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요약

여기 우리는 규제 exocytosis의 라이브 셀 이미징 방법 선발. 이 메서드는 기자로 서 FITC-dextran, 리소좀과 관련 된 세포에 축적을 활용 합니다. 이 간단한 메서드는 또한 유전자 조작 하기 어려운 셀에 규제 exocytosis의 다른 모드 사이 구별 수 있습니다.

초록

규제 exocytosis는 화물 분 비과 립 (SGs)에 저장 되어 있는 분 비 방 아 쇠에 대 한 응답에 출시 하는 과정 이다. 규제 exocytosis 세포 커뮤니케이션에 대 한 기본 이며 신경 전달 물질, 호르몬, 염증 중재자 및 세포의 다양 한 다른 화합물의 분 비에 대 한 핵심 메커니즘입니다. 적어도 세 가지 메커니즘 규제 exocytosis 알려져 있다: 전체 exocytosis, 단일 SG 키스 실행 exocytosis, 어디 하나의 SG는 뚜렷이 플라즈마 막으로 퓨즈, 그리고 복합 exocytosis, 플라즈마 막으로 완전히 퓨즈 어디 이전에 또는 플라즈마 막으로 SG 퓨전 후 여러 SGs 서로 융합. 셀에 의해 착수 하는 규제 exocytosis 유형의 자주 분 비 트리거 유형에 의해 결정 됩니다. 그러나, 많은 셀에 단일 분 비 트리거를 활성화할 수 있다 규제 exocytosis의 다중 모드 동시에. 그들의 풍요로 움과 세포 유형 및 종 중요성에도 불구 하 고 분 비의 다른 모드를 결정 하는 메커니즘 크게 확인 되지 않습니다. 규제 exocytosis의 다른 모드를 조사 하 고 있는 주요 과제 중 하나입니다 뿐만 아니라 그들을 별도로 탐험으로 그들 사이 구별에 어려움. 여기 우리가 fluorescein isothiocyanate (FITC)를 사용 하 여 설명-dextran exocytosis 기자 및 라이브 셀 이미징, 규제 exocytosis, 복합 exocytosis에 초점의 다른 경로 구분 하는 견고성에 따라 고 exocytic 이벤트의 기간입니다.

서문

규제 exocytosis를 쉽게 만든된 화물 특정 트리거에 분 비 세포에서 출시 하는 기본 메커니즘입니다. 화물은 미리 형성 하 고 그것까지 트리거 릴레이 SGs의 콘텐츠의 출시에 대 한 신호 저장 되어 있는 분 비 소포에 압수. 다양 한 유형의 신호 규제 exocytosis의 다른 모드에서 발생할 수 있습니다 또는 다른 형태의 규제 exocytosis 동시에 발생할 수 있습니다. 규제 exocytosis의 세 가지 주요 모드 알려져 있습니다: 전체 exocytosis, 원형질 막;와 단일 분 비과 립의 완전 융합을 포함 키스 실행 exocytosis, 재활용; 다음 플라즈마 막으로 분 비과 립의 과도 융합을 포함 그리고 여러 SGs 이전 (즉, multigranular exocytosis)의 homotypic 융합이 특징인 복합 exocytosis 순차적 또는 (즉, 순차 exocytosis) 플라즈마 멤브레인1퓨전 하. 복합 exocytosis 간주 됩니다 화물 릴리스2의 가장 광범위 한 모드는 SGs에서를 포함 하 여 화물의 빠른 분 비에 대 한 수 플라즈마 멤브레인에서 원심. 모두 외 분 비 및 내 분 비 세포3,,45,6,7,8,9에서 복합 exocytosis 문서화 되었습니다. 면역 세포입니다. 면역 세포, 호 산 구는10,,1112 및 호 중구13, 같은 복합 exocytosis 수 같은 침입 병원 체를 죽 일 하는 데 필요한 중재자의 신속 하 고 강력한 출시 박테리아 또는 기생충입니다. 타고 난 면역 반응, 알레르기, 및 다른 알레르기 반응14,,1516 미리 저장 된 염증 성 중재자의 효율적인 릴리스에 대 한 복합 exocytosis를 배포 하는 돛대 세포 (MCs) , 17. exocytosis의 다양 한 모드로18,19를 동시에 발생할 수 있습니다, 이후 그것은 실시간으로 그들을 구별 하거나 그들의 각각 융합 기계, 따라서 elucidating 식별 도전 되고있다 그들의 기본 메커니즘입니다.

여기에 우리가 메서드를 기반으로 현재 라이브 셀에 셀의 이미지 로드 FITC-dextran, exocytic 이벤트의 실시간 추적 및 그들의 다른 모드를 구별 하는. 특히, 우리의 메서드 복합 exocytosis의 독점 모니터링 수 있습니다.

FITC dextran 글 루 칸 다 당 류 dextran와 pH에 민감한 fluorophore FITC 켤레입니다. 붙일 레이블된 dextrans micropinocytosis20,21 , macropinocytosis,2223여 셀 입력 표시 되었습니다. Endocytic 구획 리소좀으로 성숙, 그것은 보였다 FITC dextran 명백한 저하 없이 리소좀 축적. 그러나, FITC는 높은 pH에 민감한 fluorophore24리소좀 루멘은 산 성 때문에, FITC dextran 형광 리소좀24를 도달 하는 즉시 냉각. 따라서, 화물, FITC의 pH 감도 함께 찍은 대상 리소좀으로 dextrans를 설립, 리소좀 exocytosis25,,2627 의 연구에 FITC dextran의 사용을 위한 기초 마련 , 28 , 29.

MCs, 호 중구, 호 산 구는, 세포 독성 T 세포, melanosomes, 및 다른 사람을 포함 한 여러 세포 유형, SGs lysosomal 기능을 표시 하 고 리소좀 관련 세포 (LROs) 또는 분 비 리소좀30,31로 분류 됩니다. . LROs 산 성 luminal pH 때문에, FITC dextran 높은 pH는 LROs의 exteriorization와 관련 된 결과로 그들의 exocytosis 시각화를 사용할 수 있습니다. 실제로, FITC dextran MCs18,,3233exocytosis를 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 이 방법에서는, FITC dextran 세포 배양에 추가, pinocytosis 하 여 셀에 의해 촬영 이며 SGs에 정렬. 그것은 리소좀 때 그들이 셀 내에 SGs에 FITC 형광 침묵 이다. 그러나, 플라즈마 멤브레인 및 외부 환경에 따른 노출 SG 퓨전, 따라 FITC dextran 차릴 SG pH 상승으로 그것의 형광 라이브 셀 현미경 검사 법에 의해 exocytic 이벤트의 간단한 추적 허용. 여기, 우리는 복합 exocytosis의 고유 추적을 사용 하도록이 메서드를 조정.

다른 두 가지 방법은 이전 복합 exocytosis를 추적 하기 위해 사용 되었습니다. 전자 현미경은 exocytosis의 다른 모드의 발생을 제안 하는 exocytic 구조를 특성화 하기 위해 첫 번째 방법입니다. 특히, "분 비 터널" 췌 장 acinar 셀34 에 MCs35,,3637 의 복합 exocytosis의 가설에 상승을 했다. 그러나, 전자 현미경 검사 법의 높은 해상도 융합된 소포를 공개 하는 힘, 그것은 그들의 융해의 역학을 추적할 수 없습니다. 및 따라서 복합 exocytosis 동안 SG 퓨전 또는 다시 캡처한 알갱이의 융합에 대응 여부를 정의할 수 없습니다. 다음 그들의 endocytosis. 살아있는 세포, 원형질 막 커패시턴스11,13,,3839 또는 amperometry의 패치 클램프 측정 등에서 exocytosis를 측정할 수 있는 다른 방법에이 장애물을 극복 미디어의 40 . 그러나, 패치 죄는 특별 한 설정 필요 하며 모든 세포 유형에 적합 하지 않을 수 있습니다. Amperometry 측정 exocytosis 화물 전극에 매우 가까이에 출시 하는 경우에 추적할 수 있습니다. 따라서, 그것은 뿐만 아니라 허용 exocytosis의 실시간 추적 하지만 그것 또한 모든 셀에서 데이터의 신속 하 고 간단한 수집 수 있습니다 이러한 방법을 통해 이점을 제공 라이브 셀 이미징 사용 하 여 합니다.

라이브 셀 현미경 검사 법에 의해 FITC dextran의 추적 또한 몇 가지 장점을 다른 라이브 셀 이미징 기반 방법을 제공합니다. 예를 들어 널리 사용 되는 방법은 세포 형광 SG 프로브 로드 또는 표현 하는 형광 단백질 태그 SG 화물 또는 막 단백질26,41, 의 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)는 42 , 43.이 방법의 강점 독점적으로 (여기 라고도 발자국), 원형질 막 가까이 발생 하는 이벤트를 모니터링 하는 기능에 따라서 exocytic 이벤트. 그러나, 이것은 또한이 방법의 단점은 셀 일부분만 하는 coverglass에 인접 한 현미경 렌즈에 가까운 수44군데 있기 때문에. 같은 발자국 실제로 전체 세포 막 표면 표시 하는지 여부를 여전히 미해결45,,4647이다. 이와 관련, 오픈 pinhole와 FITC dextran 등 pH에 민감한 염료 및 표준 형광 현미경 confocal 현미경을 사용 하 여 따라서 해당 셀에 발생 하는 총 exocytic 이벤트를 캡처, 전체 셀의 이미지를 수 있습니다.

전체 셀 이미징 또는 TIRFM 규제 exocytosis를 공부 하는 데 사용 되는 추가 pH에 민감한 기자 SG 화물 또는 SG 막 단백질 phlourin, pH에 민감한 GFP 변종 융합을 포함 합니다. 예로 NPY-phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin, 및 synapto phluorin48,49,50,,5152있습니다. 이러한 프로브 식 SGs의 내 생 적인 구성을 더 밀접 하 게 나타낼 수, 그것은 세포의 transfection를 수반 고 따라서 덜 어려운 transfect 세포에 적합 있을 수 있습니다. 따라서 때 세포 공부 transfect 어렵다 또는 여러 게놈 조작이 필요로 하는 실험 조건에서 세포 배양의 FITC-dextran 등으로 간단 하 게 보완 될 수 있습니다 화합물의 사용이 유리 . FITC dextran 또한 제공 하는 이점을 acridine 오렌지 (AO), 라이브 셀 현미경53,54,,5556 여 exocytosis의 추적을 위해 사용 된 또 다른 pH에 민감한 염료 , 57 , 58. 아오 소포 실제 분 비와 일치 하지 않는 거짓 플래시에서 결과27처리의 photolysis를 유도 하기 위해 표시 되었습니다. 반면, FITC dextran 반응성 산소27의 그것의 낮은 사진 유도 된 생산 때문에 아마 더 나은 분 비 이벤트를 반영합니다.

특히, exocytosis 공부에 대 한 다른 접근 방법이입니다 융합 기 공이 과정을 통해 SG에 외부 매체에서 염료의 유입에 추적. 이 경우에 염료 분 비 트리거 함께 외부 매체에 추가 됩니다. 다음, 융합 기 공이 열리면 염료 SG59,60으로 확산. 이 방법의 명확한 이점은 이다 그것 또한 가변 크기의 염료의 사용에 의해 융합 기 공 크기를 예측 하는 기능을 제공 합니다. 예를 들어 서로 다른 분자량 (MW), 다른 fluorophores에 활용 된의 dextrans SG를 관통할 수 있다 dextran의 최대 크기 것 융합 공59, 의 크기에 해당 하는 그것에 의하여 extracellular 염료로 사용할 수 있습니다. 61 , 62 , 63 , 64. 또한,이 방법은 pH에 민감한 프로브를 사용 하 여 필요 하지 않습니다. 그러나, 중요 한 불리가 이다 신호 대 잡음 비는 매우 낮은 이기 때문에 많은 양의 염료는 미디어에 높은 백그라운드에서 발생 하는 이미지의 중.

전반적으로, exocytosis 마커로 FITC dextran 사용 신호 소음 비율, 독성, 동적 추적 및 복잡성 등 이전에 보고 된 방법에 몇 가지 단점을 극복 했다.

여기 우리는 FITC-dextran (여기 라고도 RBL, Eccleston 외 에 의해 주로 설립 RBL-2 H 3 돛대 세포 라인에 복합 exocytosis 모니터의 사용 설명 65 Barsumian 그 외 여러분 에 의해 복제 추가 66)에 면역 글로불린 E (IgE) / 항 원 (Ag) 활성화.

프로토콜

1입니다. 준비

  1. RBL 문화 미디어의 준비
    1. 낮은 포도 당 Dulbecco의의 믹스 500 mL 페니실린-스-nystatin 솔루션, L-글루타민 200 m m 솔루션의 5.5 mL의 5.5 mL 소 태아 혈 청 (FBS)의 56 mL와이 글의 중간 (DMEM)를 수정합니다. 낮은 포도 당에서이 결과 DMEM와 10 %FBS, 100 µ g/mL 스, 100 단위/mL 페니실린, 12 단위/mL nystatin, 2 mM L-글루타민 보충.
    2. 4 ° c.에 0.22 μ m 기 공 크기 및 저장소의 최고 진공 필터를 사용 하 여 미디어를 필터링
  2. RBL 세포의 유지 보수입니다.
    1. 10 cm 접시에 90%의 최대 confluency RBL 세포 성장. 건강 한 세포 배양의 경우 셀 가끔 돌출 된 스핀 들 모양이 있어야 합니다.
    2. 셀 분할 분리 접시에서 셀 미디어를 발음 하 고 37 ° c.에 5% CO2 의 습도 분위기에서 5-10 분에 대 한 trypsine/EDTA 솔루션 B. 품 2 mL와 함께 교체
    3. 셀을 분리 했으면 일단 한 피 펫을 사용 하 여 문화 미디어의 2 개 mL를 추가 하 여는 트립 신을 중화 하 고 1:2-1 셀 분할: 10 비율.
  3. Tyrode의 버퍼 x 20의 준비
    1. X 54 m m KCl의 솔루션, 20 mM MgCl2, 2.74 M NaCl, 두 배 증류수 (DDW)에서 8 밀리미터 NaH2포4 주식 20를 준비 합니다. 잘 혼합 하 고 4 ° c.에 저장

2. 라이브 셀입니다 RBL 세포의 문화

  1. FITC dextran 솔루션의 준비입니다.
    1. 문화 미디어 (1.1.1 단계 참조)의 1 mL 당 FITC dextran 가루 (150 K) 1 mg을 혼합. 전체 연 발된 coverglass 3 mL 준비.
    2. 0.22 μ m 기 공 크기와 셀 루 로스 아세테이트 주사기 필터 단위를 사용 하 여, 녹아 FITC dextran 필터링.
    3. 1 µ g/mL의 농도를 마우스 IgE를 추가 합니다.
  2. 이미징에 대 한 시드 RBL 셀
    1. 이미징, 전날 문화 접시에서 미디어를 발음 하 고 37 ° c.에 5% CO2 의 습도 분위기에서 5-10 분에 대 한 trypsine/EDTA 솔루션 B. 품의 2 개 mL를 바꿉니다 셀을 분리 했으면 일단 문화 미디어의 2 개 mL를 추가 하 여는 트립 신을 중화.
    2. 수 RBL 세포는 hemocytometer를 사용 하 여 볼륨을 조정 따라 105/mL x 7.5의 세포 농도를 문화 미디어.
    3. 10 µ L 연 발된 coverglass 미리 가득 신선한 FITC-dextran을 세포 현 탁 액의 보충 (7.5 x 103 셀 챔버에 시드 결과) 문화 미디어를 추가 합니다.
    4. 37 ° c.에 5% CO2 의 humified 분위기에서 하룻밤 RBL 세포 성장 셀 셀 구분 되 고 쉽게 현미경 개별적으로 각 셀을 식별할 수 있는지 확인 하기 위해 하위 confluent 수준에 있어야 합니다.
  3. Transfection RBL 세포-옵션 의입니다.
    1. 함께 다른 붙일 태그가 단백질 exocytic 이벤트 영상, transfection 프로토콜 RBL 셀 Azouz 그 외 여러분 에 대 한 참조 67

3. 라이브 셀 Exocytosis의 현미경 검사 법

  1. 솔루션의 준비:
    1. 1시 20분에서 DDW에서 재고 솔루션을 diluting 하 여 최종 Tyrode의 버퍼 솔루션 준비 희석 및 20 mM Hepes ph 7, 1.8 m m CaCl2, BSA, 1 mg/mL 및 5.6 m m 포도 당 보충.
    2. Tyrode의 버퍼에 20 x 간접적인 시 갓 준비 [1 µ g/mL dinitrophenyl 인간 혈 청 알 부 민을 활용 (DNP-은 (Ag)) 50 ng/mL 1 배 농도 대 한 우리의 경우에].
    3. Tyrode의 버퍼에 분말을 용 해 하 여 400 m m 염화 암모늄 솔루션을 준비 합니다.
  2. 셀의 준비입니다.
    1. 상공에서 미디어를 발음 하 고 37 ° c prewarmed Tyrode의 버퍼의 300 µ L로 그것을 채우는 여 연 발된 coverglass 3 번 씻어 마지막으로, Tyrode의 버퍼, 37 ° c.에 prewarmed의 300 µ L와 챔버를 보충
    2. 현미경의 보육 실에서 연 발된 coverglass를 놓습니다. 챔버는 안정 다는 것을 확인 하십시오.
  3. 현미경을 설정
    1. 추적에 대 한 관심의 영역을 선택 하려면 형광 광원 (전통적으로 수은 램프) 설정 하 고 적절 한 형광 필터 선택 (FITC dextran을 보기 위한 녹색 fluorophores에 대 한 필터를 선택). 일단 관심 영역 초점 보기의 필드는가 사진-표백 및 독성을 피하기 위하여 광원을 해제.
      참고: 일부 셀에 FITC dextran의 형광을 유지 수 있습니다. 이 때문에 FITC dextran endosomes 같은 비 lysosomal 구획에도 정렬할 수 있습니다.
    2. FITC 여기에 대 한 적절 한 조명 설정. 레이저 기반 현미경을 사용 하는 경우 488 nm 레이저를 켭니다. 방출 주위 수집 해야 500-550 nm (510-520 nm에서 FITC 방출 봉우리).
    3. Confocal 현미경을 사용 하는 경우 최대에 작은 구멍을 엽니다. 이 표백 피하기 위해 저전력 레이저 및 독성을 사용 하 고 셀의 모든 비행기에서 exocytosis 이벤트 캡처를 보장 합니다.
    4. 보정 이미지 인수 사이의 시간 간격.
      1. 다른 세포는 규제 exocytosis68의 그들의 활동에서 달라질 수 있습니다. 복합 exocytosis의 특정 이미지에 대 한 시간 간격을 5 초 이상 하는 것이 좋습니다. 그러나, 엄지손가락의 규칙으로 서 빠른 이미징 있도록 확인 단일 프레임의 획득 시간 빠릅니다.
      2. 레이저 검사 confocal 현미경을 사용할 때 스캔 방향을 양방향으로 설정, 평균, 수 없고 512 x 512에서 해상도 설정 (권장, 후자의 두 조항 또한 표백 및 독성을 최소화 하기 위해 도움이 될 것입니다).
  4. Exocytosis의 이미지입니다.
    1. 이미지 셀의 셀 또는 간접적인 유형에 따라 원하는 기간에 대 한. RBL 세포 IgE/Ag와 발생, 대부분의 exocytic 이벤트 활성화의 15-20 분 이내 발생.
    2. 세포의 활성화, 대 한 상공 회의소 간접적인 솔루션 x 20에서 16 µ L을 추가 합니다.
  5. 셀에 FITC dextran 존재 확인.
    1. 존재와 FITC-dextran SGs에의 지역화를 확인 하려면 추가 염화 암모늄 솔루션의 16 µ L (초점을 잃게 하기에서 챔버를 이동 하지 않도록 주의 수) 챔버를 부드럽게 (이 20 m m의 최종 농도 만들 것입니다). 이 SGs의 자율 및 초 이내 발생 합니다 FITC 형광의 dequenching을 유발 한다.

결과

그림 1a 는 개요로 exocytosis를 규제 하 고 exocytic 이벤트의 다양 한 모드를 정리 FITC dextran 기자로 서 행동 수 있습니다 얼마나 나타냅니다. 첫째, 세포 FITC-dextran, pinocytosis에 의해 내 면 고 SGs 정렬와 함께 알을 품는. MCs의 SGs LROs 이기 때문에, 그들의 낮은 pH FITC, 그림과 같이 검은 알갱이의 형광을 따 윈 (A-C, 난). 세포는 간접적인 및 플라즈마 막으로 SGs ?...

토론

여기 어떻게 추적 FITC-dextran SGs에 로드의 형광 특히 복합 exocytosis 이벤트를 캡처하는 데 사용할 수 있습니다 설명 합니다. 이 인수는 이미지 15 초 마다 현미경을 설정, 따라서 시간이 지남에, 오랫동안 이벤트만 기록 됩니다 하 고 따라서 짧은 것이 해당 하는 이벤트 전체 exocytosis 또는 키스 실행 exocytosis를 제외 하 여 달성 되었다. 메서드를 설정 하려면 우리는 RBL 세포에 표현 되 고 복합 exocytosis 중...

공개

저자 선언 경쟁 금융 관심

감사의 말

CDNA의 관대 한 선물에 감사 박사 미 Ashery 하 고. 우리 박사 G. 질량, L. Mittleman, M. Shaharbani, 및 Y.Zilberstein Sackler 세포질 & 분자 영상 센터에서 현미경으로 그들의 귀중 한 도움에 대 한 감사. 이 미국-이스라엘 Binational 과학 재단 (그랜트 2013263 R. Sagi-아이젠 버그, I. Hammel, 및 S.J.Galli)에 의해 지원 되었다 일과 933/15 이스라엘 아카데미 과학 (R.Sagi-아이젠 버그에 의해 설립 된 이스라엘 과학 재단에서 부여 )와 NIH 교부 U19 AI 104209 및 R01 AR067145 (하 스 Galli).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM low glucoseBiological Inductries01-050-1A
Fetal bovine serumGibco12657
Pen-strep-nystatin solutionBiological Inductries03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution Biological Inductries03-020-1A
FITC dextran 150KSigma-Aldrich46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution BBiological Inductries03-052-1AWarm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size Sigma-AldrichCLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore sizeSartorius16534K
Chambered coverglass Thermo scientific155411
Corning tissue-culture treated culture dishesSigma-AldrichCLS430167
Bovine serum albuminSigma-AldrichA4503
Anti-DNP monoclonal IgESigma-AldrichD8406
DNP-HSA (Ag)Sigma-AldrichA6661 Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4Biological Inductries03-025-1B
CaCl2MERK102382
GlucoseBDH Laboratories284515V
Ammonium chlorideMERK1145
PIPES dipotassium saltSigma-Aldrich108321-27-3
Calcium acetate hydrateSigma-Aldrich114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrateSigma-AldrichM5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)Sigma-AldrichG1501
NaH2PO4MERK6346
NaClMERK106404
MgCl2MERK105833
KClMERK104936
Electroporator BTXECM830
Confocal microscope, ZeissZeissLSM 5 Pascal, Axiovert 200MUsed in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, ZeissZeissLSM 800, Axio Observer.Z1 /7Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, LeicaLeicaSP5Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cellsRBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

참고문헌

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