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Resumo

Aqui detalhamos um método para a imagem latente de célula viva de exocitose regulada. Este método utiliza FITC-dextrano, que acumula em organelas lisossoma-relacionados, como repórter. Este método simples também permite distinguir entre diferentes modos de exocitose regulada em células que são difíceis de manipular geneticamente.

Resumo

Regulamentado exocitose é um processo pelo qual cargo, que é armazenado em grânulos secretórios (GV), é liberado em resposta a um gatilho secretora. Regulamentado exocitose é fundamental para a comunicação intercelular e é um mecanismo-chave para a secreção de hormônios, neurotransmissores, mediadores inflamatórios e outros compostos, por uma variedade de células. Pelo menos três mecanismos distintos são conhecidos por exocitose regulada: exocitose completo, onde um único SG totalmente funde-se com a membrana plasmática, exocitose beijo-and-run, onde um único SG transitoriamente funde-se com a membrana plasmática, e exocitose composto, onde vários SGs fundem-se com o outro, antes ou depois da fusão de SG com a membrana plasmática. O tipo de exocitose regulada empreendida por uma célula, muitas vezes é ditado pelo tipo de gatilho secretora. No entanto, em muitas células, um único gatilho secretora pode ativar vários modos de exocitose regulada simultaneamente. Apesar de sua abundância e importância do outro lado, espécies e tipos de células, os mecanismos que determinam os diferentes modos de secreção são em grande parte não resolvidos. Um dos principais desafios em investigar os diferentes modos de exocitose regulada, é a dificuldade em distinguir entre eles, bem como explorá-los separadamente. Aqui nós descrevemos o uso de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano como um repórter de exocitose e células vivas de imagem, para diferenciar entre os diferentes caminhos de exocitose regulamentado, enfocando a exocitose composto, baseado na robustez e duração dos eventos exocytic.

Introdução

Exocitose regulamentado é o mecanismo primário pelo qual prontamente fez carga é liberada a partir de uma célula secretória em resposta a um gatilho específico. A carga é pré-formada e isolada em vesículas secretoras, no qual é armazenado até um gatilho retransmite o sinal para a liberação do conteúdo do GV. Diferentes tipos de sinais podem resultar em diferentes modos de exocitose regulamentado, ou modos diferentes de exocitose regulamentado podem ocorrer simultaneamente. Três modos principais de exocitose regulamentado são conhecidos: exocitose completo, que envolve completa fusão de um único grânulo secretor com a membrana plasmática; beijo e executar exocitose, que envolve fusão transiente do grânulo secretor com a membrana plasmática, seguida por sua reciclagem; e exocitose composto, que se caracteriza pela fusão de homotypic dos vários GV antes (ou seja, multigranular exocitose) ou sequencial (ou seja, sequencial exocitose) a fusão com a membrana plasmática1. Exocitose composto é considerado o mais extenso modo de liberação de carga2, pois permite a rápida secreção de carga, incluindo o de GV que estão localizado distal da membrana plasmática. Exocitose composto tem sido documentada em ambas as células endócrinas e exócrinas3,4,5,6,7,8,9, bem como em células do sistema imunológico. Em células do sistema imunológico, tais como eosinófilos10,11,12 e neutrófilos13, composto exocitose permite a liberação rápida e robusta de mediadores que são obrigados a matar patógenos invasores, tais como bactérias ou parasitas. Mastócitos (MCs) implantar exocitose composto para a eficiente liberação de mediadores inflamatórios pré-armazenadas durante inata de respostas imunes, anafilaxia e outras reações alérgicas14,15,16 , 17. uma vez que os diferentes modos de exocitose podem ocorrer simultaneamente18,19, tornou-se um desafio para distingui-los em tempo real ou para identificar suas machineries respectivos fusão, portanto, elucidar seus mecanismos subjacentes.

Aqui nós apresentamos um método, baseado na célula viva imagem de célula carregada FITC-dextrano, que permite o rastreamento em tempo real de eventos exocytic e distinguindo entre seus modos diferentes. Em particular, nosso método permite monitoramento exclusivo de exocitose composto.

FITC-dextrano é um conjugado do fluoróforo sensíveis ao pH FITC com o dextran de polissacarídeo glucan. Dextranos fluorescente etiquetados foram mostrados para entrar na célula pela micropinocytosis20,21 e macropinocitose22,23. Como compartimentos endocítica maduro em lisossomos, mostrou que FITC-dextrano acumula-se no lisossomo com nenhuma degradação aparente. No entanto, como FITC é altamente sensíveis ao pH fluoróforo24e o lúmen do lisossomo é ácido, fluorescência FITC-dextrano sacia ao atingir o lisossoma24. Assim, estabelecendo dextranos como lisossoma direcionados a carga, juntamente com a sensibilidade de pH de FITC, lançaram as bases para o uso do FITC-dextran em estudos do lisossoma exocitose25,26,27 , 28 , 29.

Em vários tipos de células, incluindo MCs, neutrófilos, eosinófilos, as células T citotóxicas, melanossomas e outros, as SGs exibir características dos lisossomos em são classificados como organelas relacionadas lisossoma (LROs) ou secretora lisossomos30,31 . Desde LROs têm um pH ácido luminal, FITC-dextrano pode ser usado para visualizar seu exocitose, como resultado de pH mais elevado associado com a exteriorização dos LROs. Com efeito, FITC-dextrano tem sido usado para monitorar a exocitose em MCs18,32,33. Neste método, FITC-dextrano é adicionado à cultura de pilha, retomada pelas células por pinocitose e classificado para o GV. Como é em lisossomos, fluorescência FITC é saciada no GV quando eles estão dentro da célula. No entanto, após fusão de SG com a membrana plasmática e consequente exposição ao meio externo, o FITC-dextrano recupera a sua fluorescência como o SG pH sobe, permitindo que o simples acompanhamento de eventos exocytic pela microscopia célula viva. Aqui, nós ajustamos esse método para ativar o controle exclusivo de exocitose composto.

Dois outros métodos têm sido utilizados anteriormente para rastrear exocitose composto. Microscopia eletrônica foi o primeiro método para caracterizar estruturas exocytic que sugeriu a ocorrência de diferentes modos de exocitose. Em particular, as observações de "túneis secretoras" nas células acinares pancreáticas34 e MCs35,36,37 deram origem à hipótese de exocitose composto. No entanto, enquanto a alta resolução da microscopia eletrônica tem o poder de revelar vesículas fundidas, não pode acompanhar a dinâmica da sua fusão e, portanto, não é possível definir se eles correspondem a fusão SG durante a exocitose composto ou fusão dos grânulos recapturados seguindo sua endocitose. Este obstáculo é superado em outros métodos que podem medir exocitose em células vivas, tais como as medições de braçadeira do remendo da membrana plasmática da capacidade11,13,38,39 ou amperometry 40 da mídia. No entanto, remendo de aperto requer uma afinação especial e pode não ser adequado para todos os tipos de célula. Amperometry medições são capazes de rastrear exocitose somente se a carga é liberada em muito estreita proximidade com o eletrodo. Portanto, utilizando imagens de células vivas oferece uma vantagem sobre esses métodos, que não só permite rastreamento em tempo real de exocitose, mas também permite rápida e simples de aquisição de dados da célula inteira.

O rastreamento de FITC-dextran por microscopia célula viva também oferece algumas vantagens para outra célula viva métodos baseados em imagens. Por exemplo, um método amplamente utilizado é a microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) de células carregadas com uma sonda fluorescente de SG ou expressando uma fluorescente com a proteína-tag SG carga ou membrana proteína26,41, 42 , 43. a força deste método reside na sua capacidade de monitorar exclusivamente os eventos que ocorrem perto da membrana plasmática (aqui referida como pegada), portanto, exocytic eventos. No entanto, isto também é a desvantagem desse método porque apenas a fração de células que fica ao lado da lamela e perto da lente do microscópio pode ser fotografada44. Se tais pegadas na verdade representam a superfície inteira da membrana celular é ainda discutível45,46,47. A este respeito, usar um corante de pH sensíveis tais como FITC-dextrano e um microscópio de fluorescência padrão ou um microscópio confocal com uma pinhole aberto permite que a imagem da célula inteira, assim, capturar os eventos de total exocytic que ocorrem naquela cela.

Repórteres de sensíveis ao pH adicionais que são usados para estudar a exocitose regulada por células inteiras de imagem ou TIRFM incluem carga SG ou proteína de membrana SG fundido a phlourin, uma variante GFP sensíveis ao pH. Exemplos incluem NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin e synapto-phluorin48,,49,50,,51,52. Enquanto expressão destas sondas pode representar mais de perto a composição endógena do GV, isso implica transfecção de células e, portanto, pode ser menos apropriado para células que são difíceis de transfect. Portanto, quando estudar as células que são difíceis de transfect ou sob condições experimentais que exigem várias manipulações do genoma, a utilização de um composto que pode simplesmente ser completada no meio de cultura de células, tais como FITC-dextrano, é vantajosa . FITC-dextran também oferece uma vantagem sobre laranja de acridina (AO), outro corante sensíveis ao pH que foi usado para o rastreamento de exocitose por célula viva microscopia53,54,55,56 , 57 , 58. AO tem sido mostrado para induzir a fotólise de vesículas que resultam em flashes falsos, que não correspondem à real secreção processos de27. Em contraste, FITC-dextrano reflete melhores eventos de secreção, provavelmente devido a sua baixa produção foto-induzida de oxigênio reativo27.

Uma abordagem alternativa para estudar exocitose é, notavelmente, seguindo-se o afluxo de um corante, do meio externo para o SG através do poro de fusão que abre durante este processo. Neste caso, o corante é adicionado ao meio externo juntamente com o gatilho secretora. Então, quando abre o poro de fusão, o corante difunde-se para o SG59,60. Uma vantagem deste método é que ele também oferece a capacidade de estimar o tamanho de poro de fusão, pelo uso de corantes de tamanho variável. Por exemplo, dextranos de peso molecular diferente (MW), conjugada com fluorophores diferentes, podem ser usados como corantes extracelulares, no qual o tamanho máximo do dextran que pode penetrar o SG corresponderia ao tamanho do poro da fusão,59, 61 , 62 , 63 , 64. Além disso, esta abordagem não requer o uso de uma sonda de pH sensíveis. No entanto, uma desvantagem significativa é que o sinal à relação de ruído é muito baixo, já que uma grande quantidade de corante está presente nos meios de comunicação durante a aquisição de imagens, resultando em fundo elevado.

No geral, o uso de dextran-FITC como um marcador para exocitose supera várias desvantagens em métodos anteriormente relatados, como sinal-ruído ratio, toxicidade, rastreamento dinâmico e complexidade.

Aqui nós descrevemos o uso do FITC-dextran para monitorar exocitose composto na linha de 3 mastócitos RBL - 2H (aqui referida como RBL, estabelecido principalmente por Eccleston et al 65 e mais clonados por Barsumian et al . 66), em resposta a imunoglobulina E (IgE) / ativação de antígeno (Ag).

Protocolo

1. preparações

  1. Preparação de meios de cultura RBL
    1. Misturar 500 mL de glicose baixa Dulbecco modificado médio da águia (DMEM) com 56 mL de soro fetal bovino (FBS), 5,5 mL de solução de penicilina-estreptomicina-nistatina, 5,5 mL de solução de L-glutamina 200 mM. Isso resulta em baixos de glicose DMEM suplementado com 10% FBS, estreptomicina 100 µ g/mL, 100 unidades/mL penicilina, 12 nistatina unidades/mL e 2 mM L-glutamina.
    2. Os meios de filtro usando um top-vácuo filtro de 0,22 µm de tamanho de poro e loja a 4 ° C.
  2. Manutenção de células RBL.
    1. Desenvolvem-se células RBL para uma confluência máxima de 90% em um prato de 10 cm. Se a cultura de células saudável, as células devem ter uma forma de fuso com protuberâncias ocasionais.
    2. Para célula dividir, separar as células do prato aspirando a mídia e substituindo com 2 mL de solução de EDTA/trypsine B. Incubar durante 5-10 minutos em um ambiente umidificado de 5% CO2 a 37 ° C.
    3. Uma vez que as células têm destacado, neutralizar a tripsina, adicionando 2 mL de meio de cultura, utilizando uma pipeta e dividir as células em um 1:2-1: relação de 10.
  3. Preparação de 20 x reserva do Tyrode
    1. Prepare um estoque de 20 x 20 mM MgCl2solução de 54 mM KCl, 2,74 M NaCl e 8mm NaH2PO4 em água bidestilada (DDW). Misture bem e armazenar a 4 ° C.

2. cultura de células RBL para microscopia célula viva

  1. Preparação da solução de dextran-FITC.
    1. Misture 1 mg de pó FITC-dextrano (150 K) por 1 mL de meio de cultura (ver passo 1.1.1). Para uma completa lamela septada, prepare-se 3 mL.
    2. Usando uma unidade de filtro de seringa de acetato de celulose com tamanho de poro 0,22 µm, filtre o FITC-dextrano dissolvido.
    3. Adicione o rato IgE a uma concentração de 1 µ g/mL.
  2. Semeadura de células RBL para a imagem latente
    1. Na véspera da imagem latente, aspirar a mídia do prato cultura e substituir com 2 mL de solução de EDTA/trypsine B. Incubar durante 5-10 minutos em um ambiente umidificado de 5% CO2 a 37 ° C. Uma vez que as células têm destacado, neutralize a tripsina, adicionando 2 mL de meio de cultura.
    2. RBL contagem células usando um hemocytometer e ajustar o volume de acordo com meios de cultura para obter uma concentração de célula de 7,5 x 105/mL.
    3. Adicione 10 µ l de suspensão de células para uma lamela septada pré-preenchido com FITC-dextrano fresca complementadas meios de cultura (isso resulta em propagação de 7,5 x 103 células em uma câmara).
    4. Desenvolvem-se células RBL durante a noite em uma humified atmosfera de 5% CO2 a 37 ° C. As células devem permanecer em um nível secundário confluente para certificar-se que as células são separadas e que é fácil de identificar cada célula individualmente sob o microscópio.
  3. Transfecção de células RBL - opcionais.
    1. Para eventos exocytic em combinação com outras proteínas fluorescente etiquetadas de imagem, consulte protocolo de Transfeccao para células RBL em Lorena et al 67

3. microscopia de célula de exocitose de viver

  1. Preparação das soluções:
    1. Preparar a solução-tampão de um final Tyrode diluindo a solução estoque em DDW em um 01:20 diluição e suplemento com pH de Hepes 20 mM 7, 1.8 mM CaCl2, 1mg/mL BSA e 5,6 mM de glicose.
    2. Recentemente, preparar um reagente de secretagogue 20 x no buffer do Tyrode [1 µ g/mL dinitrophenyl conjugada com albumina de soro humano (DNP-tem (Ag)) no nosso caso, para uma concentração de 1 x 50 ng/mL].
    3. Prepare uma solução de cloreto de amónio de 400mm, dissolvendo o pó em buffer de Tyrode.
  2. Preparação das células.
    1. Lave a lamela septadas 3 vezes por meios de comunicação da câmara de aspiração e recarga-lo com 300 µ l de tampão de Tyrode, pré-aquecido a 37 ° C. Finalmente, repor a câmara com 300 µ l de tampão de Tyrode, pré-aquecido a 37 ° C.
    2. Coloca a lamela septadas na câmara de incubadora do microscópio. Certifique-se que a câmara é estável.
  3. Configurando o microscópio
    1. Para escolher uma região de interesse para rastrear, ligue a fonte de luz fluorescente (tradicionalmente uma lâmpada de mercúrio) e escolher o filtro adequado de fluorescência (escolher o filtro para fluorophores verde para visualização FITC-dextran). Uma vez que a região de interesse está em foco e é no meio do campo de visão, desligue a fonte de luz para evitar o branqueamento foto e toxicidade.
      Nota: Alguns do FITC-dextrano incorporado nas células podem reter fluorescência. Isso ocorre porque FITC-dextran também pode ser ordenado para não-lisossomal compartimentos tais como endossomos.
    2. Liga a iluminação adequada para a excitação de FITC. Se usando um microscópio baseados em laser, ligue a 488 nm do laser. Emissões devem ser reunidas em torno de 500-550 nm (FITC picos de emissão em 510-520 nm).
    3. Quando usando um microscópio confocal, abra o pinhole ao máximo. Isto permitirá utilizar a toxicidade e menor potência de laser para evitar descoramento e irá garantir a captura de eventos de exocitose de todos os aviões da célula.
    4. Calibre o intervalo de tempo entre aquisições de imagem.
      1. Diferentes células podem variar em sua cinética da exocitose regulada68. Para imagens específicas de exocitose composto, recomendamos um intervalo de tempo pelo menos 5 segundos. No entanto, como regra geral, para permitir a rápida imagem, certifique-se que o tempo de aquisição de um único quadro é rápido.
      2. Quando usando um microscópio confocal de varredura a laser, definir a direção de varredura para bi-direcional, não permitem uma média e definir a resolução de 512 x 512 (recomendado; as último duas disposições contribuirá também para minimizar a descoloração e toxicidade).
  4. Imagem de exocitose.
    1. Células de imagem para durações desejadas, dependendo do tipo de célula ou secretagogue. Nas células RBL provocadas com IgE/Ag, a maioria dos eventos de exocytic ocorreram dentro de 15-20 min de ativação.
    2. Para a ativação das células, adicione 16 µ l do 20 x solução de secretagogue para a câmara.
  5. Confirmando a presença de FITC-dextrano nas células.
    1. Para confirmar a presença e localização de FITC-dextran para o GV, adicione 16 µ l de solução de cloreto de amónio (tenha cuidado para não mover a câmara para não perder o foco) para a câmara suavemente (isto fará uma concentração final de 20 mM). Isto irá induzir alcalinização do GV e dequenching de fluorescência FITC, que ocorrerá dentro de segundos.

Resultados

Figura 1a representa esquematicamente como FITC-dextrano pode atuar como um repórter para regulada exocitose e recapitular os diferentes modos de eventos exocytic. Primeiro, as células são incubadas com FITC-dextrano, que é internalizada por pinocitose e classificado para o GV. Desde que o GV de MCs são LROs, seu baixo pH amortece a fluorescência de FITC, mostrado aqui como preto granulado (A-C, eu). Quando as células são acionadas por um secretagogue...

Discussão

Aqui descrevemos como rastreamento fluorescência do FITC-dextrano carregado em GV pode ser usada para capturar especificamente eventos exocitose composto. Isto foi conseguido, definindo o microscópio para adquirir uma imagem a cada 15 segundos, garantindo que somente os eventos de longa duração serão registrados ao longo do tempo e, portanto, excluindo eventos curtos que corresponderiam a exocitose completo ou exocitose beijo e correr. Para estabelecer o método, nós mostramos aquele nocaute das isoformas de Rab5 q...

Divulgações

Os autores não declaram nenhum interesse financeiro concorrente

Agradecimentos

Agradecemos a generosa oferta do cDNA-Dr. U. Ashery. Agradecemos os Drs G. massa, L. Mittleman, M. Shaharbani e Y.Zilberstein do Sackler Cellular & Molecular Imaging Center por sua inestimável ajuda com microscopia. Este trabalho foi apoiado pela Fundação de ciência Binacional EUA-Israel (grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel e S.J.Galli) e conceder a Israel Science Foundation, fundada pela Academia de Ciências (para R.Sagi-Eisenberg Israel 933/15 ) e bolsas NIH U19 AI 104209 e R01 AR067145 (de S.J. Galli).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM low glucoseBiological Inductries01-050-1A
Fetal bovine serumGibco12657
Pen-strep-nystatin solutionBiological Inductries03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution Biological Inductries03-020-1A
FITC dextran 150KSigma-Aldrich46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution BBiological Inductries03-052-1AWarm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size Sigma-AldrichCLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore sizeSartorius16534K
Chambered coverglass Thermo scientific155411
Corning tissue-culture treated culture dishesSigma-AldrichCLS430167
Bovine serum albuminSigma-AldrichA4503
Anti-DNP monoclonal IgESigma-AldrichD8406
DNP-HSA (Ag)Sigma-AldrichA6661 Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4Biological Inductries03-025-1B
CaCl2MERK102382
GlucoseBDH Laboratories284515V
Ammonium chlorideMERK1145
PIPES dipotassium saltSigma-Aldrich108321-27-3
Calcium acetate hydrateSigma-Aldrich114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrateSigma-AldrichM5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)Sigma-AldrichG1501
NaH2PO4MERK6346
NaClMERK106404
MgCl2MERK105833
KClMERK104936
Electroporator BTXECM830
Confocal microscope, ZeissZeissLSM 5 Pascal, Axiovert 200MUsed in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, ZeissZeissLSM 800, Axio Observer.Z1 /7Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, LeicaLeicaSP5Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cellsRBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

Referências

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