزة على هذه الأساليب، كما أنه لا يسمح لتتبع الوقت الحقيقي للرقابة، لكنه يسمح أيضا للحصول على البيانات من الخلية كلها سريعة وبسيطة.

تتبع فيتك-ديكستران بخلية حية مجهرية كما يوفر بعض المزايا للخلية الحية الأخرى الأساليب المستندة إلى التصوير. على سبيل المثال، أسلوب مستخدمة على نطاق واسع انعكاس الداخلية مجموع الأسفار مجهرية (تيرفم) من الخلايا محملة بتحقيق سان جرمان فلورسنت أو التعبير عن فلورسنت البروتين معلم سان جرمان البضائع أو الغشاء بروتين26،41، 42 , 43-أن قوة هذا الأسلوب تكمن في قدرتها على رصد الأحداث التي تقع قريبا من غشاء البلازما (يشار إليها هنا "كالبصمة")، حصرا ومن ثم أحداث اكسوسيتيك. ومع ذلك، يرجع هذا أيضا العائق من هذا الأسلوب سوى جزء الخلية المجاورة كوفيرجلاس وقريبة من عدسة مجهر يمكن تصويرها44. فيما إذا كانت هذه البصمات تمثل الواقع على سطح غشاء الخلية كاملة من الجدل لا يزال45،،من4647. وفي هذا الصدد، يسمح باستخدام صبغة حساسة لدرجة الحموضة مثل ديكستران فيتك ومجهر الأسفار قياسية أو مجهر [كنفوكل] مع ثقب مفتوحة تصوير الخلية كلها، ومن ثم التقاط اكسوسيتيك مجموع الأحداث التي تحدث في تلك الخلية.

وتشمل الصحفيين حساسة لدرجة الحموضة الإضافية التي يتم استخدامها لدراسة الرقابة الخاضعة للتنظيم بتصوير كل خلية أو تيرفم سان جرمان البضائع أو بروتين غشائي سان جرمان تنصهر إلى فلورين، متغير بروتينات فلورية خضراء حساسة لدرجة حموضة. وتشمل أمثلة نبي-فلورين-β-هيكسوسيمينيداسي-فلورين، وفلورين سينابتو48،49،50،،من5152. وبينما قد تمثل التعبير عن هذه التحقيقات على نحو أوثق تكوين الذاتية SGs، تترتب عليها تعداء الخلايا، ولذلك قد تكون أقل ملاءمة للخلايا التي يصعب على ترانسفيكت. ولذلك، عند دراسة الخلايا التي يصعب ترانسفيكت أو تحت الظروف التجريبية التي تتطلب متعددة المعالجات الجينوم، استخدام مركب يمكن أن تستكمل ببساطة في مستنبت الخلية، مثل فيتك-ديكستران، من المفيد . فيتك-ديكستران كما يوفر ميزة على أكريديني البرتقالي (AO)، آخر صبغة حساسة لدرجة الحموضة التي تم استخدامها لتتبع الرقابة بخلية حية مجهرية53،54،،من5556 , 57 , 58-لقد ثبت AO للحث على التحلل حويصلات أن النتيجة في ومضات الزائفة، التي لا تتوافق مع إفراز الفعلية العمليات27. وفي المقابل، يعكس فيتك-ديكستران الأحداث إفراز أفضل، ربما بسبب انخفاض الإنتاج الناجم عن صور من الأكسجين التفاعلية27.

الجدير بالذكر نهج بديل لدراسة الرقابة عن طريق تتبع تدفق صبغة، من الوسط الخارجي إلى الأمين العام من خلال المسام الانصهار الذي يفتح خلال هذه العملية. وفي هذه الحالة، يتم إضافة الصبغة إلى الوسائط الخارجية جنبا إلى جنب مع المشغل الافرازية. ثم، عندما يفتح المسام الانصهار، ينشر الصبغة إلى59،سان جرمان60. ميزة واضحة من هذا الأسلوب أنه يوفر أيضا القدرة على تقدير حجم المسام الانصهار، باستخدام أصباغ حجم متغير. على سبيل المثال، يمكن استخدام ديكسترانس مختلفة الوزن الجزيئي (ميغاواط)، يضاف إلى فلوروفوريس مختلفة، الأصباغ خارج الخلية حيث أن تتوافق مع الحد الأقصى لحجم ديكستران التي يمكن أن تخترق سان جرمان حجم المسام الانصهار59، 61 , 62 , 63 , 64-وبالإضافة إلى ذلك، لا يتطلب هذا النهج استخدام مجس حساسة لدرجة الحموضة. ومع ذلك، عيب كبير أن إشارة إلى نسبة الضوضاء منخفضة جداً، نظراً لكمية كبيرة من صبغة موجود في وسائل الإعلام أثناء الحصول على الصور، أسفر عن خلفية عالية.

عموما، استخدام فيتك-ديكستران كعلامة للرقابة يتغلب على عيوب عدة أساليب سبق الإبلاغ عنها، مثل الإشارات الضجيج نسبة السمية والتعقب الدينامية والتعقيد.

هنا يصف لنا استخدام فيتك-ديكستران لرصد الرقابة مجمع في السطر 3 الصاري خلية ربل-2 ح (هذه الوثيقة المشار إليها ربل، المنشأة أساسا بواسطة اكليستون et al. 65 واستنساخ المزيد من بارسوميان وآخرون 66)، ردا على الغلوبولين المناعي ه (IgE)/التنشيط مستضد (Ag).

Protocol

1-الأعمال التحضيرية

  1. إعداد وسائط الثقافة ربل
    1. تعديل مزيج 500 مل من السكر منخفض دولبيكو المتوسطة النسر (دميم) مع 56 مل مصل البقري الجنين (FBS)، 5.5 مل من محلول البنسلين-ستربتوميسين-النيستاتين، 5.5 مل من محلول مم 200 لتر-الجلوتامين. هذه النتائج في انخفاض الجلوكوز دميم تكملة مع 10% FBS، ستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل، 100 وحدة/مل البنسلين، 12 وحدة/مل النيستاتين، ومم 2 لتر-الجلوتامين.
    2. تصفية وسائل الإعلام باستخدام عامل تصفية أعلى الفراغ 0.22 ميكرون حجم المسام ومخزن في 4 درجات مئوية.
  2. صيانة الخلايا ربل.
    1. تنمو خلايا ربل كونفلوينسي الحد أقصى من 90% في صحن 10 سم. الخلايا إذا كانت خلية ثقافة صحية، ينبغي أن يكون شكل محور دوران بنتوءات عرضية.
    2. لتقسيم الخلية، فصل الخلايا من الطبق يسفط وسائل الإعلام واستبدالها مع 2 مل من محلول تريبسيني/يدتا إينكوباتي ب 5-10 دقائق في جو هوميديفيد من 5% CO2 في 37 درجة مئوية.
    3. بمجرد فصل الخلايا، تحييد التربسين بإضافة 2 مل وسائط الثقافة، باستخدام ماصة، وتقسيم الخلايا في 1:2-1: نسبة 10.
  3. إعداد 20 x المخزن المؤقت في تيرودي
    1. إعداد مخزون 20 x الحل من 54 مم بوكل، 20 مم مجكل2، 2.74 م كلوريد الصوديوم، و 8 مم نة2بو4 في الماء المقطر مزدوجة (دو). يخلط جيدا وتخزينها في 4 درجات مئوية.

2-ثقافة الخلايا ربل لخلية حية مجهرية

  1. إعداد حل فيتك-ديكستران.
    1. مزيج من 1 ملغ مسحوق فيتك-ديكستران (150 ك) كل 1 مل وسائط الثقافة (راجع الخطوة 1.1.1). كوفيرجلاس غرف كاملة، وإعداد 3 مل.
    2. باستخدام وحدة تصفية حقنه اسيتات السليولوز مع حجم المسام ميكرومتر 0.22، تصفية فيتك-ديكستران المذاب.
    3. إضافة الماوس فريق الخبراء الحكومي الدولي إلى تركيز 1 ميكروغرام/مل.
  2. زرع خلايا ربل للتصوير
    1. قبل التصوير، ويوم نضح وسائط الإعلام من طبق الثقافة واستبدال مع 2 مل من محلول تريبسيني/يدتا إينكوباتي ب ل 5-10 دقائق في جو هوميديفيد من 5% CO2 في 37 درجة مئوية. بمجرد فصل الخلايا، تحييد التربسين بإضافة 2 مل وسائط الثقافة.
    2. RBL عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وضبط الحجم وفقا لذلك مع ثقافة وسائل الإعلام للحصول على تركيز خلية من 7.5 × 105/mL.
    3. إضافة 10 ميليلتر من تعليق خلية كوفيرجلاس غرف مملوءة مسبقاً ديكستران فيتك جديدة تكمل ثقافة وسائل الإعلام (وهذا ينتج البذر 7.5 × 103 خلايا في دائرة).
    4. تنمو خلايا ربل بين عشية وضحاها في جو هوميفيد من 5% CO2 في 37 درجة مئوية. ينبغي أن تظل الخلايا في مستوى دون المتلاقية بغية التأكد من أن يتم فصل الخلايا، وأنه من السهل تحديد كل خلية على حدة تحت المجهر.
  3. تعداء الخلايا ربل-اختياري.
    1. لتصوير الأحداث اكسوسيتيك في تركيبة مع غيرها من البروتينات فلوريسسينتلي المعلمة، انظر بروتوكول تعداء الخلايا ربل في عزوز et al. 67

3-يعيش خلية مجهرية من الرقابة

  1. إعداد الحلول:
    1. إعداد المخزن المؤقت الحل تيرودي النهائي بتمييع الحل الأسهم في دو في 01:20 تمييع والملحق مع 20 مم حبيس الرقم الهيدروجيني 7، 1.8 مم كاكل الجلوكوز2و 1 ملغ/مل جيش صرب البوسنة، و 5.6 ملم.
    2. طازجة التحضير كاشف إفراز 20 x في المخزن المؤقت تيرودي [1 ميكروغرام/مل دينيتروفينيل مترافق بألبومين المصل البشري (التثقيف-قد (Ag)) في حالتنا هذه، لتركيز 1 x 50 نانوغرام/مل].
    3. تحضير حلاً كلوريد الأمونيوم 400 مم بتذويب مسحوق تيرودي في المخزن المؤقت.
  2. إعداد الخلايا.
    1. أغسل كوفيرجلاس غرف 3 مرات يسفط وسائل الإعلام من الدائرة وإعادة الملء أنه مع 300 ميليلتر من المخزن المؤقت تيرودي، بريوارميد إلى 37 درجة مئوية. وأخيراً، تجديد قاعة مع 300 ميليلتر من المخزن المؤقت تيرودي، بريوارميد إلى 37 درجة مئوية.
    2. ضع كوفيرجلاس غرف في الدائرة الحاضنة للمجهر. تأكد من أن الدائرة مستقرة.
  3. إعداد المجهر
    1. لاختيار منطقة اهتمام لتعقب، تشغيل مصدر الضوء الفلورية (تقليديا مصباح الزئبق) واختر مرشح الأسفار المناسبة (اختيار عامل تصفية فلوروفوريس الأخضر لعرض فيتك-ديكستران). مجرد المنطقة لمصلحة في التركيز وفي منتصف مجال الرؤية، إيقاف مصدر الضوء تجنبا لتبييض الصورة وسمية.
      ملاحظة: قد تحتفظ بعض فيتك-ديكستران أدرجت في الخلايا الأسفار. هذا سبب فيتك-ديكستران أيضا قد يتم فرز للمقصورات غير الليزوزومية مثل اندوسوميس.
    2. قم بتشغيل الإضاءة المناسبة للإثارة فيتك. إذا كان استخدام مجهر الليزر، تشغيل الليزر 488 نانومتر. الانبعاثات ينبغي أن تجمع حوالي 500-550 نانومتر (فيتك الانبعاث الذري في 510-520 nm).
    3. عند استخدام مجهر [كنفوكل]، فتح الثقب إلى أقصى حد. هذا سوف يسمح باستخدام طاقة الليزر أقل لتجنب تبيض وسمية وسوف تكفل القبض على الأحداث الرقابة من كل الطائرات من الخلية.
    4. معايرة الفاصل الزمني بين امتلاك الصورة.
      1. قد تختلف خلايا مختلفة في حركية تنظم الرقابة68. لتصوير محددة للرقابة مجمع، نوصي بفاصل زمني لمدة 5 ثوان على الأقل. ومع ذلك، كقاعدة عامة، للسماح بتصوير سريع، تأكد وقت الحصول على إطار واحد سريع.
      2. عند استخدام مجهر [كنفوكل] المسح الضوئي الليزر، تعيين اتجاه المسح الضوئي إلى ثنائية ولا تسمح للمتوسط وتعيين القرار في 512 × 512 (مستحسن; الحكمين الأخير سوف يساعد أيضا على تقليل تبيض وسمية).
  4. تصوير للرقابة.
    1. صورة الخلايا للمدد المطلوب، تبعاً لنوع الخلية أو الارتباط. في الخلايا ربل أثارت مع فريق الخبراء الحكومي الدولي/Ag، تحدث معظم اكسوسيتيك الأحداث ضمن 15-20 دقيقة للتنشيط.
    2. لتنشيط الخلايا، إضافة ميليلتر 16 من 20 x حل الارتباط إلى الدائرة.
  5. مما يؤكد وجود فيتك-ديكستران في الخلايا.
    1. للتأكد من وجود وتوطين فيتك-ديكستران إلى شركة SGs، إضافة 16 ميليلتر من كلوريد الأمونيوم الحل (أن تكون حذراً إلا تحريك الدائرة كي لا تفقد التركيز) إلى الدائرة بلطف (وهذا سيجعل تركيز نهائي من 20 مم). هذا سوف يحفز الكاليزيشن من شركة SGs وديكوينتشينج من الأسفار فيتك، الذي سيحدث في غضون ثوان.

النتائج

ويمثل الشكل 1a تخطيطياً كيف ديكستران فيتك قد يعمل كمراسل لتنظيم الرقابة والخص أنماط مختلفة من الأحداث اكسوسيتيك. أولاً، هي المحتضنة الخلايا مع فيتك-ديكستران، استيعابه من بينوسيتوسيس وفرز لشركة SGs. منذ SGs MCs لروس، على درجة الحموضة منخفضة يقلل الأسفار فيتك، ...

Discussion

هنا ونحن تصف كيفية تعقب يمكن استخدامها الأسفار من فيتك-ديكستران تحميلها في شركة SGs لالتقاط أحداث مجمع الرقابة على وجه التحديد. وكان ذلك عن طريق وضع المجهر الحصول على صورة كل 15 ثانية، مما يضمن أنه سيتم تسجيل الأحداث طويلة الأمد إلا مع مرور الوقت، وذلك باستثناء أحداث قصيرة يستجيب للرقابة الك...

Disclosures

الكتاب يعلن أي مصلحة مالية المتنافسة

Acknowledgements

ونشكر الدكتور U. عشيري على هبة سخية من كدنا. ونحن نشكر الدكتور غ. الكتلة و Mittleman ل. شاهارباني م. Y.Zilberstein من ساكلير الخلوية والجزيئية مركز تصوير لما قدموه من المساعدات مع الفحص المجهري. هذا العمل كان تدعمه "مؤسسة العلوم الثنائية المشتركة بين" الولايات المتحدة وإسرائيل (منحة 2013263 R. ساغي-أيزنبرغ، "هامل أولاً"، و S.J.Galli) ومنحة 933/15 من "مؤسسة العلوم إسرائيل"، تأسست من قبل أكاديمية إسرائيل للعلوم (إلى R.Sagi-أيزنبرغ )، والمعاهد الوطنية للصحة منح آسيا تحت 19 عاماً منظمة العفو الدولية 104209 و AR067145 R01 (إلى جالي الرملة).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM low glucoseBiological Inductries01-050-1A
Fetal bovine serumGibco12657
Pen-strep-nystatin solutionBiological Inductries03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution Biological Inductries03-020-1A
FITC dextran 150KSigma-Aldrich46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution BBiological Inductries03-052-1AWarm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size Sigma-AldrichCLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore sizeSartorius16534K
Chambered coverglass Thermo scientific155411
Corning tissue-culture treated culture dishesSigma-AldrichCLS430167
Bovine serum albuminSigma-AldrichA4503
Anti-DNP monoclonal IgESigma-AldrichD8406
DNP-HSA (Ag)Sigma-AldrichA6661 Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4Biological Inductries03-025-1B
CaCl2MERK102382
GlucoseBDH Laboratories284515V
Ammonium chlorideMERK1145
PIPES dipotassium saltSigma-Aldrich108321-27-3
Calcium acetate hydrateSigma-Aldrich114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrateSigma-AldrichM5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)Sigma-AldrichG1501
NaH2PO4MERK6346
NaClMERK106404
MgCl2MERK105833
KClMERK104936
Electroporator BTXECM830
Confocal microscope, ZeissZeissLSM 5 Pascal, Axiovert 200MUsed in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, ZeissZeissLSM 800, Axio Observer.Z1 /7Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, LeicaLeicaSP5Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cellsRBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

References

  1. Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. Exocytosis and endocytosis: Modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76, 301-331 (2014).
  2. Pickett, J. A., Edwardson, J. M. Compound exocytosis: Mechanisms and functional significance. Traffic. 7 (2), 109-116 (2006).
  3. Behrendorff, N., Dolai, S., Hong, W., Gaisano, H. Y., Thorn, P. Vesicle-associated membrane protein 8 (VAMP8) is a SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) selectively required for sequential granule-to-granule fusion. J Biol Chem. 286 (34), 29627-29634 (2011).
  4. Kwan, E. P., Gaisano, H. Y. Glucagon-like peptide 1 regulates sequential and compound exocytosis in pancreatic islet beta-cells. Diabetes. 54 (9), 2734-2743 (2005).
  5. Hoppa, M. B., et al. Multivesicular exocytosis in rat pancreatic beta cells. Diabetologia. 55 (4), 1001-1012 (2012).
  6. Zhu, D., et al. Syntaxin-3 regulates newcomer insulin granule exocytosis and compound fusion in pancreatic beta cells. Diabetologia. 56 (2), 359-369 (2013).
  7. Vardjan, N., Jorgačevski, J., Stenovec, M., Kreft, M., Zorec, R. Compound exocytosis in pituitary cells. Ann N Y Acad Sci. 1152 (1), 63-75 (2009).
  8. Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Differential regulation of granule-to-granule and granule-to-plasma membrane fusion during secretion from rat pituitary lactotrophs. J Cell Biol. 150 (4), 839-848 (2000).
  9. Mair, N., Haller, T., Dietl, P. Exocytosis in alveolar type II cells revealed by cell capacitance and fluorescence measurements. Am J Physiol. 276, 376-382 (1999).
  10. Carmo, L. A. S., et al. CD63 is tightly associated with intracellular, secretory events chaperoning piecemeal degranulation and compound exocytosis in human eosinophils. J Leukoc Biol. 100 (2), 391-401 (2016).
  11. Hafez, I., Stolpe, A., Lindau, M. Compound exocytosis and cumulative fusion in eosinophils. J Biol Chem. 278 (45), 44921-44928 (2003).
  12. Scepek, S., Lindau, M. Focal exocytosis by eosinophils - compound exocytosis and cumulative fusion. EMBO J. 12 (5), 1811-1817 (1993).
  13. Lollike, K., Lindau, M., Calafat, J., Borregaard, N. Compound exocytosis of granules in human neutrophils. J Leukoc Biol. 71 (6), 973-980 (2002).
  14. Mukai, K., Tsai, M., Starkl, P., Marichal, T., Galli, S. J. IgE and mast cells in host defense against parasites and venoms. Semin Immunopathol. 38 (5), 581-603 (2016).
  15. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nat Med. 18 (5), 693-704 (2012).
  16. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  17. Blank, U. The mechanisms of exocytosis in mast cells. Adv Exp Med Biol. , 107-122 (2011).
  18. Cohen, R., Corwith, K., Holowka, D., Baird, B. Spatiotemporal resolution of mast cell granule exocytosis reveals correlation with Ca2+ wave initiation. J Cell Sci. 125 (12), 2986-2994 (2012).
  19. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J Neurochem. 97 (6), 1546-1570 (2006).
  20. Cao, H., Chen, J., Awoniyi, M., Henley, J. R., McNiven, M. A. Dynamin 2 mediates fluid-phase micropinocytosis in epithelial cells. J Cell Sci. 120 (23), 4167-4177 (2007).
  21. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  22. Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A., Albrecht, T., Davey, R. A. Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-Like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes. PLoS Pathog. 6 (9), e1001110 (2010).
  23. Wang, J. T. H., Kerr, M. C., Karunaratne, S., Jeanes, A., Yap, A. S., Teasdale, R. D. The SNX-PX-BAR family in macropinocytosis: The regulation of macropinosome formation by SNX-PX-BAR proteins. PLoS One. 5 (10), e13763 (2010).
  24. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  25. Thorn, P., Jang, Y. Visualization of exocytosis in pancreatic acinar cells by fluorescence microscopy. Pancreapedia Exocrine Pancreas Knowl Base. , (2011).
  26. Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J Cell Biol. 159 (4), 625-635 (2002).
  27. Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci. 104 (35), 14151-14156 (2007).
  28. Lima, W. C., Leuba, F., Soldati, T., Cosson, P. Mucolipin controls lysosome exocytosis in Dictyostelium. J Cell Sci. 125 (9), 2315-2322 (2012).
  29. Ravdin, J. I., Murphy, C. F., Schlesinger, P. H. The cellular regulation of vesicle exocytosis by Entamoeba histolytica. J Protozool. 35 (1), 159-163 (1988).
  30. Blott, E. J., Griffiths, G. M. Secretory lysosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (2), 122-131 (2002).
  31. Raposo, G., Fevrier, B., Stoorvogel, W., Marks, M. S. Lysosome-related organelles: A view from immunity and pigmentation. CELL Struct Funct. 27 (6), 443-456 (2002).
  32. Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
  33. Klein, O., et al. Rab5 is critical for SNAP23 regulated granule-granule fusion during compound exocytosis. Sci Rep. 7 (1), 15315 (2017).
  34. Ichikawa, A. Fine structural changes in response to hormonal stimulation of the perfused canine pancreas. J Cell Biol. 24 (3), 369-385 (1965).
  35. Bloom, G. D., Haegermark, &. #. 2. 1. 4. ;. A study on morphological changes and histamine release induced by compound 4880 in rat peritoneal mast cells. Exp Cell Res. 40 (3), 637-654 (1965).
  36. Bloom, G. D., Chakravarty, N. Time course of anaphylactic histamine release and morphological changes in rat peritoneal mast cells. Acta Physiol Scand. 78 (3), 410-419 (1970).
  37. Horsfield, G. I. The effect of compound 48/80 on the rat mast cell. J Pathol Bacteriol. 90 (2), 599-605 (1965).
  38. Alvarez de Toledo, G., Fernandez, J. M. Compound versus multigranular exocytosis in peritoneal mast cells. J Gen Physiol. 95 (3), 397-409 (1990).
  39. Fernandez, J. M., Neher, E., Gomperts, B. D. Capacitance measurements reveal stepwise fusion events in degranulating mast cells. Nature. 312 (5993), 453-455 (1984).
  40. Oberhauser, A. F., Robinson, M., Fernandez, J. M. Simultaneous capacitance and amperometric measurements of exocytosis: A comparison. Biophys J. 71 (2), 1131-1139 (1996).
  41. Nagamatsu, S., Ohara-Imaizumi, M. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 440, (2008).
  42. Akopova, I., et al. Imaging exocytosis of ATP-containing vesicles with TIRF microscopy in lung epithelial A549 cells. Purinergic Signal. 8 (1), 59-70 (2012).
  43. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J Vis Exp. (28), e1305 (2009).
  44. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  45. Plattner, H., Artalejo, A. R., Neher, E. Ultrastructural organization of bovine chromaffin cell cortex-analysis by cryofixation and morphometry of aspects pertinent to exocytosis. J Cell Biol. 139 (7), 1709-1717 (1997).
  46. Eitzen, G. Actin remodeling to facilitate membrane fusion. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 175-181 (2003).
  47. Becherer, U., Pasche, M., Nofal, S., Hof, D., Matti, U., Rettig, J. Quantifying exocytosis by combination of membrane capacitance measurements and total internal reflection fluorescence microscopy in chromaffin cells. PLoS One. 2 (6), e505 (2007).
  48. Wilson, J. D., Shelby, S. A., Holowka, D., Baird, B. Rab11 regulates the mast cell exocytic response. Traffic. 17 (9), 1027-1041 (2016).
  49. Makhmutova, M., Liang, T., Gaisano, H., Caicedo, A., Almaça, J. Confocal imaging of neuropeptide Y-pHluorin: A technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets. J Vis Exp. (127), e56089 (2017).
  50. Almaça, J., Liang, T., Gaisano, H. Y., Nam, H. G., Berggren, P. -. O., Caicedo, A. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58, 2810-2818 (2015).
  51. Dominguez, N., van Weering, J. R. T., Borges, R., Toonen, R. F. G., Verhage, M. Dense-core vesicle biogenesis and exocytosis in neurons lacking chromogranins A and B. J Neurochem. 144 (3), 241-254 (2017).
  52. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2007).
  53. Steyer, J. A., Horstmann, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388 (6641), 474-478 (1997).
  54. Zoccarato, F., Cavallini, L., Alexandre, A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes. J Neurochem. 72 (2), 625-633 (1999).
  55. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of kiss-and-run exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  56. Tsuboi, T., Zhao, C., Terakawa, S., Rutter, G. A. Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr Biol. 10 (20), 1307-1310 (2000).
  57. Tsuboi, T., Kikuta, T., Sakurai, T., Terakawa, S. Water secretion associated with exocytosis in endocrine cells revealed by micro forcemetry and evanescent wave microscopy. Biophys J. 83 (1), 172-183 (2002).
  58. Avery, J., et al. A cell-free system for regulated exocytosis in PC12 cells. J Cell Biol. 148 (2), 317-324 (2000).
  59. Larina, O., et al. Dynamic regulation of the large exocytotic fusion pore in pancreatic acinar cells. Mol Biol Cell. 18 (9), 3502-3511 (2007).
  60. Nemoto, T., et al. Sequential-replenishment mechanism of exocytosis in pancreatic acini. Nat Cell Biol. 3 (3), 253-258 (2001).
  61. Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2 (8), e233 (2004).
  62. Lasič, E., Stenovec, M., Kreft, M., Robinson, P. J., Zorec, R. Dynamin regulates the fusion pore of endo- and exocytotic vesicles as revealed by membrane capacitance measurements. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1861 (9), 2293-2303 (2017).
  63. Bonnafous, P., Stegmann, T. Membrane perturbation and fusion pore formation in influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. A new model for fusion. J Biol Chem. 275 (9), 6160-6166 (2000).
  64. Balseiro-Gomez, S., Flores, J. A., Acosta, J., Ramirez-Ponce, M. P., Ales, E. Transient fusion ensures granule replenishment to maintain repeated release after IgE-mediated mast cell degranulation. J Cell Sci. 129 (21), 3989-4000 (2016).
  65. Eccleston, E., Leonard, B. J., Lowe, J. S., Welford, H. J. Basophilic leukaemia in the albino rat and a demonstration of the basopoietin. Nat New Biol. 244 (133), 73-76 (1973).
  66. Barsumian, E. L., Isersky, C., Petrino, M. G., Siraganian, R. P. IgE-induced histamine release from rat basophilic leukemia cell lines: isolation of releasing and nonreleasing clones. Eur J Immunol. 11 (4), 317-323 (1981).
  67. Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis. J Vis Exp. (95), e52505 (2015).
  68. Martin, T. F. J. Tuning exocytosis for speed: fast and slow modes. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 157-165 (2003).
  69. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
  70. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  71. Beraldo, W. T., Silva, W. D., Fernandes, A. D. L. Ihibitory effects of carbohydrates on histamine release and mast cell disruption by dextran. Br J Pharmacol Chemother. 19 (3), 405-413 (1962).
  72. Oda, T., Kodama, N., Arizona, K. K. Ketotifen, a mast cell stabilizer, protects dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in rats. Gastroenterology. 108 (4), a887 (1995).
  73. Sagi-Eisenberg, R., Geller-Bernstein, C., Ben-Neriah, Z., Pecht, I. Direct measurements of the dextran-dependent calcium uptake by rat peritoneal mast cells. FEBS Lett. 161 (1), 37-40 (1983).
  74. Hanahoe, T. H. Mechanism of histamine release from rat isolated peritoneal mast cells by dextran: the role of immunoglobulin E. Agents Actions. 14 (3-4), 468-474 (1984).
  75. Harris, J. M., West, G. B. Rats resistant to the dextran anaphylactoid reaction. Br J Pharmacol Chemother. 20, 550-562 (1963).
  76. Baxter, J. H., Adamik, R. Temperature dependence of histamine release from rat mast cells by dextran. Proc Soc Exp Biol Med. 146 (1), 71-74 (1974).
  77. Chakravarty, N., Goth, A., Sen, P. Potentiation of dextran-induced histamine release from rat mast cells by phosphatidyl serine. Acta Physiol Scand. 88 (4), 469-480 (1973).
  78. Baxter, J. H. Role of Ca++ in mast cell activation, desensitization, and histamine release by dextran. J Immunol. 111 (5), 1470-1473 (1973).
  79. Chen, H. -. Y., et al. Nanoimaging granule dynamics and subcellular structures in activated mast cells using soft X-ray tomography. Sci Rep. 6 (1), 34879 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136 pinocytosis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved